專利名稱：谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法及檢測用固相萃取柱的制作方法
谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法及檢測用固相萃取柱技術領域
本發(fā)明屬于色譜分析技術領域，具體涉及一種谷物中有毒有害化學物質的色譜分析檢測方法及檢測用固相萃取柱(SPE小柱)。
背景技術：
單端孢霉烯族化合物廣泛存在于多種谷物及其制品中，例如比較典型的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)與雪腐鐮刀菌烯醇(nivalenol，N1V)，這兩種物質是由鐮刀菌產(chǎn)生的一類次級代謝產(chǎn)物。DON又稱嘔吐毒素，人和動物在食用被該毒素污染的食品或飼料后可產(chǎn)生廣泛的毒性效應，常引起嘔吐、頭痛、發(fā)熱和惡心。1998年，國際癌癥研究機構(IARC)公布的評估報告中，DON被列為第3類致癌物。近年來研究表明，DON與人類食管癌、IgA腎病、胃癌、骨關節(jié)病等有關。NIV具有與DON相似的毒性，雖然其污染率與毒性相對較低，但也廣泛存在于多種農(nóng)作物中，危害性不容忽視。D0N、NIV不僅污染糧食谷物，也可污染糧食制品，因其在世界范圍內具有較高的污染率而引起人們的普遍關注，各國都制定了嚴格的限量標準，我國谷物中DON的限量標準為1. 0mg/kg。
目前，谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的測定方法有薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、氣相色譜(GC-ECD)、氣質聯(lián)用(GC-MS)和高效液相色譜法(HPLC)、液質聯(lián)用(HPLC-MS)等，其中GC-ECD、GC-MS和HPLC-MS等方法被認為是檢測此類毒素高靈敏度的方法，但GC-MS和HPLC-MS的檢測用儀器昂貴。此外，在現(xiàn)有國內外文獻有關單端孢霉烯族毒素化合物的檢測報道中，樣品的提取、凈化步驟也較為繁瑣，需要用到大量的有毒有害性有機試劑(如三氯甲烷、乙醚、石油醚等)，而且現(xiàn)有的檢測方法往往還需要用到Mycosep多功能凈化柱、Sep-Pak、Florisil柱等費用較為昂貴的SPE凈化小柱，現(xiàn)有的檢測方法不僅容易對環(huán)境造成污染，而且增加了檢測成本和檢測費用。發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種結構簡單、成本低、低碳環(huán)保的用于檢測谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的固相萃取柱，還提供一種檢測步驟簡單、檢測精度高、檢測成本低的谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法。
為解決上述技術問題，本發(fā)明提出的技術方案為一種用于檢測谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的固相萃取柱，所述固相萃取柱的本體包括一過濾管，該過濾管的頂端開口且底端開有濾孔，過濾管管底墊有濾紙，濾紙上填充有玻璃纖維，玻璃纖維上裝填有萃取劑，萃取劑上覆蓋有玻璃纖維；所述萃取劑主要由質量比為9 (1.5 2.5) (5.0 6.0) 的氧化鋁、活性碳粉和二氧化硅組成。
上述本發(fā)明的技術方案中，所述單端孢霉烯族毒素化合物優(yōu)選包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和/或雪腐鐮刀菌烯醇。
上述本發(fā)明的技術方案中，所述過濾管優(yōu)選采用注射針管。
作為一個總的技術構思，本發(fā)明還提供一種谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法，包括以下步驟(1)提取利用乙腈水溶液對待測試樣進行提取得提取液，所述乙腈水溶液中乙腈的體積分數(shù)為80% 90% ；(2)過柱將步驟(1)中的提取液過權利要求1所述的固相萃取柱，將過柱后的濾液在 45°C下氮吹濃縮至干得樣品殘渣；(3)衍生將準備好的衍生劑加入步驟(2)后的樣品殘渣中，渦旋振搖后室溫下反應 12min 20 min，再加入正己烷渦旋混勻，加水劇烈振蕩，靜置分層后取上層溶液用無水硫酸鈉脫水，上氣相色譜儀分析；(4)測定根據(jù)氣相色譜分析測得的峰面積和已經(jīng)繪制好的標準曲線定出待測試樣中單端孢霉烯族毒素化合物的含量n，最后根據(jù)待測試樣的稀釋倍數(shù)F即可換算出實際谷物樣品中單端孢霉烯族毒素化合物的含量N。
上述的谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法，所述單端孢霉烯族毒素化合物優(yōu)選包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和/或雪腐鐮刀菌烯醇。
上述的谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法中，優(yōu)選的，所述衍生劑(TBT) 主要是由體積比為3 3 2的三甲基硅烷咪唑(TMSI)、N，0 —雙三甲基硅基乙酰胺(BSA) 和三甲基氯硅烷(TMCS)組成。
上述的谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法中，所述氣相色譜儀的工作參數(shù)優(yōu)選為檢測器溫度為250°c 300°C，進樣口溫度為230°C ^0°C，載氣為高純氮氣，載氣流速為1. 0 mL/min 2. 5 mL/min，分流比為(1 10) 1，電流為1. OnA，尾吹氣流量為 40mL/mino
與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于(1)本發(fā)明檢測用的固相萃取柱結構簡單、制作方便、成本低；(2)本發(fā)明檢測方法的整個預處理過程只用到一種有機試劑(即乙腈)，具有低碳環(huán)保的顯著特點；(3)本發(fā)明的檢測步驟更加簡潔，實驗成本低廉，有利于推廣和應用；(4)本發(fā)明檢測方法的檢測精度高，取得了很好的檢測效果。


圖1為本發(fā)明實施例中未經(jīng)固相萃取柱凈化的樣品分析色譜圖。
圖2為本發(fā)明實施例中經(jīng)固相萃取柱凈化后的樣品分析色譜圖。
圖3為本發(fā)明實施例中DON含量分別為0. 2 μ g/mL、0. 4 μ g/mL、1. 0 μ g/mL、 1. 4μ g/mL、2. 0μ g/mL時繪制的標準工作曲線。
圖4為本發(fā)明實施例中NIV含量分別為0. 2yg/mL、0. 4yg/mL、1.0yg/mL、 1. 4 μ g/mL、2. 0 μ g/mL時繪制的標準工作曲線。
圖5為本發(fā)明實施例中小麥樣品一檢測出的色譜圖。
圖6為本發(fā)明實施例中小麥樣品二檢測出的色譜圖。
圖7為本發(fā)明實施例中小麥樣品三檢測出的色譜圖。
圖8為本發(fā)明實施例中的固相萃取柱的結構示意圖(剖視)。
圖例說明1、注射器針管；2、注射孔；3、濾紙片；4、玻璃纖維；5、萃取劑。
具體實施方式
以下結合說明書附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步描述。
實施例一種如圖8所示的本發(fā)明的用于檢測谷物中單端孢霉烯族毒素化合物(尤其是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇)的固相萃取柱(SPE小柱)，本實施例是利用5mL無菌塑料注射器針管自制固相萃取柱，該固相萃取柱的本體包括一注射器針管1，該注射器針管1的頂端開口且底端設有注射孔2作為濾孔，注射器針管1管底墊有大小適合的濾紙片3，濾紙片3上填充有玻璃纖維4 (本實施例選用石英棉)，玻璃纖維4上裝填有1. 60g混合均勻的萃取劑5，萃取劑5上再覆蓋一層玻璃纖維4，用玻璃棒將以上填充物壓實，自制SPE小柱制作完成。萃取劑5主要由質量比為9 2 5. 5的氧化鋁、活性碳粉和二氧化硅組成。
本發(fā)明實施例中未經(jīng)固相萃取柱凈化的樣品分析色譜圖和經(jīng)固相萃取柱凈化后的樣品分析色譜圖(采用的氣相色譜儀為島津GC-2010，具63M電子捕獲檢測器)分別見圖 1、圖2。由圖1和圖2可知，圖2中色譜圖的雜質峰明顯少于圖1，這表明本發(fā)明的固相萃取柱基本去除了雜質峰的干擾，達到了較好的凈化效果。
一種谷物中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、雪腐鐮刀菌烯醇的檢測方法，包括以下步驟(1)提取分別稱取5.Og混合均勻的三種小麥樣品(分別標明樣品一、樣品二和樣品三)于IOOmL具塞三角瓶中，然后加入乙腈水溶液(乙腈與水的體積比為84 16)40mL，蓋好瓶塞振搖30min，過濾，過濾后的提取液在_20°C保存?zhèn)溆茫?2)過柱取步驟(1)中的提取液5mL以上過本實施例中自制的SPE小柱，濾液用IOmL 玻璃刻度離心管接收，然后用2mL上述的乙腈水溶液淋洗SPE小柱并將此濾液一并收集，將過柱后的濾液在45°C下氮吹濃縮至干得樣品殘渣；(3)衍生將100μ L衍生劑加入步驟(2)后的樣品殘渣中，衍生劑主要是由體積比為 3:3: 2的三甲基硅烷咪唑、N，0—雙三甲基硅基乙酰胺和三甲基氯硅烷組成，快速渦旋振搖lmin，室溫下反應15min，再加入500 μ L正己烷渦旋混勻30s，再加入ImL劇烈振蕩 2min，靜置分層后取上層溶液用無水硫酸鈉脫水，上氣相色譜儀分析(同上)，進樣量IyL;色譜柱RTX-5MS彈性石英毛細管柱(15mX0. 25mm id，液膜厚度0. 25 μ m)，ECD檢測器溫度為300°C，進樣口溫度為250°C ；柱箱程序升溫初始溫度120°C，維持2min，以20°C / min升溫到160°C后維持2min，再以15°C /min升溫到240°C后維持IOmin ；載氣為高純氮氣(純度99. 999%)，載氣流速為2. OmL/min,分流比為5:1，電流為1. OnA,尾吹氣流量為 40mL/min ；(4)繪制標準曲線準備吸取一定量的標準溶液，與上述待測樣品同時衍生化，用作氣相色譜測定時標準溶液中待測物質(DON、NIV)的含量分別為0. 2μ g/mL、0. 4μ g/mL、 1. 0μ g/mL、l. 4μ g/mL、2. 0μ g/mL，以分別測得的峰面積作為縱坐標，以標準溶液中待測物質的含量作為橫坐標繪制出標準曲線如圖3、圖4所示，由圖3和圖4可見，DON、NIV在 0. 2 μ g/mL 2. 0 μ g/mL濃度范圍內線性關系良好，相關系數(shù)分別為0. 9994和0. 9991 ；(5)測定根據(jù)氣相色譜分析測得的峰面積(樣品一、二、三測得的色譜圖分別如圖5 圖7所示)和已經(jīng)繪制好的標準曲線定出待測試樣中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇或雪腐鐮刀菌烯醇的含量n，最后根據(jù)待測試樣的稀釋倍數(shù)F即可換算出實際谷物樣品中雪腐鐮刀菌烯醇或雪腐鐮刀菌烯醇的含量N，換算公式為N = nXFX1000/m (m為待測試樣的質量，即5. Og)。
由圖5可見，本實施例的小麥樣品一中D0N、NIV兩種毒素均有檢出，檢出值分別為 526. 3μ g/kg、106. 83 μ g/kg，由圖6可見，本實施例的小麥樣品二中僅有DON這一種毒素檢出，檢出值為318. 5μ g/kg，由圖7可見，本實施例的小麥樣品三中DON、NIV兩種毒素均未檢測出。
回收率試驗當小麥粉中DON、NIV的添加量在0. lmg/kg 1. 0 mg/kg時，兩者的五次重復試驗回收率分別為92. 6% 97. 6%和90. 9% 93. 3%，方法的精密度小于6%，檢出限為0. 01mg/kg。通過回收率試驗和精密度試驗證明本發(fā)明的方法準確可靠。
權利要求
1.一種用于檢測谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的固相萃取柱，其特征在于所述固相萃取柱的本體包括一過濾管，該過濾管的頂端開口且底端開有濾孔，過濾管管底墊有濾紙，濾紙上填充有玻璃纖維，玻璃纖維上裝填有萃取劑，萃取劑上覆蓋有玻璃纖維；所述萃取劑主要由質量比為9 (1.5 2. 5) (5.0 6.0)的氧化鋁、活性碳粉和二氧化硅組成。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于檢測谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的固相萃取柱， 其特征在于所述單端孢霉烯族毒素化合物包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和/或雪腐鐮刀菌烯
3.根據(jù)權利要求1或2所述的用于檢測谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的固相萃取柱，其特征在于所述過濾管為注射針管。
4.一種谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法，包括以下步驟(1)提取利用乙腈水溶液對待測試樣進行提取得提取液，所述乙腈水溶液中乙腈的體積分數(shù)為80% 90% ；(2)過柱將步驟(1)中的提取液過權利要求1所述的固相萃取柱，將過柱后的濾液在 45°C下氮吹濃縮至干得樣品殘渣；(3)衍生將準備好的衍生劑加入步驟(2)后的樣品殘渣中，渦旋振搖后室溫下反應 12min 20 min，再加入正己烷渦旋混勻，加水劇烈振蕩，靜置分層后取上層溶液用無水硫酸鈉脫水，上氣相色譜儀分析；(4)測定根據(jù)氣相色譜分析測得的峰面積和已經(jīng)繪制好的標準曲線定出待測試樣中單端孢霉烯族毒素化合物的含量n，最后根據(jù)待測試樣的稀釋倍數(shù)F即可換算出實際谷物樣品中單端孢霉烯族毒素化合物的含量N。
5.根據(jù)權利要求4所述的谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法，其特征在于 所述單端孢霉烯族毒素化合物包括脫氧雪腐鐮刀菌烯醇和/或雪腐鐮刀菌烯醇。
6.根據(jù)權利要求5所述的谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法，其特征在于 所述衍生劑主要是由體積比為3 3 2的三甲基硅烷咪唑、N，0 —雙三甲基硅基乙酰胺和三甲基氯硅烷組成。
7.根據(jù)權利要求4、5或6所述的谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法，其特征在于所述氣相色譜儀的工作參數(shù)為檢測器溫度為250°C 300°C，進樣口溫度為230°C 280°C，載氣為高純氮氣，載氣流速為1.0 mL/min 2.5 mL/min，分流比為(1 10) 1， 電流為1. OnA，尾吹氣流量為40mL/min。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種谷物中單端孢霉烯族毒素化合物的檢測方法及檢測用固相萃取柱，該固相萃取柱的本體包括一過濾管，該過濾管的頂端開口且底端開有濾孔，管底墊有濾紙，濾紙上填充有玻璃纖維及萃取劑，萃取劑主要由質量比為9∶(1.5～2.5)∶(5.0～6.0)的氧化鋁、活性碳粉和二氧化硅組成。本發(fā)明的檢測方法包括以下步驟先利用乙腈水溶液對待測試樣進行提取，然后將提取液過柱，將過柱后的濾液氮吹濃縮至干；再將衍生劑加入樣品殘渣中，振蕩、脫水后上氣相色譜儀分析；最后根據(jù)分析測得的峰面積即可換算出樣品中單端孢霉烯族毒素化合物的含量。本發(fā)明的固相萃取柱結構簡單、低碳環(huán)保，檢測方法的步驟簡單、檢測精度高、檢測成本低。
文檔編號G01N30/02GK102507805SQ201110331319
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月27日 優(yōu)先權日2011年10月27日
發(fā)明者周叢, 唐吉旺, 曾小明, 林 源, 蘇光榮, 郭海燕 申請人:湖南省產(chǎn)商品質量監(jiān)督檢驗院