專利名稱：一種檢測電離輻射劑量的生物學(xué)方法
一種檢測電離輻射劑量的生物學(xué)方法技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種輻射劑量的生物學(xué)檢測方法。
技術(shù)背景
評估電離輻射對健康的危害程度，急、慢性輻射損傷的診斷和治療等都需要了解和確定受照劑量。機(jī)體細(xì)胞、DNA、蛋白質(zhì)等在電離輻射后所發(fā)生的變化與輻射劑量之間存在著一定的劑量效應(yīng)關(guān)系，通過這些可檢測的生物學(xué)指標(biāo)可估算輻射劑量的大小。與物理檢測相比，生物劑量檢測的最大優(yōu)勢是直接反映了機(jī)體對電離輻射的反應(yīng)。
目前進(jìn)行輻射劑量的生物檢測的方法很多，常用的有通過檢測照射所引起的染色體斷片、雙著絲粒、交換或易位等指標(biāo)而提出的微核法和染色體核型分析法；通過照射后 DNA損傷而形成的彗星尾與未受損的細(xì)胞表現(xiàn)的彗星核心之間的關(guān)系來研究預(yù)測輻射劑量的單細(xì)胞凝膠電泳(彗星試驗(yàn))法。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，越來越多的分子指標(biāo)作為劑量檢測的標(biāo)識，比如電離輻射可以引起組蛋白Y-H2AX的快速磷酸化，與其特異性抗體反應(yīng)后，可形成可見的foci，Y-H2AX是迄今所研究的最重要的DNA損傷感應(yīng)分子。電離輻射誘導(dǎo)的造血細(xì)胞的損傷可導(dǎo)致細(xì)胞一些編碼標(biāo)志蛋白的基因位點(diǎn)突變從而產(chǎn)生異常的編碼蛋白或蛋白缺失。這些異?；蛉笔У牡鞍卓勺鳛閯┝勘O(jiān)測的標(biāo)識，常見的有Hb (血紅蛋白)、GPA (血型糖蛋白A)、HLA (人白細(xì)胞抗原)、TCR(T細(xì)胞抗原受體)、HPRT (次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶)等。但這些方法的共同缺點(diǎn)是存在操作復(fù)雜、主觀因素較多、檢測成本較高、只能對高劑量的放射線進(jìn)行檢測和度量等。對低劑量放射線的生物檢測和度量，目前還沒有一種準(zhǔn)確靈敏的方法。隨著核能發(fā)展及輻射技術(shù)在臨床診斷與治療和工、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用，低劑量電離輻射與人民生活中的接觸日益增多，對低劑量照射的生物學(xué)研究顯得更有現(xiàn)實(shí)意義。因此當(dāng)前迫切需要有一種使用方便、精確度高，同時(shí)能對高、低劑量的輻射進(jìn)行生物檢測的方法。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種使用方便、精確度高，同時(shí)能對高、低劑量的輻射進(jìn)行生物檢測的方法。
本發(fā)明基于以下原理細(xì)胞周期是連續(xù)分裂的細(xì)胞從上一次有絲分裂結(jié)束到下一次有絲分裂完成所經(jīng)歷的這一連續(xù)過程，包含Gl期、S期、G2期、M期四個階段。輻射可以干擾正常的細(xì)胞周期，低劑量輻射可能加快細(xì)胞周期，使整個細(xì)胞周期的時(shí)間縮短；相反， 高劑量輻射可以引起細(xì)胞周期延長，使整個細(xì)胞周期的時(shí)間延長甚至阻滯；藥物松胞素B 可以阻滯細(xì)胞的整體分裂而不阻滯細(xì)胞核的分裂。這樣受到不同劑量照射的細(xì)胞經(jīng)松胞素 B處理后所形成雙核細(xì)胞的數(shù)目就和照射劑量密切相關(guān)。
本發(fā)明提供的輻射劑量的生物學(xué)檢測方法，具體步驟如下1、取輻射敏感性細(xì)胞株，分為低劑量和高劑量照射組，照射劑量小于IOcGy的為低劑量照射組，照射劑量大于40cGy為高劑量照射組；2、松胞素B處理照射后，立即向細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入松胞素B，終濃度為2-6yg/ml， 37 °C溫箱繼續(xù)培養(yǎng)；3、低滲處理細(xì)胞離心棄上清后，每管細(xì)胞加入5-10ml0.075M KCl混勻，室溫低滲 10-20min ；4、固定液固定采用兩步固定法，低滲后加入固定液，按質(zhì)量比，固定液低滲液=1 5-8)，滴管混勻后立即離心，棄上清每管加入5-8ml固定液固定20-30min ；所述固定液為甲醇和冰醋酸混合溶液，按質(zhì)量比為甲醇冰醋酸=7-9 1 ；5、雙核和四核細(xì)胞的判斷由于細(xì)胞受到照射后，細(xì)胞的有絲分裂會受到干擾，細(xì)胞核異型性明顯，松胞素B處理以后除產(chǎn)生正常的雙核細(xì)胞外，還會出現(xiàn)一大一小的兩個細(xì)胞核，如果小核大小超過細(xì)胞核的1/3，那么此類細(xì)胞也記為雙核細(xì)胞；對于四核細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)，所有大于3個核的細(xì)胞均記為四核細(xì)胞。每個樣品至少記數(shù)1000個細(xì)胞；6、通過統(tǒng)計(jì)細(xì)胞四核率，對低劑量輻射進(jìn)行定量，通過統(tǒng)計(jì)細(xì)胞雙核率，對高劑量輻射進(jìn)行定量。雙核率=雙核細(xì)胞數(shù)/N，四核率=四核細(xì)胞數(shù)/N。N為統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)。N不少于 1000。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明能解決現(xiàn)有輻射劑量生物檢測法的多種問題。如能夠提高劑量檢測的精確度， 已有的單細(xì)胞凝膠電泳(彗星試驗(yàn))法及染色體核型分析的操作復(fù)雜，檢測時(shí)主觀因素較多，對技術(shù)要求過高，檢測的參數(shù)很多，很難準(zhǔn)確定量；而本發(fā)明的照射后的細(xì)胞經(jīng)松胞素 B處理后細(xì)胞核數(shù)目變化的多少就能準(zhǔn)確并直觀的進(jìn)行定性和定量。其次，單細(xì)胞凝膠電泳 (彗星試驗(yàn))法及染色體核型分析等對高劑量輻射進(jìn)行定量敏感性還可以，但不能對低劑量輻射進(jìn)行定量；而本發(fā)明中照射后的細(xì)胞用松胞素B處理后細(xì)胞的四核率變化能很好的對低劑量輻射進(jìn)行定量，對于高劑量輻射細(xì)胞的雙核率可以對其進(jìn)行定量。因此，本發(fā)明借助四核率和雙核率這兩個非常直觀的指標(biāo)，可以分別對低、高劑量輻射進(jìn)行準(zhǔn)確定量。
本發(fā)明可用于高、低放射性劑量的生物檢測，是一種輻射劑量的生物學(xué)檢測的新方法。另外該技術(shù)也可用于各種藥物或毒物對細(xì)胞增殖的影響，也可以用于估算藥物或毒物劑量的大小，因此可以用于藥物或毒物的毒理學(xué)研究。
具體實(shí)施方式
1)照射條件和實(shí)驗(yàn)分組取對數(shù)生長期HMy2. CIR人B淋巴母細(xì)胞(1 X IO6細(xì)胞/ 皿)接種于60mm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24h,在室溫下對細(xì)胞施以1.6,3.2,4.8,6.4,8cGy低劑量照射或者0. 4，1,2,4,8,12，16，20Gy高劑量照射，同時(shí)設(shè)置無照射的空白組，各組設(shè)三個重復(fù)(n=3)。
2)細(xì)胞照射后，立即將細(xì)胞孵育于含3 μ g/ml松胞素B (Sigma公司)的新鮮培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)Mh。
3) 將細(xì)胞轉(zhuǎn)移入15ml離心管內(nèi)，300g離心IOmin去除培養(yǎng)液，每管細(xì)胞加入 7ml 0. 075M KCl 混勻，室溫低滲 IOmin0
4)加入Iml固定液(按質(zhì)量比計(jì)，甲醇冰醋酸9 1)預(yù)固定細(xì)胞。
5) 300g離心IOmin除去低滲液，每管加入5ml固定液固定30min。
6) 300g離心lOmin，保留約0. 5ml固定液，滴片，干燥。
7)用Giemsa染液染色30min，40倍顯微鏡觀察。
8) 數(shù)據(jù)處理根據(jù)雙核細(xì)胞數(shù)和四核細(xì)胞數(shù)分別計(jì)算細(xì)胞的雙核率和四核率， 雙核率=雙核細(xì)胞數(shù)/1000，四核率=四核細(xì)胞數(shù)/1000。1000為統(tǒng)計(jì)的細(xì)胞數(shù)。
實(shí)驗(yàn)效果在使用的0至6. 4cGy的低劑量范圍內(nèi)，受照淋巴細(xì)胞的四核率與受照劑量呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系Y4n = a+bD，相關(guān)系數(shù)為0. 957，能明顯的表現(xiàn)出輻射興奮性效應(yīng)；在0. 4 至20Gy的劑量范圍內(nèi)，受照細(xì)胞的雙核率與受照劑量之間呈二次指數(shù)衰減關(guān)系^ = exp (-aD-bD2)，相關(guān)系數(shù)為0. 978，能很好地反映輻射損傷效應(yīng)。
該新方法操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)、檢測指標(biāo)直觀、檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
權(quán)利要求
1. 一種檢測電離輻射劑量的生物學(xué)方法，其特征在于具體步驟如下(1)、取輻射敏感性細(xì)胞株，分為低劑量和高劑量照射組，照射劑量小于IOcGy的為低劑量照射組，照射劑量大于40cGy為高劑量照射組；(2)、松胞素B處理照射后，立即向細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)加入松胞素B，終濃度為2-6yg/ml， 37 °C溫箱繼續(xù)培養(yǎng)；(3)、低滲處理細(xì)胞離心棄上清后，每管細(xì)胞加入5-10ml0. 075M KCl混勻，室溫低滲 10-20min ；(4)、固定液固定采用兩步固定法，低滲后加入固定液，按質(zhì)量比，固定液低滲液=1 5-8，滴管混勻后立即離心，棄上清每管加入5-8ml固定液固定20-30min ；所述固定液為甲醇和冰醋酸混合溶液，按質(zhì)量比為甲醇冰醋酸=7-9 1 ；(5)、雙核和四核細(xì)胞的判斷除產(chǎn)生正常的雙核細(xì)胞外，對于一大一小的兩個細(xì)胞核， 如果小核的大小超過細(xì)胞核的1/3，將此類細(xì)胞也記為雙核細(xì)胞；對于四核細(xì)胞的判斷標(biāo)準(zhǔn)為，所有大于3個核的細(xì)胞均記為四核細(xì)胞；每個樣品，統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)不少于1000 ；(6)、通過統(tǒng)計(jì)細(xì)胞四核率，對低劑量輻射進(jìn)行定量，通過統(tǒng)計(jì)細(xì)胞雙核率，對高劑量輻射進(jìn)行定量；雙核率=雙核細(xì)胞數(shù)/N，四核率=四核細(xì)胞數(shù)/N，N為統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)，N不少于 1000。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體為一種檢測電離輻射劑量的生物學(xué)方法。根據(jù)電離輻射可以干擾細(xì)胞周期以及松胞素B可以阻滯細(xì)胞分裂而不阻滯細(xì)胞核分裂的原理，以不同劑量的r-射線對淋巴細(xì)胞照射后，加入一定量松胞素B處理，檢測不同劑量照射后淋巴細(xì)胞的四核率和雙核率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在0—6.4cGy的低劑量范圍內(nèi)，受照淋巴細(xì)胞的四核率與受照劑量呈線性劑量-效應(yīng)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.957，表現(xiàn)出輻射興奮性效應(yīng)；在0.4—20Gy的高劑量范圍內(nèi)，受照細(xì)胞的雙核率與受照劑量之間呈指數(shù)方程劑量-效應(yīng)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.978，能很好的反映輻射損傷效應(yīng)。本發(fā)明方法檢測指標(biāo)直觀、操作簡單、快速、經(jīng)濟(jì)，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
文檔編號G01T1/02GK102508283SQ20111033381
公開日2012年6月20日 申請日期2011年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月28日
發(fā)明者葉爽, 張江虹, 潘燕, 白楊, 袁德曉, 邵春林 申請人:復(fù)旦大學(xué)