專利名稱：一種血清中痕量內(nèi)源性磷酸化肽的富集方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化分析領(lǐng)域，具體地說是濾膜過濾結(jié)合金屬氧化物在富集內(nèi)源性磷酸化肽中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)磷酸化作為一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾(Post TranslationalModifications, PTMs),參與并調(diào)控著生命活動的幾乎所有過程,包括細(xì)胞增殖、分化,神經(jīng)活動和新陳代謝等。異常的蛋白質(zhì)磷酸化是人類疾病發(fā)生的根本原因之一。所以建立高靈敏度和高通量的磷酸化蛋白檢測方法，對于進(jìn)一步理解生命進(jìn)程、發(fā)現(xiàn)與疾病相關(guān)的生物標(biāo)志物具有重要意義。目前由于生物樣品中磷酸化肽的含量低，并且在質(zhì)譜檢測中大量的非磷酸化肽段嚴(yán)重抑制磷酸化肽的離子信號，導(dǎo)致對磷酸化蛋白的鑒定具有挑戰(zhàn)性。因此在質(zhì)譜分析前高選擇性的富集內(nèi)源性磷酸化肽非常重要。固定金屬離子親和色譜(IMAC)如Ga3+-1MAC和Fe3+-1MAC和金屬氧化物親和色譜(MOAC)如TiO2等因其對磷酸化肽的高選擇性被廣泛應(yīng)用于磷酸化蛋白組學(xué)研究中。血清中含有來源于幾乎所有細(xì)胞、組織的蛋白及代謝產(chǎn)物，能夠直接反映機體的生理、病理狀況,是對各種疾病研究的最有價值的樣本之一。但由于血清成分極其復(fù)雜，同時具有很高的動態(tài)范圍，使得血清中內(nèi)源性磷酸化肽的檢測面臨巨大挑戰(zhàn)，至今相關(guān)報道很少。Hu L.H.等利用一種基于有序介孔材料的固定化鈦離子親和色譜(Ti4+-1MAC)材料直接從人的血清中富集并檢測到4個內(nèi)源性磷酸化肽[Hu LH,Zhou HJ,Li YH，Sun ST7GuoLH, Ye ML, Tian XF, Gu JR, Yang SLjZou HF.Anal.Chem.,2009,81(1):94-104]。我們利用氧化鋯(ZrO2)包覆介孔氧化硅材料直接從人血清中富集到12個內(nèi)源性磷酸化肽[Wan HH,Yan JY, Yu L，Zhang XL，Xue XY, Li XL, Liang XM.Talanta,2010,82(5):1701-1707]。以上兩種方法都是利用磷酸化肽中的磷酸根與富集材料中的金屬元素相互作用實現(xiàn)了磷酸化肽的選擇性富集。但是血清樣品中含有大量的脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及磷酸化蛋白等大分子化合物，這些化合物都含有磷酸根，特別是RNA和DNA中含有的大量的磷酸根。這些含有磷酸根的化合物可能在上樣過程中與低豐度的磷酸化肽競爭富集材料上的作用位點，從而降低了血清中磷酸化肽的富集選擇性。因此，如何有效地去除這些大分子量干擾化合物，提高血清中低豐度磷酸化肽富集檢測方法至關(guān)重要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種血清中痕量內(nèi)源性磷酸化肽的富集方法，能對痕量磷酸化肽進(jìn)行選擇性富集。本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:一種血清中痕量內(nèi)源性磷酸化肽的富集方法，首先將血清樣品采用濾膜(ultrafiltration membrane)截留、去除血清中的大量蛋白、DNA和RNA等大分子量干擾化合物，降低了樣品的復(fù)雜性，然后利用金屬氧化物富集濾膜濾過液中的痕量內(nèi)源性磷酸化肽；所述濾膜的截留分子量在5000_20000Da之間；所述金屬氧化物材料包括氧化鈦、氧化鋯、氧化鋁、或者這些金屬的復(fù)合金屬氧化物中的一種或二種以上。金屬氧化物材料的粒徑大小為0.2-100微米，孔道直徑大小為1-100納米。濾膜截留的具體操作采用離心模式；在離心模式下，血清樣品經(jīng)溶液稀釋后，轉(zhuǎn)移至濾膜管中，用離心機離心，得到過濾液；血清樣品稀釋時采用的稀釋溶液為下述溶劑之一，I)體積濃度為5-60%甲醇，pH 2-7 ；2)體積濃度為1-20%乙腈，pH 2-7 ；3)體積濃度為1-40%乙醇溶液，pH 2-7 ；稀釋溶液的用量為2-20倍血清樣品體積。離心溫度為4_35°C，離心速率為5000_20000g，離心時間是0.1-48小時。金屬氧化物富集磷酸化肽的具體操作采用柱固相萃取模式或在離心模式；在柱固相萃取(SPE)模式下采用金屬氧化物富集磷酸肽時，將濾膜的過濾液旋干后，采用沖洗溶劑溶解樣品后上樣到以金屬氧化物為填料的SPE柱上，采用沖洗溶劑洗去非磷酸化肽，利用洗脫溶劑富集磷酸化肽；或在離心模式下，將濾膜的過濾液與金屬氧化物混合，采用沖洗溶劑洗脫、離心洗去非磷酸化肽，利用洗脫溶劑洗脫、離心富集得到磷酸化肽；沖洗非磷酸化肽時采用的沖洗溶劑為下述溶劑之一，I)含有30-500mg/mL乳酸的體積濃度為20-90 %乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH
2.0-4.3 ；2)含有1% -5%三氟乙酸的體積濃度為20-90%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH 1-3 ；3)含有1% -5%甲酸的體積濃度為20-90%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH 1-4 ;洗脫磷酸化肽時采用的洗脫溶劑為下述溶劑之一，I)體積濃度為1-10%的氨水溶液，pH 10-13 ；2)體積濃度為1-10%的吡咯溶液，pH 10-13。金屬氧化物與濾膜的過濾液質(zhì)量比例為10-200: 1，富集溫度為4_60°C。沖洗溶液的用量為3-40倍金屬氧化物體積的沖洗溶液；洗脫溶液的用量為3-40倍金屬氧化物體積的洗脫溶液。本發(fā)明具有如下優(yōu)點:1.本發(fā)明在富集磷酸化肽時表現(xiàn)出了高選擇性、高靈敏度和高通量等特點，可以實現(xiàn)痕量磷酸化肽的有效分離和富集；2.本發(fā)明采用濾膜或超濾膜去除了血清中大量的含有磷酸根的脫氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)及磷酸化蛋白等大分子化合物，減少了這些含有磷酸根的化合物在上樣過程中與低豐度的磷酸化肽競爭富集材料上的作用位點，從而提高了血清中磷酸化肽的富集選擇性和質(zhì)譜的檢測靈敏度。3.本發(fā)明采用濾膜在離心模式下截留大分子化合物，金屬氧化物在柱固相萃取模式或在離心模式磷富集磷酸酸化肽，濾膜截留和金屬氧化物富集均可實現(xiàn)樣品的大批量處理，從而提高了血清中磷酸化肽的高通量樣品處理。


圖1添加有-酪蛋白酶解物的血清樣品分別經(jīng)過(A) 50 % CH30H/0.1 % FA和(B) 10% ACN/0.1% FA稀釋后，再經(jīng)TiO2富集后的質(zhì)譜圖?！?磷酸化肽。圖2.分別添加有⑷ 160pmol、(B)80pmol、(C)20pmol 和(D) 8pmol_ 酪蛋白酶解液的混合液經(jīng)過所建立方法處理后的質(zhì)譜圖?！?磷酸化肽。
具體實施例方式本發(fā)明提供一種復(fù)雜體系中痕量內(nèi)源性磷酸化肽的富集方法，下面結(jié)合附圖通過具體實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明 ，但本發(fā)明不受這些實施例的限制。具體操作時，過程如下:在離心模式下，血清樣品經(jīng)2-20倍血清體積的溶液稀釋后，轉(zhuǎn)移至截留分子量在5000-20000Da之間濾膜管中，離心溫度為4_35°C，離心速率為5000_20000g，離心時間是
0.2-48小時，得到過濾液。金屬氧化物富集濾膜過濾液中的磷酸化肽的具體操作采用柱固相萃取模式；在柱固相萃取(SPE)模式下采用金屬氧化物富集磷酸肽時，將濾膜的過濾液上到以金屬氧化物為填料的SPE柱上，采用3-40倍柱體積的20-90%有機沖洗溶液(pH 1-4)洗去非磷酸化肽，利用3-40倍柱體積的體積濃度為1-10%的堿性溶液(pH 10-13)洗脫溶劑
富集磷酸化肽。本發(fā)明以下實施例所使用的一種濾膜為商品化超濾管(Millipore，馬薩諸塞州，美國)，所使用的一種金屬氧化物材料為商品化TiO2 (GLSciences,東京，日本)。樣品溶液的制備:將Img磷酸化蛋白標(biāo)準(zhǔn)品-酪蛋白溶解于50mM碳酸氫銨(lmL，pH 8.0)溶液中，按照蛋白:胰蛋白酶質(zhì)量比40: I的比例充分混合。在37°C下酶解12小時后，加入終濃度為0.5%的甲酸終止反應(yīng)。酶解液分裝后，在_70°C冰箱保存?zhèn)溆?。實施?添加有2yL -酪蛋白酶解液(80pmol)的125yL血清樣品用3倍血清體積的50% CH3OHA).5% FA溶液稀釋后，轉(zhuǎn)移至截留分子量IOK濾膜中，用高速臺式冷凍離心機離心13000g的離心速度離心60分鐘。取出濾過液并旋干，再溶40 μ L的300mg/mLLA/80% ACN/0.1FA溶液中，將此溶液上樣于Img TiO2微柱中，依次用40 μ LX 2的300mg/mL LA/80% ACN/0.1FA, 40 μ L 的 80% ACN/0.1 % TFA,最后用 10 μ L X 2 的 5% NH3.H2O 收集磷酸化肽并用質(zhì)譜進(jìn)行分析。由圖1A可見，CH30H/0.5% FA在實驗中稀釋血清和溶解磷酸化肽的性能好，使磷酸化肽的損失較小、提高血清中的磷酸化肽的富集選擇性。實施例2調(diào)整血清稀釋液為3倍血清體積的10% CH3CN/0.5% FA,其他條件同實施例1，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。由圖1B可見，10% CH3CN/0.5% FA在實驗中稀釋血清和溶解磷酸化肽的性能好，使磷酸化肽的損失較小、提高血清中的磷酸化肽的富集選擇性。實施例3調(diào)整血清稀釋液為3倍血清體積的15乙醇/0.5% FA,其他條件同實施例1，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。實施例一7調(diào)整-酪蛋白酶解液的量為 0.2 μ L (8pmol)、0.5 μ L(20pmol)、I μ L(40pmol)和4yL(160pmOl)，其他條件同實施例1，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。實驗結(jié)果表明當(dāng)-酪蛋白酶解液降低到8pmol (濃度為61.6fmol/μ L的磷酸化肽)時，仍可檢測到830.9491(2+)和976.5459(2+)兩個磷酸化肽，其信號和噪音的比值大于3 (見圖2)，說明此發(fā)明可實現(xiàn)血清中磷酸化肽的高靈敏度富集。實施例8-11調(diào)整-酪蛋白酶解液的量為0.2 μ L(8pmol)、0.5 μ L(20pmol)、I μ L(40pmol)和4μ L(160pmol)，其他條件同實施例2，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。實施例12 14調(diào)整血清稀釋液的體積為5倍、10倍和15倍的血清體積，其他條件同實施例1，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。實施例13-15調(diào)整血清稀釋液的體積為5倍、10倍和15倍的血清體積，其他條件同實施例2，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。實施例16-18調(diào)整離心機的離心速率為5000g、8000g和lOOOOg，其他條件同實施例1，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。實施例19 21調(diào)整磷酸化肽的富集材料為氧化鋯、氧化鋁和氧化鋅，其他條件同實施例1，富集后得到的磷酸化肽進(jìn)行質(zhì)譜分析。實施例22ImL血清樣品溶于3.5mL的50% CH30H/0.1% FA溶液中，將其移至截留分子量為IOK超濾膜，用高速臺式冷凍離心機離心13000g的離心速度離心60分鐘。取出濾過液并旋干，再溶40 μ L的300mM LA/80 % ACN/0.1FA溶液中。將上述準(zhǔn)備好的樣品上樣到填充有 ImgTiO2 的微柱中，然后依次用 40 μ LX 2 的 300mM LA/80 % ACN/0.1FA), 40 μ L 的 80%ACN/0.1 % TFA, 40 μ L的H2O沖洗非磷酸化肽，最后用10 μ LX 2的5% NH3 -H2O洗脫磷酸化肽，并用甲酸調(diào)至PH為3，最后利用液相色譜-質(zhì)譜進(jìn)行檢測。從ImL肺癌患者血清中共檢測到18個內(nèi)源性磷酸化肽(表I)。表格1.人血清中檢測到的內(nèi)源性磷酸化肽Table 1.Endogenous phosphopeptides enriched from human serum.
權(quán)利要求
1.一種血清中痕量內(nèi)源性磷酸化肽的富集方法，其特征在于: 首先將血清樣品采用濾膜截留，然后利用金屬氧化物富集濾膜濾過液中的痕量內(nèi)源性磷酸化肽； 所述濾膜的截留分子量在5000-20000Da之間； 所述金屬氧化物材料包括氧化鈦、氧化鋯、氧化鋁、或者這些金屬的復(fù)合金屬氧化物中的一種或二種以上。
2.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于: 金屬氧化物材料的粒徑大小為0.2-100微米，孔道直徑大小為1-100納米。
3.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于: 濾膜截留的具體操作采用離心模式； 在離心模式下，血清樣品經(jīng)溶液稀釋后，轉(zhuǎn)移至濾膜管中，用離心機離心，得到過濾液； 血清樣品稀釋時采用的稀釋溶液為下述溶劑之一， 1)體積濃度為5-60%甲醇，pH2-7 ； 2)體積濃度為1-20%乙腈，pH2-7 ； 3)體積濃度為1-40%乙醇溶液，pH2-7 ； 稀釋溶液的用量為2-20倍血清樣品體積。
4.按照權(quán)利要求3所述方法，其特征在于:離心溫度為4-35°C，離心速率為5000-20000g，離心時間是0.1-48小時。
5.按照權(quán)利要求1所述方法，其特征在于: 金屬氧化物富集磷酸化肽的具體操作采用柱固相萃取模式或在離心模式； 在柱固相萃取模式下采用金屬氧化物富集磷酸肽時，將濾膜的過濾液旋干后，采用沖洗溶劑溶解樣品后上樣到以金屬氧化物為填料的SPE柱上，采用沖洗溶劑洗去非磷酸化肽，利用洗脫溶劑富集磷酸化肽； 或在離心模式下，將濾膜的過濾液旋干后，采用沖洗溶劑溶解樣品后金屬氧化物混合，采用沖洗溶劑洗脫、離心洗去非磷酸化肽，利用洗脫溶劑洗脫、離心富集得到磷酸化肽；沖洗非磷酸化肽時采用的沖洗溶劑為下述溶劑之一， 1)含有30-500mg/mL乳酸的體積濃度為20-90%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH2.0-4.3 ； 2)含有1%-5%三氟乙酸的體積濃度為20-90%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH 1-3 ； 3)含有1%-5%甲酸的體積濃度為20-90%乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH 1-4 ； 洗脫磷酸化肽時采用的洗脫溶劑為下述溶劑之一， 1)體積濃度為1-10%的氨水溶液，pH10-13 ； 2)體積濃度為1-10%的吡咯溶液，pH10-13。
6.按照權(quán)利要求5所述方法，其特征在于:柱固相萃取模式下或離心模式下， 金屬氧化物與濾膜的過濾液質(zhì)量比例為10-200: 1，富集溫度為4-60°C。
7.按照權(quán)利要求5所述磷酸化肽分離富集方法，其特征在于: 沖洗溶液的用量為3-40倍金屬氧化物體積的沖洗溶液；洗脫溶液的用量為3-40倍金屬氧化物體積的洗脫溶液。
全文摘要
本發(fā)明涉及生化分析領(lǐng)域，公開了一種復(fù)雜體系中痕量內(nèi)源性磷酸化肽的富集方法。本發(fā)明首次采用濾膜(ultrafiltration membrane)去除血清中的大量高豐度蛋白、DNA和RNA等大分子量干擾化合物，在降低樣品復(fù)雜度的同時，減少了在上樣過程中與磷酸化肽競爭作用位點的干擾物，顯著地提高了金屬氧化物富集內(nèi)源性磷酸化肽的選擇性和檢測靈敏度。與此相比，血清樣品不經(jīng)過濾膜過濾，金屬氧化物富集不到內(nèi)源性磷酸化肽。該方法結(jié)合濾膜截留和金屬氧化物富集實現(xiàn)了血清中痕量內(nèi)源性磷酸化肽的高靈敏度、高選擇性富集和檢測，為腫瘤生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。
文檔編號G01N1/40GK103091153SQ20111033799
公開日2013年5月8日 申請日期2011年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月31日
發(fā)明者李秀玲, 萬慧慧, 梁鑫淼 申請人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所