專(zhuān)利名稱(chēng)：聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般的涉及聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析方法，特別的涉及聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的聚乙二醇修飾位點(diǎn)分析方法，更加特別的涉及聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)中占優(yōu)勢(shì)的聚乙二醇修飾位點(diǎn)的分析方法。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)是維持生命結(jié)構(gòu)與功能的重要生物活性分子，更是一種重要的藥理活性分子，可用于人類(lèi)各種疾病的治療。盡管蛋白質(zhì)類(lèi)藥物與傳統(tǒng)化學(xué)藥物相比有許多特點(diǎn)與優(yōu)點(diǎn)，但其半衰期短、穩(wěn)定性差、免疫原性強(qiáng)等一系列缺點(diǎn)也限制了其在臨床實(shí)踐中的進(jìn)一步推廣應(yīng)用。針對(duì)這些缺點(diǎn)，產(chǎn)生與發(fā)展了蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾技術(shù)，其中最成功的是蛋白質(zhì)的聚乙二醇(Polyethylene Glycol, PEG)修飾技術(shù)，并已開(kāi)發(fā)出了一系列的已上市藥物與待上市藥物，代表性的如瑞士羅氏(Roche)公司的商品名為“Pegasys”的聚乙二醇修飾干擾素ah產(chǎn)品，美國(guó)先靈葆雅(ScheringPlough)公司(現(xiàn)已被默沙東公司并購(gòu))的商品名為“Peghtron”的聚乙二醇修飾干擾素a 2b產(chǎn)品，美國(guó)安進(jìn)(Amgen)公司的商品名為 "Pegfilgrastim"的聚乙二醇修飾G-CSF產(chǎn)品等。盡管聚乙二醇修飾的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品較對(duì)應(yīng)未修飾的蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品在臨床上取得了更好的療效，在商業(yè)上取得了更大的成功，有逐漸在臨床實(shí)踐中取代未修飾蛋白質(zhì)藥物產(chǎn)品的趨勢(shì)，但聚乙二醇在修飾蛋白質(zhì)過(guò)程中普遍存在的多位點(diǎn)性和位點(diǎn)異構(gòu)性，會(huì)造成修飾產(chǎn)物組成的不均一性，而不同修飾程度與修飾位點(diǎn)的修飾產(chǎn)物又具有不同的理化性質(zhì)、藥理活性與安全性特征，因此會(huì)影響到該類(lèi)藥物的質(zhì)量控制與安全有效性。為了保證聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)藥物的安全有效與質(zhì)量可控性，更在可能的情況下為進(jìn)一步研究聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)藥物的構(gòu)效關(guān)系，從而為從聚乙二醇修飾產(chǎn)物混合物中分離出結(jié)構(gòu)單一、藥理活性最高、毒性最低的修飾產(chǎn)物異構(gòu)體作為臨床使用的進(jìn)一步技術(shù)更新的藥物做準(zhǔn)備，有必要對(duì)聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析與確證，尤其是要對(duì)聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)分布與各修飾位點(diǎn)所占比例進(jìn)行分析與控制。現(xiàn)有技術(shù)對(duì)聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行分析的方法主要是酶解質(zhì)譜法和酶解液質(zhì)聯(lián)用法，具體原理如下。酶解質(zhì)譜法的原理是選擇一種蛋白質(zhì)組學(xué)常用的工具酶或幾種工具酶的組合，如胰蛋白酶(Trypsin)、糜蛋白酶(Chymotrypsin)、Glu_C、Asp-N等，在各自適宜的酶解條件下對(duì)蛋白質(zhì)先后或同時(shí)進(jìn)行酶解，以使可能的不同修飾位點(diǎn)氨基酸殘基分布于不同的理論酶解片段(如一般的氨基聚乙二醇修飾劑可能的修飾位點(diǎn)是蛋白質(zhì)中所有的賴(lài)氨酸殘基； N端氨基聚乙二醇修飾劑理論上只修飾蛋白質(zhì)N端的氨基酸殘基，但由于特異性不高，也有可能修飾蛋白質(zhì)非N端的賴(lài)氨酸殘基；巰基聚乙二醇修飾劑可能的修飾位點(diǎn)是蛋白質(zhì)中所有的半胱氨酸殘基)。在終止酶解反應(yīng)并進(jìn)行適宜質(zhì)譜儀檢測(cè)的適當(dāng)處理后加酶解樣到質(zhì)譜儀，如Q-TOF質(zhì)譜儀或MALDI-T0F質(zhì)譜儀進(jìn)行酶解片段的質(zhì)譜分子量檢測(cè)。將檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)的未修飾蛋白質(zhì)藥物的理論酶解片段序列及其分子量分布結(jié)果對(duì)比(利用各種蛋白質(zhì)組學(xué)分析軟件，或者上蛋白質(zhì)組學(xué)分析網(wǎng)站，如WWW, expasy. org均可分析獲得理論酶解片段序列及其分子量分布結(jié)果)，查找檢測(cè)結(jié)果中缺失的片段，此缺失片段序列中具有的可能的修飾位點(diǎn)氨基酸殘基就是聚乙二醇實(shí)際修飾蛋白質(zhì)藥物的修飾位點(diǎn)。此方法的缺點(diǎn)是對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)的精度要求高，如果質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果中有漏檢酶解片段或酶解片段檢測(cè)分子量不準(zhǔn)確，均會(huì)嚴(yán)重影響結(jié)果的判定或使結(jié)果無(wú)法判定；另外由于連接聚乙二醇部分的酶解片段在質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果中缺失，所以此法也無(wú)法確定不同修飾位點(diǎn)產(chǎn)物在全部修飾位點(diǎn)產(chǎn)物中所占的比例。酶解液質(zhì)聯(lián)用法的原理也是先用一種或多種適宜的蛋白質(zhì)組學(xué)工具酶，選擇各自適宜的酶解條件先后或同時(shí)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解。在終止酶解反應(yīng)并進(jìn)行適宜液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)的適當(dāng)處理后加酶解樣到液質(zhì)聯(lián)用儀，在選擇適宜的液相色譜分離條件使各酶解片段彼此分離后用與液相色譜相連接的質(zhì)譜檢測(cè)器檢測(cè)各酶解片段的分子量。由于連接聚乙二醇部分的酶解片段分子量超出質(zhì)譜檢測(cè)器的檢測(cè)范圍檢測(cè)不到，所以同樣可以將檢測(cè)結(jié)果與對(duì)應(yīng)的未修飾蛋白質(zhì)的理論酶解片段序列及其分子量分布結(jié)果對(duì)比，查找未檢測(cè)到對(duì)應(yīng)分子量的缺失片段，從而確定實(shí)際存在的修飾位點(diǎn)。然后對(duì)照液相色譜峰面積檢測(cè)結(jié)果，對(duì)所有代表只含同一個(gè)實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段的色譜峰進(jìn)行峰面積歸一化法處理，以確定各同一個(gè)實(shí)際修飾位點(diǎn)的修飾產(chǎn)物在全部修飾產(chǎn)物中所占的比例，也即確定各修飾位點(diǎn)的比例。此方法雖然客服了上述酶解質(zhì)譜法只能定性不能定量的缺點(diǎn)，但依然存在質(zhì)譜檢測(cè)器漏檢酶解片段或酶解片段檢測(cè)分子量不準(zhǔn)確影響定性結(jié)果分析的缺點(diǎn)，還存在高效液相色譜分離較難能使各含同一個(gè)實(shí)際修飾位點(diǎn)且連接聚乙二醇部分的酶解片段完全分離的缺點(diǎn)?；趯?duì)上述方法的改進(jìn)，中國(guó)專(zhuān)利CN200380103341. 1公開(kāi)了一種聚乙二醇修飾干擾素ah(氨基聚乙二醇修飾劑修飾產(chǎn)物)異構(gòu)體的分離方法，也即聚乙二醇修飾干擾素ah修飾位點(diǎn)的分析方法。該方法首先在弱陽(yáng)離子交換的制備型液相色譜上初步分離聚乙二醇修飾干擾素ah位置異構(gòu)體(即修飾位點(diǎn)異構(gòu)體)，然后在強(qiáng)陽(yáng)離子交換的制備型高效液相色譜上進(jìn)一步分離位置異構(gòu)體。對(duì)分離開(kāi)的各異構(gòu)體分別用只在賴(lài)氨酸C端特異性酶解，而不在精氨酸C端酶解的Trypsin進(jìn)行酶解，酶解產(chǎn)物進(jìn)行MALDI-T0F質(zhì)譜檢測(cè)。由于連接聚乙二醇部分的賴(lài)氨酸殘基位點(diǎn)在酶解過(guò)程中不能被酶解，所以造成包括該賴(lài)氨酸殘基位點(diǎn)在內(nèi)的理論酶解片段與氨基酸序列上與此理論酶解片段緊連的理論酶解片段，連同聚乙二醇部分連接在一起不能被酶解開(kāi)形成一個(gè)大的實(shí)際酶解片段，從而造成整個(gè)大的實(shí)際酶解片段分子量過(guò)大超出MALDI-T0F質(zhì)譜檢測(cè)限而檢測(cè)不到。這樣，只要與理論酶解片段序列及分子量分布對(duì)比，在MALDI-T0F檢測(cè)結(jié)果中查找蛋白質(zhì)一級(jí)序列上連接在一起的兩個(gè)缺失的理論酶解片段，便可確定其中一個(gè)片段C端的賴(lài)氨酸，也即另一個(gè)片段N端氨基酸前的一個(gè)賴(lài)氨酸便是實(shí)際修飾位點(diǎn)。在確定每一個(gè)高效液相色譜上分離的異構(gòu)體峰的修飾位點(diǎn)后，便可根據(jù)高效液相色譜的峰面積檢測(cè)結(jié)果，利用峰面積歸一化法確定各修飾位點(diǎn)在全部修飾產(chǎn)物中所占的比例。這一方法雖然對(duì)前述方法作出了較大改進(jìn)，得到的結(jié)果更可靠，但操作較為繁瑣(如果有多種高效液相色譜分離異構(gòu)體，則每一種異構(gòu)體都需進(jìn)行酶解質(zhì)譜分析，工作量較大)，成本較高(賴(lài)氨酸C端特異性酶解Trypsin 價(jià)格貴，且由于步驟多，分析對(duì)聚乙二醇修飾的干擾素a 2a需要量也大)，依舊對(duì)高效液相色譜分離與質(zhì)譜檢測(cè)有較高要求，且只能解決氨基修飾蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)分析問(wèn)題，并不能解決巰基修飾蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)分析問(wèn)題，因此實(shí)際應(yīng)用具有很大的局限性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)分析方法，以克服現(xiàn)有采用質(zhì)譜或液質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)的技術(shù)中存在的因質(zhì)譜理論酶解片段檢測(cè)不全、高效液相色譜分離酶解片段不完全而影響結(jié)果判定，以及在大多數(shù)情況下不能對(duì)各修飾位點(diǎn)產(chǎn)物在全部修飾產(chǎn)物中所占比例進(jìn)行定量的缺點(diǎn)，同時(shí)盡可能克服檢測(cè)過(guò)程步驟多、時(shí)間長(zhǎng)、成本高的缺
點(diǎn)ο為克服這些缺點(diǎn)，本發(fā)明提供至少包括如下步驟的技術(shù)方案1)酶解至少一次酶解，以在完全酶解與不存在非特異性酶解的條件下使各可能的修飾位點(diǎn)分布于不同的理論酶解片段中；2)高效液相色譜分離在每次酶解后至少一次高效液相色譜分離，以最終使實(shí)際連接聚乙二醇部分的酶解片段比較實(shí)際未連接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色譜峰中，且最終至少使序列上只包括含量上占優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段(以下簡(jiǎn)稱(chēng)A片段)比較各序列上只包括同一個(gè)含量上次要的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段(以下簡(jiǎn)稱(chēng)B片段)，分布于不同的色譜峰中；3)確定修飾位點(diǎn)比例對(duì)A片段與B片段在幻的色譜分離中最終對(duì)應(yīng)的色譜分離峰進(jìn)行峰面積加和處理，不同次色譜分離得到的色譜峰的峰面積需按同一次色譜分離的峰面積進(jìn)行折算后再加和，并確定其中峰面積最大的色譜分離峰占峰面積加和的比例，以確定占優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)在全部修飾位點(diǎn)中所占比例；4)確定修飾位點(diǎn)位置收取A片段所最終對(duì)應(yīng)的色譜分離峰的樣品進(jìn)行N端序列測(cè)定，與理論酶解序列進(jìn)行比對(duì)確定占優(yōu)勢(shì)的修飾位點(diǎn)在蛋白質(zhì)序列中的位置。在上述技術(shù)方案的酶解中，優(yōu)選通過(guò)一次酶解使可能的修飾位點(diǎn)分布于不同的理論酶解片段中。酶解過(guò)程可選擇的蛋白質(zhì)組學(xué)工具酶不限于但優(yōu)選Trypsin、 Chymotrypsin、Glu-C、Asp-N中的一種或幾種的組合。但由于Chymotrypsin酶解位點(diǎn)過(guò)多， 酶解過(guò)程容易不完全和非特異，Asp-N的價(jià)格高，所以更優(yōu)選的工具酶是Trypsin、Glu-C 中的一種或兩種的組合。又由于Glu-C的酶解受緩沖液種類(lèi)、pH與時(shí)間的影響較大，所以最優(yōu)選的工具酶是Trypsin。在酶解過(guò)程中優(yōu)選用變性劑尿素對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，更加優(yōu)選在酶解前用變性劑對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行處理，以使酶解過(guò)程更加完全。酶解的緩沖液、PH、溫度、時(shí)間、酶與底物的比例可以參考工具酶制造商的產(chǎn)品使用說(shuō)明，但對(duì)于Trypsin優(yōu)選 2-20mmol/L的碳酸氫銨酶解緩沖液(pH8. 0)，37°C的酶解溫度，18-24小時(shí)的酶解時(shí)間，質(zhì)量比1 10-1 40的酶與底物的比例。在上述技術(shù)方案的高效液相色譜分離中，至少要求通過(guò)一步或多步高效液相色譜分離最終使A片段與各B片段之間彼此分離，但不同實(shí)際修飾位點(diǎn)的B片段之間分離與否沒(méi)有關(guān)系。高效液相色譜優(yōu)選反相高效液相色譜與分子排阻高效液相色譜，在A片段與各B片段分子量差異較大的情況下更加優(yōu)選分子排阻色譜，因?yàn)榉肿优抛韪咝б合嗌V分離的影響因素較少，分離條件的研究獲得更容易，色譜圖更加直觀，便于結(jié)果的分析判斷。但由于酶解混合物中的含聚乙二醇部分的酶解片段分子量較大，所以應(yīng)選擇大孔徑的高效液相色譜填料進(jìn)行分離，其中分子排阻高效液相色譜可以選擇的填料包括但不限于 TSK-GEL· G2000SW, TSK-GEL G2000SffXL, TSK-GEL Super G2000、TSK-GEL G3000SW, TSK-GELG3000SWxl, TSK-GEL Super G3000、 Protein-Pak 125、 Protein-Pak 200SW, Protein-Pak 300SW。在上述技術(shù)方案的高效液相色譜分離獲得的圖譜中，實(shí)際連接聚乙二醇部分的各酶解片段的出峰位置的判斷，可以采用如下三種方法之一1)保留時(shí)間比對(duì)法在每次分子排阻高效液相色譜分離后，在同樣的色譜分離系統(tǒng)與色譜分離條件下分別在高效液相色譜柱上上未修飾的蛋白質(zhì)純品與分子量均一的聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)純品，確定兩者的保留時(shí)間，則該聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)酶解后連接聚乙二醇部分的酶解片段在同樣的色譜分離系統(tǒng)與色譜分離條件下的保留時(shí)間應(yīng)該在此兩者之間。2)電泳染色法無(wú)論是在每次分子排阻高效液相色譜分離后，還是在每次反相高效液相色譜分離后，還是在每次其他類(lèi)型的高效液相色譜分離后，對(duì)收集的各色譜峰分別進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測(cè)，電泳后先后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R250染色與碘染色。其中考馬斯亮藍(lán)R250對(duì)蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行染色的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的方法，而碘染色的方法也可以參考相關(guān)文獻(xiàn)的報(bào)道，或采用如下的方法將電泳后的凝膠取下，浸入電泳脫色液中浸泡30分鐘，然后取出放入5% (w/v)氯化鋇溶液中浸泡約10分鐘，再放入碘染色液中(固體碘與30%酒精水溶液配制成的飽和溶液)染色3-5分鐘。最后需將染色后的凝膠放入脫色液中再浸泡1-2分鐘漂洗去凝膠上的浮色后才能進(jìn)行照相與掃描分析。同一條帶只有在兩種染色時(shí)均能顯色的才代表連接聚乙二醇部分的酶解片段，否則若只在考馬斯亮藍(lán)R250染色時(shí)顯色而不在碘染色時(shí)顯色的代表不連接聚乙二醇部分的酶解片段。若某一泳道有在兩種染色時(shí)均顯色的條帶，則此泳道所代表的色譜峰中含有連接聚乙二醇部分的酶解片段。3)質(zhì)譜法無(wú)論是在每次分子排阻高效液相色譜分離后，還是在每次反相高效液相色譜分離后，還是在每次其他類(lèi)型的高效液相色譜分離后，對(duì)收集的各色譜峰分別脫鹽脫有機(jī)溶劑后進(jìn)行質(zhì)譜分子量檢測(cè)，測(cè)得分子量大于聚乙二醇修飾劑分子量的峰為連接聚乙二醇部分的酶解片段峰。在上述技術(shù)方案的峰面積加和處理中，如果A片段與B片段間在一次色譜分離中得到完全分離，則只要將只分別含有它們的色譜峰的峰面積簡(jiǎn)單加和便可以。但若不能完全分離，則需對(duì)經(jīng)過(guò)多次酶解與色譜分離后才得到的只含有A片段或B片段(不同實(shí)際修飾位點(diǎn)的B片段間分離與否沒(méi)有關(guān)系)的色譜峰的峰面積進(jìn)行折算處理，所有的加和峰面積應(yīng)折算為同一次色譜分離中的峰面積。下面對(duì)折算處理方法舉例進(jìn)行說(shuō)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員在理解如下例子后無(wú)需創(chuàng)造性勞動(dòng)便可對(duì)其他相似或更復(fù)雜的情況進(jìn)行折算處理。應(yīng)當(dāng)指出的是，不含實(shí)際修飾位點(diǎn)的酶解片段的峰面積在折算時(shí)不用考慮。例1 1)酶解高效液相色譜分離情況
各次酶解高效液相色譜分離后所得的色譜峰的情況如下表1所示，表中代號(hào)表示的含義為Xl 第幾次酶解及其后對(duì)應(yīng)的高效液相色譜分離；x2 本次酶解高效液相色譜分離的第a次酶解高效液相色譜分離所得的色譜峰b， 表不為a, b ；yl 該峰含有的酶解片段中含有的實(shí)際修飾位點(diǎn)；y2 該峰含有的酶解片段中含有的可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)；zl 該峰對(duì)應(yīng)的各酶解片段是否各連接有一個(gè)聚乙二醇分子(一個(gè)酶解片段不可能連接有兩個(gè)以上聚乙二醇分子；各酶解片段要么都連接有一個(gè)聚乙二醇分子，要么都不連接聚乙二醇分子)；z2 該峰中是否只含有一個(gè)酶解片段。表1各次酶解高效液相色譜分離后所得的色譜峰的情況
xlx2峰1峰2峰3峰4yiy2zlz2yiy2zlz2yiy2zlz2yiy2zlz2
1-a無(wú)是是b無(wú)是是abC否否無(wú)無(wú)否否2)修飾位點(diǎn)比例計(jì)算結(jié)果按第一次酶解色譜分離所得的色譜峰的峰面積進(jìn)行折算a修飾位點(diǎn)所占的比例為A11/(A11+A12)b修飾位點(diǎn)所占的比例為A12/(A11+A12)其中Aab表示第a次酶解色譜分離后所得的峰b的峰面積。例2 1)酶解高效液相色譜分離情況各次酶解高效液相色譜分離后所得的色譜峰的情況如下表2所示，表中代號(hào)含義如例1。表2各次酶解高效液相色譜分離后所得的色譜峰的情況
xlx2峰1峰2峰3峰4yiΥ2zlζ2yiΥ2zlz2yiY2zlz2yiy2zlz21-a無(wú)是是bed是是無(wú)ef否否abc無(wú)否否21,2b無(wú)是是C無(wú)是是bd否否C無(wú)否否2)修飾位點(diǎn)比例計(jì)算結(jié)果按第一次酶解色譜分離所得的色譜峰的峰面積進(jìn)行折算a修飾位點(diǎn)所占的比例為A11/(A11+A12)b 修飾位點(diǎn)所占的比例為A12XA21/(A21+A22)/(A11+A12)c 修飾位點(diǎn)所占的比例為A12XA22/(A21+A22)/(A11+A12)
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其中Aab表示第a次酶解色譜分離后所得的峰b的峰面積。當(dāng)Α11ΛΑ11+Α12) > 0. 5時(shí)，可以直接確定a為占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)，并可以不考慮其他實(shí)際修飾位點(diǎn)的比例而確定占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)a在全部實(shí)際修飾位點(diǎn)中所占的比例為Α11ΛΑ11+Α12)。例 3 1)酶解高效液相色譜分離情況各次酶解高效液相色譜分離后所得的色譜峰的情況如下表3所示，表中代號(hào)含義如例1。表3各次酶解高效液相色譜分離后所得的色譜峰的情況
權(quán)利要求
1.聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)的修飾位點(diǎn)分析方法，至少包括如下步驟1)酶解至少一次酶解，以在完全酶解與不存在非特異性酶解的條件下使各可能的修飾位點(diǎn)分布于不同的理論酶解片段中；2)高效液相色譜分離在每次酶解后至少一次高效液相色譜分離，以最終使實(shí)際連接聚乙二醇部分的酶解片段比較實(shí)際未連接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色譜峰中，且最終至少使序列上只包括含量上占優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段比較各序列上只包括同一個(gè)含量上次要的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段， 分布于不同的色譜峰中；3)確定修飾位點(diǎn)比例對(duì)序列上只包括含量上占優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段與各序列上只包括同一個(gè)含量上次要的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段在2、的色譜分離中最終對(duì)應(yīng)的色譜分離峰進(jìn)行峰面積加和處理，不同次色譜分離得到的色譜峰的峰面積需按同一次色譜分離的峰面積進(jìn)行折算后再加和，并確定其中峰面積最大的色譜分離峰占峰面積加和的比例，以確定占優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)在全部修飾位點(diǎn)中所占比例；4)確定修飾位點(diǎn)位置收取序列上只包括含量上占優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段所最終對(duì)應(yīng)的色譜分離峰的樣品進(jìn)行N端序列測(cè)定，與理論酶解序列進(jìn)行比對(duì)確定占優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)在蛋白質(zhì)序列中的位置。
2.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征是酶解步驟中各次酶解選擇的酶是Trypsin、 Chymotrypsin、Glu_C、Asp-N中的一種或幾種的組合。
3.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征是每次高效液相色譜分離選擇反相高效液相色譜柱或分子排阻高效液相色譜柱中的一種。
4.如權(quán)利要求3所述的分析方法，其特征是所述的反相高效液相色譜柱選擇Waters Symmetry 300(18色譜柱。
5.如權(quán)利要求3所述的分析方法，其特征是所述的分子排阻高效液相色譜柱選擇 TSK-GEL G3000SWXL 色譜柱。
6.如權(quán)利要求1所述的分析方法，其特征是所述的蛋白質(zhì)為復(fù)合干擾素86位點(diǎn)半胱氨酸突變體，其具有SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列。
7.如權(quán)利要求6所述的分析方法，其特征是包括如下步驟DTrypsin 一次酶解；2)一次酶解產(chǎn)物的高效液相色譜分離，以使各實(shí)際連接聚乙二醇部分的酶解片段比較各實(shí)際未連接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色譜峰中，且各在同一位點(diǎn)實(shí)際連接聚乙二醇部分的酶解片段也分布于不同的色譜峰中，收集各在同一位點(diǎn)實(shí)際連接聚乙二醇部分的酶解片段對(duì)應(yīng)的色譜峰中峰面積占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的峰的樣品，并通過(guò)計(jì)算該峰的峰面積占全部各在同一位點(diǎn)實(shí)際連接聚乙二醇部分的酶解片段對(duì)應(yīng)的色譜峰峰面積的加和的比例，從而確定占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)在全部修飾位點(diǎn)中所占比例；3)對(duì)2、中收集的峰樣品進(jìn)行Chymotrypsin二次酶解；4)二次酶解產(chǎn)物的高效液相色譜分離，并收集連接聚乙二醇部分的酶解片段峰；5)對(duì)兩次高效液相色譜分離收集的酶解片段峰進(jìn)行N末端序列測(cè)定，通過(guò)與理論酶解序列對(duì)比確定占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)在復(fù)合干擾素86位點(diǎn)半胱氨酸突變體序列中的位置。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是步驟幻和/或步驟4)中所述的高效液相色譜分離采用Waters Symmetry 300C18反相高效液相色譜柱。
9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征是步驟幻和/或步驟4)中所述的高效液相色譜分離采用TSK-GEL G3000SWa分子排阻高效液相色譜柱。
10.如權(quán)利要求1-6之一所述的分析方法，對(duì)如下步驟進(jìn)一步要求1)高效液相色譜分離在每次酶解后至少一次高效液相色譜分離，以最終使各序列上只包括同一個(gè)含量上次要的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段分布于不同的色譜峰中；2)確定修飾位點(diǎn)比例對(duì)各序列上只包括同一個(gè)含量上次要的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色譜峰的峰面積進(jìn)行加和處理，計(jì)算各序列上只包括同一個(gè)含量上次要的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色譜峰的峰面積占全部各序列上只包括同一個(gè)含量上次要的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色譜峰的峰面積加和的比例，以確定各實(shí)際修飾位點(diǎn)在全部修飾位點(diǎn)中所占比例；3)確定修飾位點(diǎn)位置收取各序列上只包括同一個(gè)含量上次要的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段所在的色譜分離峰的樣品進(jìn)行N端序列測(cè)定，與理論酶解序列進(jìn)行比對(duì)確定各實(shí)際修飾位點(diǎn)在蛋白質(zhì)序列中的位置。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)修飾位點(diǎn)的分析方法，至少包括蛋白質(zhì)組學(xué)工具酶酶解、高效液相色譜分離使序列上只包括含量上占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段與各序列上只包括一個(gè)含量上次要的實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且不包括可能但非實(shí)際修飾位點(diǎn)殘基且連接聚乙二醇部分的酶解片段彼此分離、峰面積歸一法確定占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)修飾位點(diǎn)比例、N端序列測(cè)定確定占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)修飾位點(diǎn)位置等步驟。采用這一分析方法，可更加方便、快捷、準(zhǔn)確、低成本的確定聚乙二醇修飾蛋白質(zhì)中占修飾位點(diǎn)的分布與比例。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102507824SQ201110339619
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月1日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月1日
發(fā)明者劉金毅, 周敏毅, 程永慶 申請(qǐng)人:北京三元基因工程有限公司