專利名稱：缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑
品.O
背景技術(shù)：
急性冠狀動(dòng)脈綜合征(Acute coronary syndromes，ACS)有不同的臨床表現(xiàn)，但均有一個(gè)相同的病理生理過程，即動(dòng)脈粥樣硬化斑塊脫落、血小板聚集和血栓形成，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈狹窄、阻塞，而引起心肌缺血，如果心肌缺血時(shí)間延長會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞壞死和心肌損傷。因此，在心肌壞死之前鑒別出心肌缺血，盡早明確診斷和開始治療對(duì)于病人是至關(guān)重要的。當(dāng)前心臟缺血的診斷多依賴于心電圖的ST段和T波的改變，這是心肌缺血最簡便、 最迅速和最廉價(jià)的檢查方法，但心梗的病人也可多表現(xiàn)為心電圖未見異常，其靈敏度低于 50%。單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)成像顯示的急性心肌灌注異常和超聲心動(dòng)圖顯示的室壁運(yùn)動(dòng)異常是診斷心肌缺血較好的指標(biāo)，這兩種方法都有很高的敏感性、特異性和陰性預(yù)測值，但在實(shí)際工作中不能隨時(shí)檢查且費(fèi)用高昂，如果不與以前的檢查結(jié)果對(duì)比則很難識(shí)別新出現(xiàn)的缺血區(qū)。目前，臨床應(yīng)用的心肌缺血標(biāo)志物中，肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、肌紅蛋白等在心臟受損壞時(shí)能從心肌細(xì)胞釋放入血，但這些酶也存在于骨骼肌，骨骼肌損傷時(shí)這些酶也會(huì)釋放入血，故特異性差。心肌肌鈣蛋白I或T具有高特異性，但其在心臟損傷發(fā)生6-12 h之后才能從血中檢測出，且對(duì)心肌細(xì)胞損傷的特異性高，對(duì)可逆的心肌缺血多為陰性。因此，為能盡早診斷ACS，需要一種能早期檢測且靈敏度和特異性較高的心肌缺血標(biāo)志物。人血清白蛋白(HSA)是一種循環(huán)蛋白，其氨基酸末端序列為人類所特有，能與金屬鈷、銅和鎳等離子結(jié)合，在缺血/再灌注發(fā)生時(shí)，由于自由基等破壞了血清白蛋白的氨基酸序列，而導(dǎo)致白蛋白與過渡金屬的結(jié)合能力改變，這種因缺血而發(fā)生與過渡金屬結(jié)合能力改變的白蛋白稱為缺血修飾白蛋白(Ischemia Modified Albumin，IMA)。IMA在心肌缺血后數(shù)分鐘內(nèi)即迅速升高，是心肌缺血發(fā)生后到發(fā)生細(xì)胞壞死之前的一個(gè)非常早期的指標(biāo)。研究顯示，IMA在心肌可逆的心肌缺血階段血中濃度即迅速升高，可早期并靈敏的反應(yīng)心肌缺血狀況，將心肌缺血的診斷窗由原來的缺血發(fā)生4-6 h提前到5-10 min0早在1990年，1名急診醫(yī)生就發(fā)現(xiàn)心肌缺血發(fā)作時(shí)HSA的化學(xué)性質(zhì)可能會(huì)發(fā)生改變，并發(fā)現(xiàn)HSA和過渡金屬元素如鈷、銅和鎳有很強(qiáng)的結(jié)合能力；1997年局部缺血技術(shù)公司 (Ischemia Technologies,Denver, Colorado, USA)投入資金對(duì)IMA標(biāo)志物進(jìn)行商業(yè)開發(fā)， 生產(chǎn)出適合臨床自動(dòng)化檢測的試劑盒。2000年美國多中心臨床試驗(yàn)顯示在診斷ACS時(shí)IMA 比心電圖 ECG、cTnl 敏感；2001 年 ACB 試驗(yàn)通過 IS09001、IS013485, EN46001 認(rèn)可。2003 年2月美國FDA批準(zhǔn)可上市銷售，這是FDA自1994年批準(zhǔn)肌鈣蛋白的測定試驗(yàn)后，首次批準(zhǔn)的一個(gè)用來評(píng)價(jià)心肌缺血的生化試驗(yàn)項(xiàng)目。由于IMA極高的陰性預(yù)測值，美國FDA將其推薦為ACS的排除指標(biāo)，在美國此項(xiàng)檢測己列入醫(yī)療報(bào)銷范圍。IMA的檢測方法有超濾法、液相色譜法、質(zhì)譜測定法、核磁共振法、ELISA方法等，均因檢測成本較高或干擾因素多，不適合臨床常規(guī)使用。目前，IMA的測定主要是采用白蛋白結(jié)合鈷試驗(yàn)(ACB試驗(yàn))，其反應(yīng)原理如下血清中HSA與Co2+結(jié)合后剩余的游離Co2+與有機(jī)顯色物反應(yīng)生成紅褐色產(chǎn)物，在510 nm的波長下比色，其吸光度與Co2+濃度成正比，與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，即可計(jì)算出樣本中IMA的濃度。David Bar-Or等最早建立了手工分光光度法，方便簡易，適合基層單位使用，報(bào)告單位為吸光度單位(absorbance imit，ABSU)。此種手工方法試劑，國內(nèi)沒有供應(yīng)，可用于半自動(dòng)生化分析儀檢測。第二代ACB試驗(yàn)為全自動(dòng)分光光度法。結(jié)果可用U/ml或KU/L表示。其基本原理同樣為ACB試驗(yàn)。美國Ischemia Technologies ^W] (2007 Inverness Medical Professional Diagnostics ^1 ) 該方法最早開發(fā)出IMA測定試劑盒，美國食品與藥品管理局(FDA)于2003年批準(zhǔn)認(rèn)證。目前該試劑盒可應(yīng)用于包括羅氏的 COBAS MIRAePlus, COBAS INTEGRA 700/800, Hitachi 917 及 Roche/Hitachi Modular P，貝克曼庫爾特的 Beckman Coulter Synchron LX 20 等多種儀器，但價(jià)格昂貴，而且為干粉試劑，復(fù)溶后有效期僅為2個(gè)星期。由于IMA測定采用二硫蘇糖醇為顯色劑，其水溶液冷藏或冷凍保存穩(wěn)定時(shí)間相對(duì)較短，此外由于二硫蘇糖醇能與樣本中的其他重金屬螯合影響測定的準(zhǔn)確性，因此嚴(yán)重影響了該試劑的大規(guī)模臨床應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種準(zhǔn)確度、精密度均較好，穩(wěn)定性好，2 8°C 避光保存至少可穩(wěn)定12個(gè)月，完全能滿足臨床檢驗(yàn)要求缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為一種缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，該試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中
試劑1各組分及濃度為
緩沖液(pH 7. 5-8. 5)0. 05 0. 5 M (mol/L)
氯化鈷20 200 mg/L
去干擾劑0. Γ10 g/L
穩(wěn)定劑0. Γ10 g/L
防腐劑0. ΓΙΟ g/L ；
試劑2各組分及濃度為
緩沖液(pH 7. 0-8. 0)0. 5 10 M
二硫蘇糖醇0. 5 50 g/L
穩(wěn)定劑0. Γ10 g/L
防腐劑0. ΓΙΟ g/L。本發(fā)明上述試劑1中的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液等中的一種，優(yōu)選4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液。本發(fā)明上述試劑1中的去干擾劑為氟化鈉、檸檬酸、半胱氨酸、氨基乙酸等中的一種或幾種(即兩種及以上的混合，當(dāng)兩種以上的混合時(shí)，各組分之間配比關(guān)系沒有要求)。本發(fā)明上述試劑2中的緩沖液為檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液、咪唑緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液等中的一種，優(yōu)選咪唑緩沖液。本發(fā)明的穩(wěn)定劑為吐溫20、吐溫80、布里杰-35 (Bri j_;35)、曲拉通100 (曲拉通X-100)等非離子表面活性劑中的一種。本發(fā)明的防腐劑為疊氮鈉或proclin系列防腐劑(如Proclin300)等。本發(fā)明試劑1和試劑2的配制方法為常規(guī)方法，即按照上述配方比例，分別將試劑 1和試劑2所述的各組分按照配方比例分別加入蒸餾水后各自混合攪勻即可。本發(fā)明試劑盒測定樣本中的IMA的測試條件如下溫度30-37 °C ；比色杯光徑為 1.0 cm。檢測主波長510 nm，副波長700 nm。應(yīng)用本發(fā)明IMA測定試劑盒測定樣本中IMA的方法如下樣品(校準(zhǔn)管以校準(zhǔn)品做樣品)加試劑1混勻，30-37°C孵育3-5 min后讀取吸光度A0，立即加入試劑2混勻，30-37°C 反應(yīng)5 min后，讀取吸光度Al，ΔΑ = A1-A0。其中樣本用量30 μ ，試劑1用量200 μ ，試劑2用量100 μ 。
本發(fā)明試劑盒測定樣本中IMA含量按以下公式進(jìn)行計(jì)算
權(quán)利要求
1.一種缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，其特征在于該試劑盒為由試劑1和試劑2 組成的液體型雙試劑，其中試劑1各組分及濃度為緩沖液(pH 7. 5-8. 5)0. 05 0. 5 M氯化鈷20 200 mg/L去干擾劑0. Γ10 g/L穩(wěn)定劑0. ΓΙΟ g/L防腐劑0. ΓΙΟ g/L ；試劑2各組分及濃度為緩沖液(pH 7. 0-8. 0)0. 5 10 M二硫蘇糖醇0. 5 50 g/L穩(wěn)定劑0. Γ10 g/L防腐劑0. ΓΙΟ g/L。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，其特征在于試劑1中所述的緩沖液為三羥甲基氨基甲烷緩沖液、3-三羥甲基甲胺-2-羥基丙磺酸緩沖液、4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，其特征在于試劑1中所述的緩沖液為4-羥乙基哌嗪丙磺酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，其特征在于試劑1中所述的去干擾劑為氟化鈉、檸檬酸、半胱氨酸、氨基乙酸中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，其特征在于試劑2中的緩沖液為檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液、咪唑緩沖液、醋酸-醋酸鈉緩沖液中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，其特征在于試劑2中的緩沖液為咪唑緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，其特征在于所述的穩(wěn)定劑為吐溫20、吐溫80、布里杰-35、曲拉通100中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，其特征在于所述的防腐劑為疊氮鈉或proclin系列防腐劑。
全文摘要
本發(fā)明公開一種缺血修飾白蛋白液體穩(wěn)定試劑盒，該試劑盒為由試劑1和試劑2組成的液體型雙試劑，其中試劑1為緩沖液(pH7.5-8.5)0.05~0.5M，氯化鈷20~200mg/L，去干擾劑0.1~10g/L，穩(wěn)定劑0.1~10g/L，防腐劑0.1~10g/L；試劑2為緩沖液(pH7.0-8.0)0.5~10M，二硫蘇糖醇0.5~50g/L，穩(wěn)定劑0.1~10g/L，防腐劑 0.1~10g/L。本發(fā)明的的試劑盒具有準(zhǔn)確度、精密度均較好，穩(wěn)定性好，2～8℃避光保存至少可穩(wěn)定12個(gè)月，完全能滿足臨床檢驗(yàn)要求的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/52GK102507916SQ20111034726
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月7日
發(fā)明者沃燕波, 鄒炳德 申請(qǐng)人:寧波美康生物科技股份有限公司