專利名稱：一種標(biāo)記3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物的方法及檢測試劑盒的制作方法
一種標(biāo)記3, 3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物的方法及檢測試劑合 Sl技術(shù)領(lǐng)域
一種標(biāo)記3，3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物(3，3’ -T2S)的方法及檢測試劑盒，屬于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICLIA)技術(shù)領(lǐng)域，用于對妊娠婦女血清中3，3’ -T2S含量的檢測。
背景技術(shù)：
先天性甲狀腺功能減低癥，簡稱先天性甲減，是由于胚胎期和出生前在某些病因的作用下引起的甲狀腺軸的發(fā)生、發(fā)育和功能代謝出現(xiàn)異常，引起甲狀腺功能減低，嚴(yán)重地影響到中樞神經(jīng)系統(tǒng)和體格等的發(fā)育。
目前胎兒期的甲減篩查還是個世界性難題。對此，國內(nèi)外一些學(xué)者對胎兒甲狀腺功能的檢測做了不少研究。
已有大量實驗顯示3，3'-T2S與胎兒甲狀腺激素代謝有密切關(guān)系，3，3'-T2S是胎兒甲狀腺激素的代謝物，經(jīng)胎盤溢出到母體一側(cè)，造成母體血中其濃度升高，因此，孕婦血清和尿中的3，3’ -T2S濃度可以反映胎兒甲狀腺激素的水平，間接反映胎兒甲狀腺功能狀態(tài)。 目前3，3’ -T2S WRIA檢測方法十分繁瑣、復(fù)雜和耗時，RIA進行標(biāo)記時標(biāo)記物為1251，由于標(biāo)記時會形成的T2S、T3S與T4S,因此分離純化的過程繁瑣及復(fù)雜，且放射性碘的半衰期較短，標(biāo)記物放置后因衰變使放射性降低，因而需要經(jīng)常制備標(biāo)記物，另外放射性核素對環(huán)境保護及工作人員健康都帶來不利影響；RIA操作時，整個檢測的反應(yīng)時間達48小時，而且方法很難自動化，等等，這些限制了 3，3’-T2S檢測的應(yīng)用，從而限制了其在胎兒和新生兒甲狀腺功能篩查中的價值。
光激化學(xué)發(fā)光免疫分析(LICLIA)是以納米級高分子微粒為基礎(chǔ)的新一代化學(xué)發(fā)光技術(shù)，該項技術(shù)將被廣泛地應(yīng)用于研究生物分子的相互作用。LICLIA技術(shù)的核心原理是單線態(tài)氧的產(chǎn)生和傳遞。在受到紅色激光(680 nm)照射后，感光微粒能使周圍環(huán)境中的氧轉(zhuǎn)化為單線態(tài)氧，單線態(tài)氧的生存時間僅為4微秒。短暫的生存時間決定了單線態(tài)氧的傳播直徑很小(約為200 nm)。如果發(fā)光微粒在200 nm范圍之內(nèi)就能接受單線態(tài)氧，并發(fā)出高能級的光(520nm - 620nm)。相反，如果在200 nm直徑范圍內(nèi)沒有發(fā)光微粒，單線態(tài)氧就會回落到基態(tài)氧而沒有信號產(chǎn)生。這種依賴于兩種微粒相互接近的化學(xué)能量傳遞是LICLIA 均相反應(yīng)的基礎(chǔ)。通常在該反應(yīng)體系中，微粒的濃度是很低的。兩種微粒相互隨機碰撞的幾率很低，因此，反應(yīng)體系的本底非常微弱。如果包被在微粒表面的生物分子相互作用，拉近了兩個微粒的距離，例如形成免疫夾心復(fù)合物，這樣就能產(chǎn)生能量的有效傳遞并發(fā)出光信號。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種標(biāo)記3，3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物(3，3’ -T2S)的方法及檢測試劑盒，用于對妊娠婦女血清中3，3’ -T2S含量的檢測。
本發(fā)明的技術(shù)方案發(fā)光微粒標(biāo)記3，3’-T2S的方法在離心管中加入Img發(fā)光微粒，加入12. 5 μ 質(zhì)量濃度 1% Tween-20,0. 05 mg 3，3，-T2S, ΙΟμ 的 25mg/mL 硼氫化氰鈉溶液，用 ρΗ6· 0、0· IM 的 2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液將體積補充到20(^L，37°C避光振蕩反應(yīng)48小時，加入ΙΟμ ρΗ 5. 0、0. 3Μ的羧甲氧基胺半鹽酸鹽溶液封閉未結(jié)合位點，37°C避光孵育1小時，離心純化， 洗去未反應(yīng)的試劑后，分離得到包被有3，3’ -T2S抗原的發(fā)光微粒，即為用發(fā)光微粒標(biāo)記的 3，3’ -T2S，稀釋后備用。
一種3，3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物(3，3’ -T2S)的檢測試劑盒，由白色不透明微孔板1，3，3’ -T2S標(biāo)準(zhǔn)品2，包被有3，3’ -T2S的發(fā)光微粒3，兔抗3，3’ -T2S抗體凍干品4，生物素化羊抗兔抗體凍干品5，和包被有鏈霉親和素的感光微粒6組成。
3，3，-T2S 標(biāo)準(zhǔn)品 2 的配制3, 3，-T2S 標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0 pg/mL, 10 pg/mL, 100 pg/mL, 500 pg/mL，1000 pg/mL, 5000 pg/mL，從 3，3，_T2S 純品中稀釋得到，稀釋液為 30% 乙醇溶液。
用所述的檢測試劑盒檢測3，3’ -T2S的方法，取包被有3，3’ -T2S的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入3，3’ -T2S標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入兔抗3，3’ -T2S抗體、生物素化羊抗兔抗體進行標(biāo)記免疫反應(yīng)；接著在避光處加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進行反應(yīng)，反應(yīng)后檢測光信號，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算被測樣品中的 3，3 —T2S q 早.ο
所述的檢測3，3’ -T2S的方法，操作為取20μ 包被有3，3'-T2S的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μ 的3，3'-T2S 標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20μ 兔抗3，3'-T2S抗體；繼續(xù)加入20μ 生物素化羊抗兔抗體，37°C孵育15分鐘；避光處加175PL包被有鏈霉親和素的感光微粒，37°C暗處孵育15分鐘，反應(yīng)后在光激化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測光信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算被測樣品中的 3，3 —T2S q 早.ο
本發(fā)明的有益效果該標(biāo)記方法結(jié)構(gòu)簡單，操作簡便、檢測時間短、靈敏度高。


圖1 :3，3’ -T2S檢測試劑盒組成示意圖。1、白色不透明微孔板，2、3，3’ -T2S標(biāo)準(zhǔn)品，3、包被有3，3’ -T2S抗原的發(fā)光微粒，4、兔抗3，3’ -T2S抗體凍干品，5、生物素化羊抗兔抗體凍干品，6、包被有鏈霉親和素的感光微粒。
圖2 3, 3，-T2S- LICLIA 反應(yīng)示意圖。
圖 3 3, 3' -T2S- LICLIA 標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施方式
實施例1 發(fā)光微粒標(biāo)記到3，3’ -T2S并制備試劑盒及檢測妊娠婦女血清樣品將發(fā)光微粒標(biāo)記到3，3’ -T2S 在離心管中加入Img發(fā)光微粒，加入12. 5μ 1% Tween-20,0. 05mg 3，3，-T2S, ΙΟμ 的 25mg/mL硼氫化氰鈉溶液，用0. 1M、ρΗ6· 0的2-(N-嗎啉)乙磺酸(MES)緩沖液將體積補充到20(^L，37°C避光振蕩反應(yīng)48小時。加入ΙΟμ 0. 3 M ρΗ 5. 0的羧甲氧基胺半鹽酸鹽 (CMO)溶液封閉未結(jié)合位點，37°C避光孵育1小時后離心，洗去未反應(yīng)的試劑后，分離得到，3’ -T2S抗原的發(fā)光微粒，稀釋后備用。
妊娠婦女血清的制備取妊娠婦女血清加入2倍體積95%的乙醇，-20°C過夜后， 40C 3000r/min離心20min，取其上清備用。
試劑的配制標(biāo)準(zhǔn) 3，3，-T2S 試劑的配制標(biāo)準(zhǔn) 3，3，-T2S 0 pg/mL, 10 pg/mL, 100 pg/mL, 500 pg/ mL，1000 pg/mL，5000 pg/mL，從3，3，-T2S純品中稀釋得到，稀釋液為30%乙醇溶液。
試劑盒的組成(1)、白色不透明微孔板(12條X8孔，可以拆分為單孔)。
(2) ,6X3, 3，-T2S#準(zhǔn)液，1. OmL/瓶，3，3，_T2S標(biāo)準(zhǔn)液濃度為0 pg/mL，10 pg/mL， 100 pg/mL,500 pg/mL,1000 pg/mL,5000 pg/mL。
(3) U X包被有3，3’ -T2S的發(fā)光微粒2mL。
(4)、1 X兔抗3，3’ -T2S抗體凍干品，用時2mL蒸餾水溶解。
(5)、1 X生物素化羊抗兔抗體凍干品，用時2mL蒸餾水溶解。 (6)、1X包被有鏈霉親和素的感光微粒20mL。
測定時注意事項1、使用之前將所有試劑回升至室溫(18-30°C )。
2、使用之后立即將所有試劑放回2_8°C。
3、在所有恒溫孵育過程中，避免光線照射，用蓋子蓋住微孔。
具體檢測步驟如下取20μ 包被有3，3'-T2S的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μ 的3，3'-T2S 標(biāo)準(zhǔn)或經(jīng)處理后妊娠婦女血清到各自的微孔中；加20μ 兔抗3，3’_T2S抗體；繼續(xù)加入20μ 生物素化羊抗兔抗體，37°C孵育15分鐘；避光處加175PL包被有鏈霉親和素的感光微粒， 37°C暗處孵育15分鐘后在光激化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測光信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中的 3，3，-T2S含量。結(jié)果見表1，由標(biāo)準(zhǔn)曲線求得該例血樣1所含3，3，-T2S濃度為796pg/mL, 血樣2所含3，3，-T2S濃度為1851pg/mL。
表
權(quán)利要求
1.發(fā)光微粒標(biāo)記3，3’-T2S的方法，3，3’ - 二碘甲腺氨酸硫酸化物簡稱3，3’ -T2S, 其特征在于在離心管中加入Img發(fā)光微粒，加入12. 5μ 質(zhì)量濃度1% Tween-20,0. 05mg 3，3，-T2S，和肌的25mg/mL硼氫化氰鈉溶液，用ρΗ6. 0、0· IM的2-(N-嗎啉)乙磺酸緩沖液將體積補充到20(^L，37°C避光振蕩反應(yīng)48小時，加入ΙΟμ ρΗ 5. 0、0. 3Μ的羧甲氧基胺半鹽酸鹽溶液封閉未結(jié)合位點，37°C避光孵育1小時，離心純化，洗去未反應(yīng)的試劑后，分離得到包被有3，3’ -T2S的發(fā)光微粒，即為用發(fā)光微粒標(biāo)記的3，3’ -T2S,稀釋后備用。
2.—種3，3’ -T2S的檢測試劑盒，其特征在于應(yīng)用了權(quán)利要求1所述方法制備的包被有3，3’ -T2S的發(fā)光微粒，該檢測試劑盒由白色不透明微孔板(1)，3，3’ -T2S標(biāo)準(zhǔn)品(2)，包被有3，3’ -T2S的發(fā)光微粒(3)，兔抗3，3’ -T2S抗體凍干品(4)，生物素化羊抗兔抗體凍干品(5 )，和包被有鏈霉親和素的感光微粒(6 )組成。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒，其特征在于3，3’-T2S標(biāo)準(zhǔn)品(2)的配制 3，3，-T2S 標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0 pg/mL, 10 pg/mL，100 pg/mL, 500 pg/mL，1000 pg/mL, 5000 pg/mL，從3，3’ -T2S純品中稀釋得到，稀釋液為30%乙醇溶液。
4.一種用權(quán)利要求2所述的檢測試劑盒檢測3，3’ -T2S的方法，其特征在于取包被有 3，3’ -T2S的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入3，3’ -T2S標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中，然后各孔順序加入兔抗3，3’ -T2S抗體、生物素化羊抗兔抗體進行標(biāo)記免疫反應(yīng)；接著在避光處加入包被有鏈霉親和素的感光微粒進行反應(yīng)，反應(yīng)后檢測光信號，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算被測樣品中的3，3’ -T2S含量。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測3，3’-T2S的方法，其特征在于操作為取20μ 包被有 3，3’ -T2S的發(fā)光微粒加入到白色不透明微孔板；加入20μ 的3，3’ -T2S標(biāo)準(zhǔn)或處理好的樣品到各自的微孔中；加20μ 兔抗3，3'-T2S抗體；繼續(xù)加入20μ 生物素化羊抗兔抗體，37°C 孵育15分鐘；避光處加175μ 包被有鏈霉親和素的感光微粒，37°C暗處孵育15分鐘，反應(yīng)后在光激化學(xué)發(fā)光檢測儀上檢測光信號，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計算被測樣品中的3，3’ -T2S含量。
全文摘要
一種標(biāo)記3,3’-二碘甲腺氨酸硫酸化物(3,3’-T2S)的方法及檢測試劑盒，屬于光激化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明首先采用3,3’-T2S與發(fā)光微粒偶聯(lián)，將發(fā)光微粒標(biāo)記到3,3’-T2S上。再由白色不透明微孔板，3,3’-T2S標(biāo)準(zhǔn)品，包被有3,3’-T2S的發(fā)光微粒，兔抗3,3’-T2S抗體凍干品，生物素化羊抗兔抗體凍干品和包被有鏈霉親和素的感光微粒組成檢測試劑盒。發(fā)光微粒上的3,3’-T2S與3,3’-T2S競爭連接到3,3’-T2S抗體，再與生物素化羊抗兔抗體及包被有鏈霉親和素的感光微粒形成復(fù)合體，光激發(fā)下，通過單線態(tài)離子氧的產(chǎn)生和傳遞，將能量傳遞給發(fā)光微粒產(chǎn)生熒光，光信號強度與樣品中3,3’-T2S濃度成反比，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線測得樣品中3,3’-T2S的含量。該3,3’-T2S檢測試劑盒結(jié)構(gòu)簡單，操作簡便、檢測時間短、靈敏度高。
文檔編號G01N33/532GK102507919SQ201110349709
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月8日
發(fā)明者俞惠新, 包建東, 吳興鏞, 周彬, 張玨, 張藝, 王柯, 黃飚 申請人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所