專(zhuān)利名稱(chēng)：注射用重組人甲狀旁腺素及其代謝產(chǎn)物血藥濃度的測(cè)定方法
注射用重組人甲狀旁腺素及其代謝產(chǎn)物血藥濃度的測(cè)定方法技術(shù)領(lǐng)域
注射用重組人甲狀旁腺素rhPTH(1-84)及其代謝產(chǎn)物rhPTH(l_34)血藥濃度的測(cè)定方法，屬于PTH血漿濃度的測(cè)定方法技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
PTH是甲狀旁腺分泌的天然甲狀旁腺素，其中具有生理活性的是含84個(gè)氨基酸殘基的多肽激素，它可以刺激新骨形成和維持正常鈣的平衡及磷代謝。注射用重組人甲狀旁腺素(1~84) (Recombinant human parathyroid hormone (1-84) for injection，簡(jiǎn)寫(xiě)為rhPTH(l-84))是一種含PTH全長(zhǎng)序的重組人甲狀旁腺素，由美國(guó)NPS_Allelix公司研發(fā)，2006年被FDA批準(zhǔn)用于治療婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥。rhPTH(l-84)在體內(nèi)可以部分降解為rhPTH(1-34)，rhPTH(1-34)結(jié)構(gòu)與rhPTH (1-84)的N端34個(gè)氨基酸序列一致， rhPTH(1-34)可以增加骨密度、增強(qiáng)骨質(zhì)和改善骨骼架構(gòu)而成為骨質(zhì)疏松癥的主要治療手段。rhPTH(l-34)由美國(guó)Eli Lilly公司研發(fā)，2002年FDA批準(zhǔn)上市，在治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和部分老年男性骨質(zhì)疏松癥方面具有良好的療效。rhPTH(l-84)具有更好的安全性，兩者均為重要的抗骨質(zhì)疏松癥治療藥物，但由于每天必須服用使得價(jià)格過(guò)于昂貴限制了其臨床應(yīng)用。由于社會(huì)老齡化，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率逐年升高，rhPTH(l-84)因?qū)橇康脑黾有?yīng)比目前臨床應(yīng)用的其他治療手段更有效而具有良好的臨床應(yīng)用前景，國(guó)內(nèi)有多家生物制藥公司在研發(fā)中。
rhPTH(1-84)在體內(nèi)可以降解為不同長(zhǎng)度的肽鏈，由于rhPTH(l_34)具有較高的藥效性，因此測(cè)定rhPTH(1-84)的代謝產(chǎn)物rhPTH(1_34)在血漿中的濃度及藥動(dòng)力學(xué)研究， 對(duì)了解注射用rhPTH(l-84)的藥效學(xué)、作用機(jī)制及臨床合理用藥具有重要意義。
PTH血漿濃度的測(cè)定方法有放射免疫分析(Radioimmunoassay，RIA)、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、高效液相-質(zhì)譜檢測(cè)法(HPLC-MQ等。HPLC-MS法需特殊檢測(cè)器，使用價(jià)格昂貴；ELISA及RIA分析法方法簡(jiǎn)便、操作便利，但由于血漿成分的復(fù)雜性，造成測(cè)定結(jié)果重復(fù)性和穩(wěn)定性差等缺陷。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的提供一種注射用重組人甲狀旁腺素rhPTH(l_84)及其代謝產(chǎn)物 rhPTH(1-34)血藥濃度的測(cè)定方法，采用固相萃取結(jié)合RIA檢測(cè)同時(shí)測(cè)定rhPTH(l_84)在血漿中的濃度以及代謝產(chǎn)物rhPTH(1-34)血漿濃度的變化及藥動(dòng)學(xué)研究。提高了 RIA檢測(cè)的重復(fù)性和穩(wěn)定性，增加了測(cè)定數(shù)據(jù)的可靠性。
本發(fā)明的技術(shù)方案一種注射用重組人甲狀旁腺素rhPTH(l_84)及其代謝產(chǎn)物 rhPTH(l-34)血藥濃度的測(cè)定方法血漿樣本采用固相萃取柱Myre Screen H2P萃取， rhPTH(1-84)采用甲狀腺素放免試劑盒ELSA-PTH測(cè)定rhPTH(l_34)采用甲狀腺素放免試劑盒 RK-055-08 (PTH 1-34)測(cè)定。4
1、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備rhPTH(l-84)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取rhPTH(l-84)標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解振蕩，配制濃度分別為0、對(duì)、55、177、 520pg · mL-1標(biāo)準(zhǔn)品溶液；內(nèi)質(zhì)控(PC)配制成rhPTH(l_84)濃度為46 pg · mL-1的溶液；外質(zhì)控OlC)配制含rhPTH(l-84)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為25、250、500 pg · mL—1三種標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝于離心管中，-80°C保存待用；rhPTH(l-34)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取 rhPTH(l-34)標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液稀釋成 10，20，40，80，160，320，640，1280 pg · mL—1 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；QC質(zhì)控樣品精密稱(chēng)取rhPTH(l-34)標(biāo)準(zhǔn)，用緩沖液配制含rhPTH(l_34)濃度分別為 40. 00、160. 00、640· 00 pg · mL_1 ；所述緩沖液為甲狀腺素放免試劑盒RK-055-08(PTH 1-34)所提供的緩沖液；下同。
2、血漿樣品處理將固相萃取柱Myre Screen H2P用ImL乙醇、ImLO. 1%三氟乙酸去離子水活化；吸取 0. 5mL血漿樣本，以廣2mL/min的速度加入固相萃取柱，樣品富集后用ImL去離子水淋洗，抽干；用乙醇-0. 1%三氟乙酸水(V/V，60:40)溶液洗脫，抽干；使用真空離心蒸發(fā)濃縮器干燥 15min，去掉有機(jī)溶劑；經(jīng)冷凍干燥器濃縮干燥，測(cè)定時(shí)用緩沖液稀釋到合適的濃度； 3、操作流程rhPTH(l-84)測(cè)定操作流程取200μ rhPTH(l-84)標(biāo)準(zhǔn)品或固相萃取處理后的血漿樣品加入ELSA TUBES (固相包被好的ELSA試管，甲狀腺素放免試劑盒ELSA-PTH提供)，分別加入ΙΟΟμ 125I-PTH振蕩3 分鐘，復(fù)管測(cè)試，25°C孵育18士池，棄上清，加3mL吐溫20，5分鐘后棄上清，重復(fù)洗滌4次， Y-count 測(cè)計(jì)數(shù)(CPM)；rhPTH(l-34)測(cè)定操作流程用甲狀腺素放免試劑盒RK-055-08(PTH 1-34)進(jìn)行操作，將聚苯乙烯管編號(hào)總管 (TC)，非特異性結(jié)合(NSB)，總結(jié)合(TB)，標(biāo)準(zhǔn)A H，陽(yáng)性對(duì)照PC，樣品S，雙復(fù)管加樣品加抗體；振蕩混勻后，封口 4°C孵育16 Mh;每管加入100 μ L 125I-PTH后，振蕩混勻后 40C孵育16 Mh;加羊抗兔IgG(GAR)，正兔血清(NRS)，振蕩室溫孵育90分鐘；除TC管外每管加500 μ L緩沖液振蕩混勻，3000rpm離心20分鐘(4°C )，吸棄上清(在15 30分鐘內(nèi)完成)，殘余物Y -counter測(cè)量得~，并計(jì)算B=Bx-NSB。
4、計(jì)算方法 rhPTH(l-84)濃度計(jì)算用CPM對(duì)rhPTH(l-84)濃度作圖，得回歸方程y=ax (Y=19. 791X)。從方程中求得血漿樣品中rhPTH(l-84)濃度，用DAS 2. 0軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
rhPTH(l-34)濃度計(jì)算Y -counter 測(cè)得計(jì)數(shù)按 Btl=TB-NSB, B/B0 (%) = (Bx-NSB) /B0X 100% 計(jì)算，以 B/BQ 為縱坐標(biāo)，rhPTH(l-34)濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，曲線擬合得函數(shù)方程，從方程中求得血漿樣品中 rhPTH(l-34)濃度，用DAS 2. 0軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
本發(fā)明的有益效果本發(fā)明采用添加抑肽酶、固相萃取等多種途徑降低RIA影響因素，考察了不同填料固相小柱的萃取效率，并對(duì)方法學(xué)進(jìn)行了考察，提高了測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性。rhPTH (1-34)的研究較多，但作為rhPTH (1_84)的代謝產(chǎn)物研究其血藥濃度和藥動(dòng)學(xué)未見(jiàn)報(bào)道，本發(fā)明為rhPTH(l-84)進(jìn)入臨床應(yīng)用提供精確的臨床試驗(yàn)檢測(cè)方法。


圖1 rhPTH(1-84)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖2 rhPTH(1-34)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
圖3不同批次rhPTH (1-84)穩(wěn)定性。
圖4 rhPTH(1-84)長(zhǎng)期貯存穩(wěn)定性。
圖5 rhPTH (1-84)和rhPTH (1-34)血藥濃度-時(shí)間曲線圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1線性范圍 rhPTH (1-84)線性范圍取濃度為0、24、55、177、520 pg · mL—1 rhPTH(1-84)標(biāo)準(zhǔn)品溶液；按甲狀腺素放免試劑盒ELSA-PTH操作流程操作，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。采用直線回歸在M 520 pg · mL—1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性回歸方程Y=19.791X(R2=0.9989，圖lb)。分別考察了不同批次的多條線性關(guān)系，PC、QC隨行于標(biāo)準(zhǔn)曲線用于考察測(cè)定精確度(見(jiàn)表1)，各項(xiàng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)測(cè)量值相對(duì)誤差均小于10%。
取rhPTH(l-34)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 10，20，40，80，160，320，640，1280 pg · ml/1 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按甲狀腺素放免試劑盒RK-055-08(PTH 1-34)放免分析操作流程進(jìn)行操作，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。以rhPTH(l-34)標(biāo)準(zhǔn)濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，B/B0為縱坐標(biāo)，采用四參數(shù)logistic 回歸運(yùn)算，得方程Jr =為 + ；為,A1=O. 8462，A2=-28. 1523，x0=13. 8682，p=2. 7849，R2=O. 9961。 ! + (x/je^j)'
實(shí)施例2、精密度和準(zhǔn)確度取QC樣本，按放免操作流程操作，每個(gè)質(zhì)控濃度重復(fù)測(cè)定5次，3天連續(xù)測(cè)定共3個(gè)分析批次，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度和準(zhǔn)確度(表1)，精密度用相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD%)表示，準(zhǔn)確度用相對(duì)誤差(RE%)表示。
表1方法學(xué)確證中的精密度和準(zhǔn)確度(n=5)
權(quán)利要求
1. 一種注射用重組人甲狀旁腺素rhPTH(l-84)及其代謝產(chǎn)物rhPTH(l_34)血藥濃度的測(cè)定方法，其特征在于血漿樣本采用固相萃取柱Myre Screen H2P萃取，rhPTH(l_84) 采用甲狀腺素放免試劑盒ELSA-PTH測(cè)定rhPTH (1-34)采用甲狀腺素放免試劑盒 RK-055-08 (PTH 1-34)測(cè)定；步驟為(1)、標(biāo)準(zhǔn)溶液制備 rhPTH(l-84)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取rhPTH(l-84)標(biāo)準(zhǔn)品，用去離子水溶解振蕩，配制濃度分別為0、對(duì)、55、177、 520pg .mL—1標(biāo)準(zhǔn)品溶液；內(nèi)質(zhì)控PC配制成rhPTH(l_84)濃度為46 pg .mL—1的溶液；外質(zhì)控QC配制含rhPTH(l-84)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為25、250、500 pg .mL-1三種標(biāo)準(zhǔn)溶液，分裝于離心管中，-80°C保存待用；rhPTH(l-34)標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備取 rhPTH(l-34)標(biāo)準(zhǔn)品用緩沖液稀釋成 10，20，40，80，160，320，640，1280 pg · mL—1 的標(biāo)準(zhǔn)溶液；QC質(zhì)控樣品精密稱(chēng)取rhPTH(l-34)標(biāo)準(zhǔn)，用緩沖液配制含rhPTH(l_34)濃度分別為 40. 00、160. 00、640· 00 pg · mL_1 ；所述緩沖液為甲狀腺素放免試劑盒RK-055-08(PTH 1-34)所提供的緩沖液；(2)、血漿樣品處理將固相萃取柱Myre Screen H2P依次用ImL乙醇、ImL含0. 1%三氟乙酸去離子水活化；吸取0. 5mL血漿樣本，以廣2mL/min的速度加入固相萃取柱，樣品富集后用ImL去離子水淋洗，抽干；用V/V為60:40的乙醇-0. 1%三氟乙酸去離子水溶液洗脫，抽干；使用真空離心蒸發(fā)濃縮器干燥15min，去掉有機(jī)溶劑；經(jīng)冷凍干燥器濃縮干燥，測(cè)定時(shí)用緩沖液稀釋到合適的濃度；(3)、操作流程rhPTH(l-84)測(cè)定操作流程取200μ rhPTH(l-84)標(biāo)準(zhǔn)品或處理后的血漿樣品加入ELSA TUBES，分別加入ΙΟΟμ 125I-PTH振蕩3分鐘，復(fù)管測(cè)試，25°C孵育18士池，棄上清，加3mL吐溫20，5分鐘后棄上清， 重復(fù)洗滌4次，γ -count測(cè)計(jì)數(shù)CPM ；所述ELSA TUBES為甲狀腺素放免試劑盒ELSA-PTH提供的固相包被好的ELSA試管； rhPTH(l-34)測(cè)定操作流程將聚苯乙烯管編號(hào)總管TC，非特異性結(jié)合NSB，總結(jié)合TB，標(biāo)準(zhǔn)A H，陽(yáng)性對(duì)照PC， 樣品S，雙復(fù)管加樣品加抗體；振蕩混勻后，封口 4°C孵育16 Mh;每管加入100 μ L 125I-PTH后，振蕩混勻后4°C孵育16 Mh ；加羊抗兔IgG即GAR，正兔血清NRS，振蕩室溫孵育90分鐘；除TC管外每管加500 μ L緩沖液振蕩混勻，40C 3000rpm離心20分鐘，在15 30分鐘內(nèi)吸棄上清，殘余物Y -counter測(cè)量得~，并計(jì)算B=Bx-NSB ；(4)、計(jì)算方法 rhPTH(l-84)濃度計(jì)算用CPM對(duì)rhPTH(l-84)濃度作圖，以CPM值為縱座標(biāo)，rhPTH(l_84)濃度為橫坐標(biāo)作圖， 得回歸方程Y=19. 791Χ，從方程中求得血漿樣品中rhPTH(l-84)濃度，用DAS 2. 0軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)；rhPTH(l-34)濃度計(jì)算Y -counter 測(cè)得計(jì)數(shù)按 Btl=TB-NSB, B/B0 (%) = (Bx-NSB) /B0X 100% 計(jì)算，以 B/BQ 為縱坐標(biāo)，rhPTH(l-34)濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，曲線擬合得函數(shù)方程，從方程中求得血漿樣品中 rhPTH(l-34)濃度，用DAS 2. 0軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。
全文摘要
注射用重組人甲狀旁腺素rhPTH(1-84)及其代謝產(chǎn)物rhPTH(1-34)血藥濃度的測(cè)定方法，屬PTH血漿濃度測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明用固相萃取結(jié)合放射免疫分析(RIA)法，血漿樣本采用固相萃取柱StyreScreen H2P萃取，rhPTH(1-84)用甲狀腺素放免試劑盒ELSA-PTH測(cè)定取rhPTH(1-84)標(biāo)準(zhǔn)品或處理后的血漿樣品加入ELSATUBES，再加入125I-PTH，復(fù)管測(cè)試，γ-count測(cè)計(jì)數(shù)CPM；以CPM值為縱座標(biāo)，rhPTH(1-84)濃度為橫坐標(biāo)作圖，得回歸方程Y=19.791X；rhPTH(1-34)用甲狀腺素放免試劑盒RK-055-08(PTH1-34)測(cè)定；將雙復(fù)管加樣品加抗體；孵育；每管加入125I-PTH后，振蕩混勻后孵育；加羊抗兔，正兔血清，孵育；γ-counter測(cè)計(jì)數(shù)B，按B0=TB-NSB，以B/B0為縱坐標(biāo)，rhPTH(1-34)濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)作圖，得函數(shù)方程。本發(fā)明提高了RIA檢測(cè)的重復(fù)性和穩(wěn)定性，增加了測(cè)定數(shù)據(jù)的可靠性。
文檔編號(hào)G01N33/78GK102507960SQ201110352049
公開(kāi)日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月9日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月9日
發(fā)明者周杏琴, 張建康, 徐希杰, 曹?chē)?guó)憲, 蔡剛明, 鄒美芬, 欽曉峰 申請(qǐng)人:江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所