專利名稱：采用金屬氧化物富集糖肽的通用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生化分析領(lǐng)域，具體地說是一種金屬氧化物在富集糖肽中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
蛋白質(zhì)糖基化是一種存在最為普遍的翻譯后修飾過程。約50%以上的蛋白質(zhì)存在糖基化現(xiàn)象。蛋白質(zhì)糖基化涉及到細(xì)胞免疫、受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等許多生物過程。已有研究表明糖蛋白的異常與某些疾病有著密切關(guān)系。另外，一些糖蛋白由于其特殊的生物功能已經(jīng)被開發(fā)成藥物。因此對(duì)糖蛋白進(jìn)行深入的研究可以更好的認(rèn)識(shí)和解釋生命現(xiàn)象，揭示疾病的發(fā)生過程，并且對(duì)于疾病早期診斷和新靶點(diǎn)藥物開發(fā)具有重要作用。但由于糖蛋白樣品經(jīng)酶解后酶解液中糖肽豐度非常低，并且糖肽在質(zhì)譜中受非糖肽的離子抑制，導(dǎo)致糖蛋白的結(jié)構(gòu)分析非常具有挑戰(zhàn)性。因此，在質(zhì)譜分析前對(duì)糖肽進(jìn)行富集是非常必要的。近年來，糖肽的富集方法主要有凝集素親和色譜法、肼化學(xué)法、硼酸親和色譜法及親水作用色譜法。凝集素親和色譜法是應(yīng)用最廣、選擇性好，但存在糖基化覆蓋率低的問題[Kubota, K.；Sato, Y.；Suzuki, Y.et al.Anal.Chem.2008,80, 3693];餅化學(xué)對(duì)糖妝的高選擇性使其在高通量的N-型糖蛋白位點(diǎn)鑒定中獲得了很好的應(yīng)用，但是該方法存在糖基化覆蓋率低和丟失糖鏈的信息等問題[Zhang, H.；Li, X.J.；Martin, D.B.；Aebersold,R.Nat.Biotechnol.2003,21,660.];硼酸親和色譜法能與順勢(shì)二醇形成硼酸酯結(jié)構(gòu)也可以用來富集糖肽，但這種方法的費(fèi)時(shí)較長[Zhou, ff.；Yao, N.；Yao, G.P.；Deng, C.Η.；Zhang,X.Μ.;Yang，P.Y.Chem.Commun.2008,5577.]。親水作用色譜可富集不同類型的糖肽，糖基化覆蓋率高，但是容易受到具有相當(dāng)極性的非糖肽的干擾[Wada，Y.；Tajiri, M.；Yoshida,
S.Anal.Chem.2004，76,6560.]。因此需要開發(fā)對(duì)糖肽選擇性高、糖基化覆蓋率廣的富集方法。近年，氧化鈦在親水作用色譜模式下被用來富集含有唾液酸的糖肽和中性糖肽[Yan, J., Li, X., Yu, L.，Jin, Y.，et al.，Chem.Commun.2010,46, 5488]。該方法可以實(shí)現(xiàn)糖肽的高選擇性富集，但是不同的糖肽需要不同的沖洗和洗脫條件，導(dǎo)致方法的通用性不夠，不適合未知的、復(fù)雜樣品。另外，氧化鈦在親水作用色譜模式下富集糖肽，所采用的上樣條件是中性、沖洗條件和洗脫條件都酸性。因此針對(duì)氧化鈦材料需要開發(fā)通用性的糖肽富集方法，采用酸性的上樣條件和堿性的淋洗條件和洗脫條件，以便于實(shí)際復(fù)雜生物樣品的分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有具有選擇性高、糖基化覆蓋率廣、通用性廣、操作簡(jiǎn)單和重復(fù)性好的糖肽富集方法，能對(duì)痕量糖肽進(jìn)行選擇性富集。具體操作時(shí)采用萃取模式模式，過程如下:I)將氧化鈦裝入萃取柱中，采用沖洗液平衡柱子，將糖蛋白酶解物(pH2-6)上到柱上，金屬氧化物材料與糖蛋白酶解物重量比例為10-200: I ；
2)采用2-50倍金屬氧化物材料柱體積的pH 7-10的0_50 %淋洗溶液沖洗，去處非糖肽；重復(fù)此步驟1-10次；3)采用2-50倍金屬氧化物材料柱體積的pH 10.1-14的0_50%洗脫溶液洗脫糖肽。重復(fù)此步驟1-10次。具體操作時(shí)采用離心模式，過程如下；I)將糖蛋白酶解物(pH 2-6)直接與金屬氧化物(材料與糖蛋白酶解物質(zhì)量比例為10-200: I)混合，孵化0.5分鐘-1小時(shí)，離心，棄上層溶液，收集沉淀；2)離心后的金屬氧化物與2 50倍材料柱體積的pH為7_10的0_50%淋洗溶液混合，孵化0.5分鐘-1小時(shí)，離心，棄上層溶液，收集沉淀；重復(fù)此步驟1-10次；3)離心后的金屬氧化物與2 50倍材料柱體積的pH為10.1-14的0_50%洗脫溶液混合，孵化0.5分鐘-1小時(shí)，離心，收集上清液，得到糖肽。重復(fù)此步驟1-10次。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):1.本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于金屬氧化物富集糖肽時(shí)表現(xiàn)出了高選擇性、高糖基化覆蓋率、通用性廣等特點(diǎn)，可以實(shí)現(xiàn)糖肽的有效富集；2.本發(fā)明涉及的金屬氧化物既可以方便的裝填成不同長度，不同內(nèi)徑的柱子，又可以直接添加與離心管，操作簡(jiǎn)單，易于重復(fù)。特別適合微量生物樣品中糖肽段的富集；3.本發(fā)明富集得到的糖肽可直接用于電噴霧-質(zhì)譜分析(ES1-MS)或者基質(zhì)輔助激光解吸電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALD-TOF MS)，提高了質(zhì)譜的檢測(cè)限和靈敏度。


圖1商品化氧化鈦微球?qū)?biāo)準(zhǔn)糖蛋白轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解產(chǎn)物中糖肽富集前后的電噴霧質(zhì)譜圖。(a)經(jīng)氧化鈦富集后的質(zhì)譜圖；(b)未經(jīng)富集的質(zhì)譜圖。糖肽標(biāo)示為星號(hào)。圖2商品化氧化鈦微球?qū)?biāo)準(zhǔn)糖蛋白胎球蛋白的酶解產(chǎn)物中糖肽富集前后的電噴霧質(zhì)譜圖。(a)未經(jīng)富集的質(zhì)譜圖；(b)經(jīng)氧化鈦富集后的質(zhì)譜圖。糖肽標(biāo)示為星號(hào)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的目的在于提供一種金屬氧化物富集糖肽的方法，該方法可在固相萃取模式或者離心模式下進(jìn)行，具有操作簡(jiǎn)單，通量高和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)。下面結(jié)合附圖通過具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受這些實(shí)施例的限制。本發(fā)明以下實(shí)施例所使用的一種金屬氧化物材料為商品化氧化鈦(GLSciences，東京，日本)O樣品溶液的制備:lmg的單一標(biāo)準(zhǔn)糖蛋白(包括轉(zhuǎn)鐵蛋白和肽球蛋白)溶解于ImL8M尿素/50mM碳酸氫銨溶液中(pH 8.2，)，溫育4h，加入4 μ L 50mM的二硫蘇糖醇溶液在37°C反應(yīng)2h。加入4yL 50mM的碘代乙酸，室溫避光靜置30min，經(jīng)過上述處理，蛋白完全變性，二硫鍵被打開，巰基被封閉。再按照蛋白與胰蛋白酶的質(zhì)量比40: I (w/w)的比例加入胰蛋白酶進(jìn)行酶解37V反應(yīng)16小時(shí)。實(shí)施例1將Img氧化鈦裝入凝膠吸頭中，10μ L轉(zhuǎn)鐵蛋白蛋白酶解液(見樣品溶液的制備)(pH 3)上樣后，分別用30 μ L體積濃度為0.25%氨水溶液洗脫兩次(pH 10);最后用30 μ L含有體積濃度為10%氨水溶液(PH= 12)洗脫兩次，得到糖肽。富集后的糖肽用質(zhì)譜進(jìn)行分析。由圖1可見，轉(zhuǎn)鐵蛋白酶解產(chǎn)物中的糖肽能被氧化鈦特異性的富集和純化。實(shí)施例2調(diào)整富集的操作模式為離心，將Img氧化鈦裝入離心管中，與5μ L肽球蛋白酶解液(pH 3)混合，孵化5min，離心后收集沉淀；沉淀再用30 μ L的體積濃度為10%CH3CN/0.1 % NH4OH (pH 10)孵化5min，收集沉淀。沉淀與30 μ L含有體積濃度為0.25%氨水溶液(PH = 10)孵化5min，離心后收集沉淀，重復(fù)此孵化和離心步驟2次；最后沉淀與30 μ L含有體積濃度為10%氨水(PH= 12)孵化5min，離心后收集上清液，得到糖肽。各上清液直接在MALD1-T0F質(zhì)譜上分析。由圖2可見，胎球蛋白酶解產(chǎn)物中糖肽被氧化鈦異性性的富集和純化。實(shí)施例3-6調(diào)整金屬氧化物材料的重量為2mg、3mg、6mg、10mg,其他條件同實(shí)施例1,富集后得到的糖肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在萃取模式操作模式下Img的材料可以有效地保留和富集糖蛋白標(biāo)準(zhǔn)品酶解液中的糖妝。實(shí)施例7-10調(diào)整蛋白酶解液的上樣量為20pmol、40pmol、80和200pmol，其他條件同實(shí)施例1，富集后得到的糖肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在萃取模式操作模式下Img的材料可以有效地保留和富集80pmol的蛋白中的糖肽。實(shí)施例11-14調(diào)整洗脫溶液的氨水體積濃度為5%、12%、15%和20%，其他條件同實(shí)施例1，進(jìn)行選擇性富集和質(zhì)譜分析。實(shí)施例15-18調(diào)整洗脫溶液的體積為50 μ L、100 μ L、150 μ L和200 μ L，其他條件同實(shí)施例1，進(jìn)
行選擇性富集和質(zhì)譜分析。實(shí)施例19-22調(diào)整金屬氧化物材料的重量為2mg、3mg、6mg、10mg，其他條件同實(shí)施例2，富集后得到的糖肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在離心操作模式下Img的材料可以有效地保留和富集蛋白中的糖肽。實(shí)施例23-25調(diào)整蛋白酶解液的上樣量為20pmol、40pmol和160pmol，其他條件同實(shí)施例2，富集后得到的糖肽進(jìn)行質(zhì)譜分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在離心操作模式下Img的材料可以有效地保留和富集蛋白中的糖肽。實(shí)施例26-29調(diào)整洗脫溶液氨水體積濃度為5%、12%、15%和20%，其他條件同實(shí)施例2，進(jìn)行選擇性富集和質(zhì)譜分析。實(shí)施例30-33調(diào)整洗脫溶液的體積為50 μ L、100 μ L、150 μ L和200 μ L，其他條件同實(shí)施例2，進(jìn)
行選擇性富集和質(zhì)譜分析。本發(fā)明氧化鈦對(duì)于糖肽具有很好的選擇性富集性能，和常規(guī)的親水作用色譜材料相比，氧化鈦富集糖肽具有更高選擇性，更高糖肽回收率和更好的重復(fù)性。利用氧化鈦對(duì)于糖肽的高效的特異性吸附能力，可以將其應(yīng)用于復(fù)雜體系中糖肽的選擇性富集，結(jié)合質(zhì)譜，該材料在翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
權(quán)利要求
1.利用金屬氧化物富集純化糖肽的通用方法，其特征在于: 采用金屬氧化物材料與糖蛋白酶解物接觸，調(diào)整淋洗和洗脫條件，選擇性富集糖肽； 所述金屬氧化物材料包括氧化鈦、氧化鋯、氧化鋁、或者這些金屬的復(fù)合金屬氧化物中的一種或二種以上，金屬氧化物材料的粒徑大小為0.2-100微米，孔道直徑大小為1-100納米; 這些金屬的復(fù)合金屬氧化物是指金屬鈦、鋯、鋁中二種或三種的復(fù)合金屬氧化物。
2.按照權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于: 具體操作采用固相萃取模式或離心模式； 在固相萃取(SPE)模式下采用金屬氧化物材料富集糖肽時(shí)，將糖蛋白酶解物上到以金屬氧化物材料為填料的SPE柱上，采用淋洗溶液沖洗去除非糖肽后，利用洗脫溶液富集出糖肽； 或在離心模式下采用金屬氧化物材料富集糖肽時(shí)，將糖蛋白酶解物與金屬氧化物直接混合，采用淋洗溶液在離心方式下去除非糖肽后，利用洗脫溶液在離心方式下富集出糖肽。
3.按照權(quán)利要求2所述糖肽富集方法，其特征在于: 樣品的上樣量為金屬氧化物材料與糖蛋白酶解物質(zhì)量比例為3-200: 1，上樣溶液的pH為2-6 ;富集溫度為15-60°C;糖蛋白可以是免疫球蛋白、胎球蛋白、核糖核酸酶B和轉(zhuǎn)鐵蛋白中一種或二種以上。
4.按照權(quán)利要求2或3所述糖肽富集方法，其特征在于: 去除非糖肽時(shí)采用的淋洗溶液是體積濃度為O - 5 O %的乙腈、甲醇或乙醇溶液，P H7-10 ； 洗脫糖肽是采用的洗脫溶液是體積濃度為0-50%的乙腈、甲醇或乙醇溶液，pH10.1-14。
5.按照權(quán)利要求4所述糖肽富集方法，其特征在于: 采用2 50倍金屬氧化物材料柱體積的淋洗溶液去除非糖肽，淋洗2-20次； 采用2 50倍金屬氧化物材料柱體積的洗脫溶液富集糖肽，洗脫2-20次。
6.按照權(quán)利要求2所述糖肽富集方法，其特征在于: 采用離心模式， 1)糖蛋白酶解物直接與金屬氧化物材料孵化時(shí)間0.5分鐘-1小時(shí)，離心，棄上層溶液，收集沉淀； 2)離心后的金屬氧化物材料與淋洗溶液孵化時(shí)間0.5分鐘-1小時(shí)，離心，收集沉淀；此過程重復(fù)1-10次； 3)離心后的金屬氧化物材料與洗脫溶液孵化時(shí)間0.5分鐘-1小時(shí)，離心，收集上清液；此過程重復(fù)1-10次。
7.按照權(quán)利要求2所述糖肽富集方法，其特征在于: 采用萃取模式， 1)將氧化鈦裝入萃取柱中，采用沖洗液平衡柱子，將PH2-6糖蛋白酶解物上到柱上，金屬氧化物材料與糖蛋白酶解物重量比例為10-200: I ； 2)采用2-50倍金屬氧化物材料柱體積的pH7-10的0-50%淋洗溶液沖洗，去處非糖肽；重復(fù)此步驟1-10次；3)采用2-50倍金屬氧化物材料柱體積的pH 10.1-14的0-50%洗脫溶液洗脫糖肽；重復(fù)此步驟1_10次。`
全文摘要
本發(fā)明涉及生化分析領(lǐng)域，公開了一種富集糖肽的方法。本方法使用金屬氧化物為富集材料，通過優(yōu)化上樣、淋洗和洗脫條件，實(shí)現(xiàn)了對(duì)糖肽的選擇性富集。該方法具有糖肽選擇性高、糖基化覆蓋率廣、通用性廣、操作簡(jiǎn)單和重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，適用于復(fù)雜體系中糖肽的選擇性富集，結(jié)合質(zhì)譜，該方法在翻譯后修飾蛋白質(zhì)組學(xué)研究等領(lǐng)域具有廣闊的實(shí)用前景。
文檔編號(hào)G01N1/40GK103105327SQ20111035823
公開日2013年5月15日 申請(qǐng)日期2011年11月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月11日
發(fā)明者李秀玲, 閆竟宇, 梁鑫淼 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所