專(zhuān)利名稱(chēng)：一種基于電化學(xué)DNA生物傳感器的Pb²⁺、Hg²⁺同時(shí)測(cè)定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā) 明屬于分析化學(xué)和化學(xué)傳感器技術(shù)領(lǐng)域，涉及ー種基于汞離子、鉛離子誘導(dǎo)DNA構(gòu)型發(fā)生改變的電化學(xué)DNA傳感器的制備方法，并將所制備的傳感器應(yīng)用于實(shí)際水體系兩種離子低濃度時(shí)的同時(shí)檢測(cè)及単獨(dú)檢測(cè)。該方法可有效分析重金屬離子在環(huán)境中的污染特點(diǎn)，構(gòu)建環(huán)境污染事故的應(yīng)急監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，采用電化學(xué)傳感器方法對(duì)有毒重金屬離子的檢測(cè)已成為研究熱點(diǎn)之一。與基于生物催化(酶、微生物等)和免疫原理的生物傳感器相比，DNA除了能夠特異性識(shí)別小分子，還具有識(shí)別層十分穩(wěn)定，受環(huán)境干擾和限制少，并且易于合成或再生以供重復(fù)利用等優(yōu)點(diǎn)，諸多優(yōu)勢(shì)使得電化學(xué)DNA傳感器作為ー種新型的檢測(cè)技術(shù)在環(huán)境監(jiān)測(cè)領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。汞離子和鉛離子作為“優(yōu)先管理有害物質(zhì)名単”上的兩種重要金屬離子，因能對(duì)人體及環(huán)境產(chǎn)生毒害影響而備受人們關(guān)注。如今發(fā)展迅速的電化學(xué)和光學(xué)傳感技術(shù)，如基于熒光探針、金納米粒子、DNA酶、半導(dǎo)體量子點(diǎn)和碳納米管等方法，因具有操作簡(jiǎn)單、靈敏度高、分析成本低等優(yōu)點(diǎn)，逐漸被廣泛應(yīng)用于Hg2+和Pb2+的檢測(cè)。Tang等基于Hg2+對(duì)T-T堿基對(duì)結(jié)構(gòu)的特異性識(shí)別作用，通過(guò)觀察嵌插劑插入到雙鏈DNA前后電化學(xué)信號(hào)的改變情況，作為檢測(cè)汞離子的依據(jù)。Chang等利用能與Pb2+特異結(jié)合的脫氧核酶和微制作電泳裝置制造了一種簡(jiǎn)單、微型化和具有選擇性的DNA傳感器，對(duì)Pb2+的檢測(cè)濃度達(dá)到了 llnM。盡管這些方法都可以實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+和Pb2+的選擇性檢測(cè)，但絕大部分都針對(duì)單一金屬離子進(jìn)行研究，應(yīng)用同一種DNA探針同時(shí)對(duì)兩種離子進(jìn)行測(cè)量的方法卻鮮有報(bào)道。Liu等利用一條標(biāo)記有熒光基團(tuán)的DNA探針，基于汞離子和鉛離子引起DNA構(gòu)型發(fā)生改變引起的光化學(xué)信號(hào)的變化情況，成功對(duì)Hg2+和Pb2+實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測(cè)。但是該方法引入了有毒的NaCN掩蔽劑，并且存在較高的背景信號(hào)干擾和較低的靈敏度等缺點(diǎn)，因而在實(shí)際檢測(cè)中受到多方面因素的限制。如上所述，目前在利用電化學(xué)DNA傳感器對(duì)重金屬離子的檢測(cè)方面，仍缺乏對(duì)兩種及其以上金屬離子同時(shí)測(cè)定的研究，不利于實(shí)現(xiàn)多目標(biāo)物的分析檢測(cè)，因而開(kāi)發(fā)出ー種能同時(shí)檢測(cè)多種離子的傳感檢測(cè)技術(shù)，在完善我國(guó)現(xiàn)有檢測(cè)技術(shù)手段，構(gòu)建污染事故應(yīng)急監(jiān)測(cè)系統(tǒng)方面具有現(xiàn)實(shí)意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的內(nèi)容就是提供ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法，并通過(guò)弓I入掩蔽劑可以有效實(shí)現(xiàn)對(duì)兩種離子的檢測(cè)。本發(fā)明的技術(shù)方案如下基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法，包括以下步驟I電極的預(yù)處理與活化
將金電極在鹿皮拋光布上用Al2O3粉末拋光至鏡面，依次在こ醇和去離子水中超聲，然后在H2SO4溶液中進(jìn)行活化處理，用去離子水沖洗干凈，用氮?dú)獯蹈桑纯傻玫奖砻娓蓛舻慕痣姌O。2 DNA修飾電極的制備將活化的金電極浸泡在一定濃度的DNA雜化溶液中，室溫下靜置4-5天。巰基修飾的DNA通過(guò)Au-S鍵作用自組裝于金電極表面，得到DNA修飾電極。3 DNA生物傳感器對(duì)不同単一金屬離子體系的檢測(cè)將DNA修飾電極在K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]溶液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)量，測(cè)完后用緩沖溶液淋洗，并分別放置在一定濃度的Hg2+、Pb2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+等溶液中作用，然后再進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)量，比較作用前后阻抗值的變化。
4 DNA生物傳感器對(duì)Hg2+和Pb2+共存體系中的單獨(dú)檢測(cè)將DNA修飾電極分別依次放置在Hg2++cysteine及Hg2++cysteine+Pb2+溶液中，Pb2++G-DNA及Pb2++G-DNA+Hg2+溶液中作用，并分別對(duì)作用后的DNA修飾電極進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)量，分別比較作用前后阻抗值的變化。與現(xiàn)有技術(shù)相比本專(zhuān)利技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)I.本發(fā)明所采用的DNA序列可特異性識(shí)別Hg2+和Pb2+，能排除其它常見(jiàn)ニ價(jià)金屬離子對(duì)體系的干擾，對(duì)Hg2+和Pb2+的檢測(cè)具有較好的選擇性；2.本發(fā)明是通過(guò)Au-S鍵將DNA組裝于金電極表面，該方法得到的DNA膜表面結(jié)構(gòu)高度有序，穩(wěn)定性好，受環(huán)境干擾和限制少；3.本發(fā)明所采用的電化學(xué)交流阻抗法是研究電極界面現(xiàn)象的ー種重要手段，可靈敏的表征電極表面DNA構(gòu)型的變化情況，能實(shí)現(xiàn)對(duì)Hg2+和Pb2+的高靈敏度檢測(cè)；4.本發(fā)明所米用的掩蔽劑-半胱氨酸和G-DNA均屬于生物試劑,不具有毒性。


圖I為裸電極(·)及DNA修飾電極(ロ)的阻抗譜圖。圖2為DNA膜與Hg2+(KT6M)和Pb2+(KT6M)作用前后的阻抗譜圖DNA膜(□)，與Hg2+ 作用(▲ )，Pb2+ 作用(·)。圖3為電荷傳遞電阻的變化值Λ Rct與Hg2+和Pb2+濃度對(duì)數(shù)關(guān)系曲線，(·)為空白對(duì)照。圖4為DNA修飾電極對(duì)不同金屬離子的Λ Rct響應(yīng)情況。圖5為DNA修飾電極與加入掩蔽劑的金屬離子作用前后的阻抗譜圖，(A)DNA 膜(□ )，Cys+Hg2+( · )，Cys+Hg2+Pb2+( ▲ ) ;(B)DNA 膜(□ )，G_DNA+Pb2+( ·)，G-DNA+Pb2++Hg2+( ▲)。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做更詳細(xì)的描述，但所述實(shí)施不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。實(shí)施例I :Hg2+單獨(dú)的檢測(cè)將制備的DNA修飾電極用緩沖溶液充分淋洗后，在K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)量。測(cè)完后洗凈電極，然后分別放置在不同濃度的H2+溶液中作用，用Tris-ClO4緩沖溶液沖洗后再進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。作用前后DNA修飾電極膜電容和膜電阻等的變化見(jiàn)表I。表IDNA修飾電極與Hg2+作用前后的阻抗數(shù)據(jù)擬合結(jié)果
權(quán)利要求
1.ー種基于電化學(xué)DNA生物傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法，其特征在于包括以下步驟 (A)電極的預(yù)處理與活化 將金電極在拋光布上用Al2O3粉末拋光至鏡面，依次在こ醇和去離子水中超聲，然后在H2SO4溶液中進(jìn)行活化處理，用去離子水沖洗干凈，用氮?dú)獯蹈?，即可得到表面干凈的金電扱。
(B)DNA修飾電極的制備 將活化的金電極浸泡在一定濃度的雜化DNA溶液中，室溫下靜置4-5天。巰基修飾的DNA通過(guò)Au-S鍵作用自組裝于金電極表面，得到DNA修飾電極。
(C)DNA生物傳感器對(duì)不同単一金屬離子體系的檢測(cè) 將DNA修飾電極在K3 [Fe (CN) 6] /K4 [Fe (CN) 6]溶液中進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)量，測(cè)完后用緩沖溶液淋洗，并分別放置在一定濃度的 Hg2+、Pb2+、Co2+、Ca2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Cu2+、Cd2+、Zn2+等溶液中作用，然后再進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)量，比較作用前后阻抗值的變化。
(D)DNA生物傳感器對(duì)Hg2+和Pb2+共存體系中的單獨(dú)檢測(cè) 將DNA修飾電極分別依次放置在Hg2++cy steine及Hg2++cysteine+Pb2+溶液中，Pb2++G-DNA及Pb2++G-DNA+Hg2+溶液中作用，并分別對(duì)作用后的DNA修飾電極進(jìn)行電化學(xué)阻抗測(cè)量，分別比較作用前后阻抗值的變化。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(A)所述拋光布為鹿皮拋光布，Al2O3粉末粒徑為O. 05 μ m, H2SO4濃度為1M。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(A)所述依次在こ醇、去離子水中超聲，超聲時(shí)間分別為3min。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(A)所述電極用去離子水沖洗后，用高純N2吹干。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(B)所述雜化DNA包含三部分巰基修飾的DNA片段，Pb2+特異性識(shí)別酶DNAzyme, Hg2+ 特異性識(shí)別 DNA 片段 substrate DNA。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(B)所述雜化DNA溶液的濃度為10/3 μ Μ，溶液為高離子強(qiáng)度的Tris-ClO4緩沖溶液，pH = 7. 4。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(B)所述DNA雜化的溫度為常溫，雜化時(shí)間為一天。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(B)所述雜化后DNA與金電極作用時(shí)間為4-5天，溫度為室溫。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(C)所述電化學(xué)阻抗測(cè)量在封閉的法拉第箱中進(jìn)行，電化學(xué)阻抗測(cè)量采用三電極系統(tǒng)，其中Ag/AgCl (飽和KCl溶液)為參比電極，鉬絲為對(duì)電極。
10.根據(jù)權(quán)利要求I一種所述基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(C)所述K3 [Fe (CN)6]/K4 [Fe (CN)6]溶液的濃度為4mM。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟(C)所述該傳感器只對(duì)Pb2+、Hg2+有選擇性，而對(duì)其它金屬離子無(wú)選擇性作用。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述ー種基于電化學(xué)DNA傳感器的Pb2+、Hg2+同時(shí)測(cè)定方法,其特征在于步驟Φ)所述G-DNA為Pb2+特異性識(shí)別DNA片段，濃度為10 μ Μ。
全文摘要
本發(fā)明涉及基于汞離子、鉛離子誘導(dǎo)DNA構(gòu)型發(fā)生改變的電化學(xué)DNA傳感器的制備及其應(yīng)用，屬于分析化學(xué)和化學(xué)傳感器技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)含有兩部分功能區(qū)——能夠特異性識(shí)別汞、鉛兩種離子的DNA序列，并將其組裝于金電極表面制成電化學(xué)DNA生物傳感器。本發(fā)明所制備的傳感器既可應(yīng)用于實(shí)際水體中汞離子和鉛離子單一體系的檢測(cè)，亦可通過(guò)引入掩蔽劑實(shí)現(xiàn)混合體系中兩種離子的單獨(dú)檢測(cè)。該DNA傳感器制備方法條件溫和，簡(jiǎn)單方便，穩(wěn)定性好，此外，該傳感器具有有高特異性、高靈敏度和高選擇性的優(yōu)點(diǎn)，且操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)無(wú)需標(biāo)記。
文檔編號(hào)G01N27/02GK102721728SQ201110362079
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者劉新會(huì), 成登苗, 李曉宏, 梁剛, 石柳 申請(qǐng)人:北京師范大學(xué)