專利名稱：一種基于功能化金納米顆粒的酪氨酸酶活性分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于一種基于功能化金納米顆粒的酪氨酸酶活性分析方法，屬于分析化學技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
酪氨酸酶(EC 1. 14. 18. 1，Tyrosinase)，又稱為多酚氧化酶，是一種含銅的金屬酶，廣泛分布于微生物、動植物及人體中。酪氨酸酶主要參與兩個反應過程催化L-酪氨酸羥基化轉(zhuǎn)變?yōu)長-多巴和氧化L-多巴形成多巴醌，多巴醌經(jīng)一系列反應后形成黑色素。酪氨酸酶在生物體中具有重要的生理功能，是黑色素生物合成途徑中的關(guān)鍵酶，與人體雀斑、 褐斑等黑色素過度沉積等疾病的發(fā)生有關(guān)，與昆蟲的蛻皮和果蔬的褐化也有很大關(guān)系。因此對酪氨酸酶的活性水平的檢測，不僅能為臨床疾病如惡性黑色素瘤等診斷和治療提供依據(jù)，同時在食品工業(yè)中果蔬保鮮及環(huán)境監(jiān)測等多個領(lǐng)域有重要的意義。目前國內(nèi)外已經(jīng)有報道的關(guān)于酪氨酸酶的活性測定的方法主要包括分光光度法、 免疫檢測法、放射性同位素檢測法、高效液相色譜法、熒光檢測法等。但這些方法都存在一些局限性。分光光度法操作相對簡單，分析時間較短因而是目前酪氨酸酶活性分析中最為常用的方法，但該方法存在著一些不足之處，包括L-左旋多巴的成本較高，檢測靈敏度不夠高，如果樣品組分復雜則干擾因素較多，對于組織細胞樣品中的酶活性進行分析時存在缺陷；免疫檢測、放射性同位素、高效液相色譜、熒光檢測法等方法操作復雜、分析時間長、 分析成本高等，因此很難發(fā)展成通用的分析手段。近年來一些基于納米材料或聚合物的電化學、熒光等方法用于酪氨酸酶的活性分析也得到報道，但是這些方法在檢測限、靈敏度或者是檢測的線性范圍等方面都存在一定的缺陷，尚不能應用于對不同生物來源的樣品中酪氨酸酶活性進行定量分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是將納米生物技術(shù)、光譜學檢測等諸多技術(shù)的優(yōu)勢聯(lián)合起來，建立一種簡便快速、成本低，而又具有極高靈敏度的酪氨酸酶活性分析方法。本發(fā)明的技術(shù)方案一種基于功能化金納米顆粒的酪氨酸酶活性分析方法，以兩端均為酪氨酸的寡肽作為酪氨酸酶的底物，在酪氨酸酶的催化和有氧存在的條件下，生成兩端帶有鄰苯二酚基團的衍生物，并進一步生成鄰苯二醌衍生物，加入抗壞血酸后，鄰苯二醌衍生物還原重新生成鄰苯二酚衍生物，后者能夠作為配基與硼酸基團結(jié)合，從而當酪氨酸酶的產(chǎn)物兩端帶有鄰苯二酚基團的衍生物存在時，作為橋聯(lián)分子使得表面修飾有16-巰基十六烷基酸MHDA及3-氨基苯基硼酸APBA修飾的功能化金納米顆粒APBA/MHDA/AuNPs 發(fā)生聚集，根據(jù)隨之產(chǎn)生的紫外-可見光譜的變化對酪氨酸酶的活性進行分析。方法包括以下步驟金納米顆粒(AuNPs)的制備及濃縮、功能化金納米顆粒APBA/ MHDA/AuNPs的制備、酪氨酸酶的酶促反應和反應產(chǎn)物的還原、酶活性的紫外-可見光譜檢測。
(1)金納米顆粒(AuNPs)的制備及濃縮
所用玻璃器皿均經(jīng)王水浸泡，純水沖洗后晾干備用。將100 mL 0.01%的氯金酸水溶液加入250 mL圓底燒瓶，攪拌并加熱至沸騰，劇烈攪拌下快速加入3. 5 mL 1%的檸檬酸三鈉水溶液，繼續(xù)加熱攪拌15 min后溶液變成酒紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌30 min，室溫自然冷卻。所得AuNPs粒徑為13 nm，濃度為3. 5 nM。
取20 mL 3.5 nM的AuNPs溶液放入50 mL圓底離心管中，于4°C下13000 rpm離心20 min，棄去上清液，沉淀重新懸浮于4 mL lmM、pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液(PBS)中，得到濃度為 17. 5 nM的濃縮AuNPs溶液。(2)功能化金納米顆粒APBA/MHDA/AuNPs的制備
經(jīng)五倍濃縮的AuNPs溶液(17. 5 nM)使用前通氮氣5 min用于除去溶液中的氧。將 AuNPs溶液與吐溫20在ImM pH 7. 0的磷酸鹽緩沖液(PBS)中混合并放置20 min,使吐溫20 充分吸附至AuNPs表面，然后加入MHDA溶液(用無水乙醇配制)，使得混合物中各物質(zhì)的終濃度分別為AuNPs 1. 5 nM，吐溫20 2. 0 mg/mL，MHDA 0. 17 mM，在黑暗中靜置4 h，使MHDA 自組裝到AuNPs表面。于4°C下13000 rpm離心20 min除去未反應的吐溫20和MHDA，用 10 mM pH7. 2的4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸(HEPES)緩沖液將得到的MHDA/AuNPs重新懸浮。往MHDA/AuWs懸浮液中加入APBA，偶聯(lián)劑1-[3-( 二甲氨基)丙基]_3_乙基碳二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)至混合溶液中各物質(zhì)的終濃度分別為MHDA/AuNPs 2.5 ηΜ,ΑΡΒΑ 0.1 mM,EDC 0.8 mM,NHS 2.0 mM，在 pH5. 0 的環(huán)境下攪拌反應 3. 5 h。于 4°C 下13000 rpm離心20 min除去未反應的化合物，修飾好的APBA/MHDA/AuNPs懸浮于10 mM PH 7. 2的HEPES緩沖液中，4°C保存。(3)酪氨酸酶的酶促反應和反應產(chǎn)物的還原
以兩端均為酪氨酸的寡肽作為酪氨酸酶的底物，取 ο μ L濃度為5 mM的底物溶液， 加入80 μ L 50mM, pH 6. 5的PBS緩沖液，再加入10 μ L具有合適稀釋倍數(shù)的酪氨酸酶溶液，使得反應體系的體積為100 UL0于25°C有氧條件下反應30 min，然后將反應液加熱至80°C使酪氨酸酶失活以終止反應。往反應后的混合液中加入5 mM的抗壞血酸50 μ L， 在室溫下反應15 min，使產(chǎn)生的鄰苯二醌衍生物完全還原生成鄰苯二酚衍生物。(4)紫外-可見光譜檢測
往上述產(chǎn)物溶液中加入100 μ L濃度為9. 5 nM的APBA/MHDA/AuNPs，混合均勻后靜置 15 min，然后測定紫外-可見光譜，以530 nm處的吸光度對酪氨酸酶進行定量分析，在酪氨酸酶活性為IXKTki U/mL lX10_8 U/mL范圍，吸光度的數(shù)值(A53tlnm)與酪氨酸酶活性的對數(shù)值(lgtTyrosinase])之間存在線性關(guān)系，見附圖1、附圖2。根據(jù)公式y(tǒng) = -0.035 + 0.6518可以計算出待測樣品的酶活力，式中y為A53tlnm，χ為酪氨酸酶活性的對數(shù)值 (lg[Tyrosinase])。本發(fā)明的有益效果①方法簡便快速，靈敏度極高，利用不同底物進行分析時，還能獲得不同的檢測范圍，從而適合對不同生物來源的酪氨酸酶活性進行分析，對于研究酪氨酸酶的反應動力學、活性調(diào)節(jié)、相關(guān)藥物開發(fā)、疾病的臨床診斷、食品工業(yè)應用都是非常有意義的；②該方法作為基于功能化金納米顆粒的酶活性分析的典型實例，在方法學上具有普遍借鑒意義，通過恰當?shù)牡孜镌O(shè)計和在金納米顆粒表面修飾適當?shù)幕鶊F，這種產(chǎn)物誘導AuNPs聚集的方法可以設(shè)計應用于多種酶活性的高靈敏度、高選擇性分析。


圖1加入0，IX 10Λ 1 X 10_9，1 X 10_8 U/mL的酪氨酸酶催化底物反應后的產(chǎn)物與功能化金納米顆粒作用后的紫外-可見光譜曲線。圖2在酪氨酸酶活性為1X10_1(^1X10_8 U/mL范圍內(nèi)，紫外-可見光譜中A53tlnm與酪氨酸酶活性的對數(shù)值(lgtTyrosinase])之間的線性關(guān)系曲線。圖3以酪氨酰甘氨酰酪氨酸(Tyr-Gly-Tyr)為底物，紫外-可見光譜中A53tlnm與酪氨酸酶活性的對數(shù)值(lg[Tyrosinase])之間響應范圍為1 X 10^1 X 10_5 U/mL，其中在 IX 10^1 X ΙΟ"6 U/mL范圍內(nèi)為線性關(guān)系。
具體實施例方式實施例1 以酪氨酰酪氨酸(Tyr-Tyr)為底物，在酪氨酸酶活性為1 X 10_1(ι 1 X 10_8 U/mL范圍內(nèi)獲得A53tlnm與lgtTyrosinase]的線性關(guān)系曲線
按表1加入各種溶液構(gòu)成酶促反應體系 表權(quán)利要求
1. 一種基于功能化金納米顆粒的酪氨酸酶活性分析方法，其特征在于以兩端均為酪氨酸的寡肽作為酪氨酸酶的底物，在酪氨酸酶的催化和有氧存在的條件下，生成兩端帶有鄰苯二酚基團的衍生物，并進一步生成鄰苯二醌衍生物，在加入抗壞血酸后，鄰苯二醌衍生物重新還原生成鄰苯二酚衍生物，后者能夠作為配基與硼酸基團結(jié)合，從而當酪氨酸酶的產(chǎn)物兩端帶有鄰苯二酚基團的衍生物存在時，作為橋聯(lián)分子使得表面修飾有16-巰基十六烷基酸MHDA及3-氨基苯基硼酸APBA修飾的金納米顆粒APBA/MHDA/AuNPs發(fā)生聚集，根據(jù)隨之產(chǎn)生的紫外-可見光譜的變化對酪氨酸酶的活性進行分析；方法包括以下步驟功能化金納米顆粒的制備，底物的選擇和酶促反應，產(chǎn)物的還原，功能化金納米顆粒的加入和紫外-可見光譜表征；(1)功能化金納米顆粒的制備采用經(jīng)典的檸檬酸鈉還原法制備直徑13 nm的金納米顆粒AuNPs，17.5 nM金納米顆粒溶液使用前通氮氣5 min除去AuNPs溶液中的氧，將AuNPs溶液與吐溫20在1 mM pH 7. 0 的磷酸鹽緩沖液PBS中混合并放置20 min,使吐溫20充分吸附至AuNPs表面，然后加入用無水乙醇配制的MHDA，使得混合液中各物質(zhì)的終濃度分別為AuNPs 1. 5 nM,吐溫20 2. 0 mg/mL, MHDA 0.17 mM，在黑暗中靜置4 h，使MHDA自組裝到AuNPs表面得到MHDA/AuNPs ； 通過13000 rpm離心20 min除去未反應的吐溫20和MHDA，用10 mM pH7. 2的4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸HEPES緩沖液將MHDA/AuNPs重新懸浮；往MHDA/AuNPs懸浮液中加入 APBA,偶聯(lián)劑1- [3- ( 二甲氨基)丙基]-3-乙基碳二亞胺EDC和N-羥基琥珀酰亞胺NHS至混合溶液中各物質(zhì)的終濃度分別為MHDA/AuNPs 2. 5 nM, APBA 0. 1 mM, EDC 0. 8 mM, NHS 2. 0 mM，在pH 5. 0環(huán)境下攪拌反應3. 5 h ；通過13000 rpm離心20 min除去未反應的化合物，修飾好的APBA/MHDA/AuNPs懸浮于10 mM pH7. 2的HEPES緩沖液中，4°C保存；(2)酶促反應條件如下選擇以兩端均為酪氨酸的寡肽作為底物，典型的為酪氨酰酪氨酸Tyr-Tyr，或兩個酪氨酸中間夾雜其他氨基酸殘基的寡肽，溶于50 mM、pH 6. 5的PBS緩沖液中，將底物與待測酪氨酸酶混合，反應體系為100 μ L，體系中底物濃度維持在0. 5 mM,酶需要有合適的稀釋倍數(shù)，于25°C有氧下準確反應30 min，然后加熱至80°C使酪氨酸酶失活；(3)產(chǎn)物的還原條件如下往反應體系里添加5 mM的抗壞血酸溶液50 μ L，在室溫下反應15 min ；(4)功能化金納米顆粒的加入和紫外-可見光譜表征如下往反應體系里添加100 μ L濃度為9. 5 nM的APBA/MHDA/AuNPs，混合均勻后靜置 15min，然后測定紫外-可見光譜曲線，以曲線中530 nm處的吸光度數(shù)據(jù)分析酶活性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于功能化金納米顆粒的酪氨酸酶活性分析方法，屬于分析化學技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以兩端均為酪氨酸的寡肽作為底物，典型的為酪氨酰酪氨酸(Tyr-Tyr)、或兩個酪氨酸中間夾雜其他氨基酸殘基的寡肽作為酪氨酸酶的底物，生成兩端均帶鄰位羥基的橋聯(lián)分子，該分子介導經(jīng)16-巰基十六烷基酸及3-氨基苯基硼酸修飾的金納米顆粒(APBA/MHDA/AuNPs)的聚集，根據(jù)隨之產(chǎn)生的紫外-可見光譜的變化可以對酪氨酸酶的活性進行分析。該方法具有極高的靈敏度和良好的線性關(guān)系，為臨床診斷和食品工業(yè)等領(lǐng)域快速、低成本定量分析酪氨酸酶活性提供有效的手段。
文檔編號G01N21/33GK102426157SQ20111036263
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者周楠迪, 李颯, 毛浪勇, 田亞平 申請人:江南大學