專利名稱：用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型及建立的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型及建立方法，為胃癌的早期預(yù)警提供幫助。
背景技術(shù)：
胃癌的發(fā)生率在我國(guó)惡性腫瘤中居第2位，病死率居第1位。且近年來青年患者比例在逐年增加。目前臨床上主要基于X線鋇餐法，纖維胃鏡內(nèi)窺(包括超聲內(nèi)窺)、組織病理學(xué)檢查、血清腫瘤標(biāo)記物等一種或多種技術(shù)相結(jié)合的方法來檢測(cè)胃癌。上述方法患者在檢查過程中接受的輻射和所服用的藥劑帶來一定副作用，且適用對(duì)象局限性大。而且這些方法是基于腫瘤尺寸診斷胃癌，對(duì)于早期或者微小胃癌的確證率不高。往往在癌癥晚期才得以確診，使得患者的治療和預(yù)后為時(shí)已晚。如何確診早期胃癌是一個(gè)挑戰(zhàn)性的醫(yī)學(xué)難題。事實(shí)證明，細(xì)胞代謝產(chǎn)物中含有許多疾病標(biāo)志物，而揮發(fā)性細(xì)胞代謝物中含有大量從未發(fā)現(xiàn)、可以作為癌癥標(biāo)志物的產(chǎn)物。細(xì)胞由于癌變，發(fā)生生理生化狀況的異常改變，產(chǎn)生一些易揮發(fā)代謝物，例如，細(xì)胞在癌變過程中氧化應(yīng)激增強(qiáng)，導(dǎo)致氧自由基的活動(dòng)增強(qiáng)，從而引起細(xì)胞膜表面多不飽和脂肪酸氧化為為易揮發(fā)的烷烴類、醛類等化合物。因此，建立胃癌細(xì)胞揮發(fā)性代謝產(chǎn)物指紋圖譜，可能對(duì)早期胃癌的發(fā)現(xiàn)、確診具有一定醫(yī)學(xué)價(jià)值。質(zhì)譜技術(shù)由于其較高的檢測(cè)靈敏度近年來被廣泛用于癌細(xì)胞揮發(fā)性代謝產(chǎn)物檢測(cè)。固相微萃取是一種綠色，無需溶劑，方便快捷的樣品富集濃縮技術(shù)，原理是依據(jù)物質(zhì)的極性差異，選擇不同納米材料的固相吸附涂層，對(duì)于一定體系中某一類揮發(fā)性有機(jī)目標(biāo)物實(shí)現(xiàn)選擇性吸附、濃縮。目前廣泛使用的是Supelco公司生產(chǎn)的萃取頭。然而，上述技術(shù)是基于良好的樣品來源基礎(chǔ)上。如果細(xì)胞揮發(fā)性代謝物在進(jìn)行固相微萃取之前，沒有得到較好的保留，就會(huì)導(dǎo)致一些潛在的癌癥標(biāo)志物被遺漏，主要原因包括1、癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性物質(zhì)的濃度較低，含量通常在痕量甚至超痕量級(jí)；2、癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物是一個(gè)依賴時(shí)間的動(dòng)態(tài)過程，大部分揮發(fā)性標(biāo)志物是細(xì)胞中間代謝產(chǎn)物，因而細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間對(duì)標(biāo)志物篩選極其重要；3、固相微萃取條件會(huì)直接影響檢測(cè)結(jié)果。中國(guó)專利ZL200410053327. 1，該專利提供了一種可用于診斷肝癌的蛋白質(zhì)指紋圖譜模型，用蛋白質(zhì)芯片飛行時(shí)間質(zhì)譜系統(tǒng)，檢測(cè)正常人及肝癌、肝硬化、慢性肝炎患者的外周血清樣品，找出與肝癌患者差異顯著的特異蛋白質(zhì)峰，根據(jù)各蛋白質(zhì)峰的質(zhì)荷比m/z及與其相對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)波峰強(qiáng)度系數(shù)A，得到蛋白質(zhì)指紋圖譜，包括肝癌與肝硬化、肝癌與慢性肝炎、肝癌患者與正常人及肝癌與非肝癌鑒別的蛋白質(zhì)指紋圖譜。只要將被測(cè)人血清中相應(yīng)蛋白質(zhì)的m/z及其A值與本發(fā)明指紋圖譜逐一對(duì)比分析，就可初步用于肝癌診斷。檢索中，尚未見與胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物中痕量揮發(fā)性有機(jī)物的檢測(cè)密切相關(guān)的報(bào)道，也未見用于早期胃癌診斷和預(yù)警的指紋圖譜模型。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型，可用于早期胃癌的篩選和預(yù)警，為早期胃癌的篩查提供新的科學(xué)依據(jù)。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供上述用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型的建立方法。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案本發(fā)明所述的用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型，是采用氣質(zhì)聯(lián)用儀分離和檢測(cè)胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物中痕量揮發(fā)性有機(jī)化合物4-異丙氧基丁醇，壬醛，4- 丁氧基正丁醇的質(zhì)量體積濃度，并將這些物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度與正常胃粘膜細(xì)胞的質(zhì)量體積濃度進(jìn)行比對(duì)統(tǒng)計(jì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果繪制而成，所述模型中4-異丙氧基丁醇、壬醛以及4-丁氧基正丁醇質(zhì)量體積濃度之比為4-異丙氧基丁醇[胃癌細(xì)胞]/ [正常胃粘膜細(xì)胞]< 0. 31， 壬醛[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]36，4_ 丁氧基正丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]< 0. 40，所述模型中的物質(zhì)濃度是以正常胃粘膜細(xì)胞中這些物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度為100%作為參考值。本發(fā)明上述的用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型，將被測(cè)細(xì)胞代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性有機(jī)物中4-異丙氧基丁醇(Peak5)、壬醛(peaM)以及4_ 丁氧基正丁醇 (peak9)的濃度，與本發(fā)明指紋圖譜模型進(jìn)行比對(duì)分析，則可初步用于提示早期胃癌。進(jìn)一步的，所述用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型，其中揮發(fā)性有機(jī)代謝產(chǎn)物中存在特征峰3-辛酮(peak2)，2-丁酮(peakS)。所謂的特征峰是相對(duì)于正常細(xì)胞而言，胃癌細(xì)胞中存在，但是正常細(xì)胞中不存在(為0)，所以，只要質(zhì)譜能檢測(cè)到該物質(zhì)，則可以進(jìn)一步補(bǔ)充和加強(qiáng)早期胃癌的預(yù)警效果。本發(fā)明所述的用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型的建立方法，通過細(xì)胞培養(yǎng)、樣品制備過程、固相微萃取條件優(yōu)化，采用頂空萃取技術(shù)，選擇性富集胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性有機(jī)物，包括烷烴類，甲基化烷烴類、醛類、酮類、醇類、不飽和烷烴類、苯類衍生物、鹵化物等。利用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)萃取得到的化合物進(jìn)行分離檢測(cè)，篩選與胃癌細(xì)胞相關(guān)的揮發(fā)性有機(jī)代謝物，利用質(zhì)譜自帶圖庫(kù)NIST08對(duì)被檢測(cè)到的物質(zhì)進(jìn)行初步定性分析；利用相對(duì)峰面積，對(duì)被檢測(cè)物進(jìn)行定量分析，通過繪制從而建立胃癌細(xì)胞揮發(fā)性化合物的“指紋圖譜”模型。本發(fā)明上述建立方法具體包括如下步驟a)收集胃癌細(xì)胞MGC-803和胃粘膜細(xì)胞GES-1培養(yǎng)液；b)利用頂空固相微萃取技術(shù)對(duì)樣品中揮發(fā)性代謝物進(jìn)行富集濃縮，所用萃取頭為 75 μ m CAR/PDMS，富集時(shí)間為45分鐘。c)利用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)b)富集的物質(zhì)進(jìn)行分離和檢測(cè)；d)篩選胃癌細(xì)胞MGC-803和胃粘膜細(xì)胞GES-I代謝產(chǎn)物中存在質(zhì)量體積濃度差異的物質(zhì)；e)基于差異物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度對(duì)比統(tǒng)計(jì)，經(jīng)繪制建立指紋圖譜模型，所述指紋圖譜模型中4-異丙氧基丁醇、壬醛以及4-丁氧基正丁醇質(zhì)量體積濃度之比為4-異丙氧基丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]<0.31，壬醛[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]<0. 36，4_ 丁氧基正丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]<0.40，則可用于早期胃癌的初步篩選。本發(fā)明所采用的方法，操作簡(jiǎn)單、安全，待測(cè)樣品為體外培養(yǎng)的細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也可采用胃病患者的胃液、唾液和尿液等樣品進(jìn)行分析，樣品來源無痛無創(chuàng)，資源豐富，適用于任何年齡階段人群。本發(fā)明彌補(bǔ)了現(xiàn)有早期胃癌篩查技術(shù)的不足，尋找并篩選胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性有機(jī)化合物“指紋圖譜”模型，用于早期胃癌預(yù)警。本發(fā)明的指紋圖譜在多種癌細(xì)胞包括肺癌，乳腺癌，黑色素瘤癌與胃癌細(xì)胞的鑒別中，對(duì)胃癌細(xì)胞檢出率達(dá)98%。同時(shí)，所得指紋圖譜也存在胃癌患者的呼出氣體中，而在胃良性病變患者，正常對(duì)照受試組中無明顯差別。這將為該指紋圖譜用于臨床早期胃癌的預(yù)警和篩選提供一定依據(jù)。


圖1胃癌細(xì)胞與正常胃粘膜細(xì)胞代謝產(chǎn)物氣相色譜圖；圖2胃癌細(xì)胞與正常胃粘膜細(xì)胞代謝產(chǎn)物中定量差異物；圖3為本發(fā)明一實(shí)施例中的指紋圖譜模型。圖4為本發(fā)明另一實(shí)施例中的指紋圖譜模型。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件試驗(yàn)，或按照制造廠商建議的條件，試劑都為細(xì)胞培養(yǎng)專用。試劑與儀器改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液(Hyclone)、新生牛血清(GIBCO)、青霉素-鏈霉素、胰酶細(xì)胞消化液(杭州四季青)、細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo)、GC/MS(QP-2010E，日本島津)、75cm2密封型細(xì)胞培養(yǎng)瓶(前塵生物科技有限公司)；57330U型手動(dòng)進(jìn)樣手柄、75μπι CAR/PDMS SPME(SUPELC0)；人源胃癌細(xì)胞MGC-803和胃粘膜細(xì)胞GES-I來源于中科院細(xì)胞庫(kù)。實(shí)驗(yàn)步驟貼壁培養(yǎng)的人源胃癌細(xì)胞MGC-803和胃粘膜細(xì)胞GES-I經(jīng)胰酶消化、離心、收集、血球計(jì)數(shù)計(jì)數(shù)、以l*106/mL密度傳代于75cm3密閉細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。加入40mL含5 % 新生牛血清的改良型RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基。擰緊瓶蓋，在5% C02，37°C恒溫培養(yǎng)18_Mh， 保持細(xì)胞活力在90%左右。分別收集胃癌細(xì)胞MGC-803生長(zhǎng)的培養(yǎng)液6mL，胃粘膜細(xì)胞GES-1生長(zhǎng)的培養(yǎng)液 6mL以及無細(xì)胞生長(zhǎng)，同樣條件下培養(yǎng)的培養(yǎng)基6mL，于20mL頂空瓶中。樣品分別經(jīng)HS-SPME (75 μ m CAR/PDMS)萃取濃縮，37°C 水浴 1200rpm/min 攪拌，萃取40min。于氣相色譜進(jìn)樣口 280°C熱解吸附aiiin，使目標(biāo)分子徹底解吸附，以無分流模式進(jìn)樣，Imin后打開分流閥，分流比1 20。經(jīng)毛細(xì)管色譜柱Rxi-5ms (30m*0. 22mm*0. 25 μ m) 分離。程序升溫條件初始溫度40°C保留5min ；然后以10°C /min升至260°C，保留lOmin。 質(zhì)譜儀全范圍掃描42-400amu，電子轟擊能量70eV，四級(jí)桿質(zhì)譜離子源溫度200°C，載氣是高純氦氣，流速44. 2cm/s。被檢出物質(zhì)用質(zhì)譜自帶OTST08圖庫(kù)進(jìn)行初步定性，相似度75% 以上的物質(zhì)使用相對(duì)峰面積定量。結(jié)果胃腸粘膜細(xì)胞株GES-1、胃癌細(xì)胞株MGC-803以及空白培養(yǎng)基中揮發(fā)性有機(jī)物的氣相色譜圖，如圖1所示。從圖中可以看到GES-I細(xì)胞與MGC803細(xì)胞代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性有機(jī)物存在定性差異。胃癌細(xì)胞MGC-803揮發(fā)性有機(jī)代謝產(chǎn)物中存在特征峰3-辛酮 (peak2)，2- 丁酮(peak8)，Peak 10 (待定性物質(zhì))。除定性差異外，胃癌細(xì)胞與正常胃粘膜細(xì)胞揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中，至少存在三種物質(zhì)，存在濃度差異(如圖2所示)，分別是4-異丙氧基丁醇(Peak5)、壬醛(peaM)以及 4-丁氧基正丁醇(peak9)。其濃度比為4_異丙氧基丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]彡0.31，壬醛[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]彡0. 36，4_丁氧基正丁醇[胃癌細(xì)胞]/ [正常胃粘膜細(xì)胞]<0.40。這些物質(zhì)濃度是以正常胃粘膜細(xì)胞中這些物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度為100%作為參考值。一般在正常胃粘膜細(xì)胞中上述三種物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度4-異丙氧基丁醇0.05%，壬醛0. 06 %，4- 丁氧基正丁醇0.23%。通過上述物質(zhì)濃度差異以及特征物質(zhì)，繪制得到胃癌細(xì)胞揮發(fā)性代謝產(chǎn)物“指紋圖譜”模型，用于區(qū)別正常胃粘膜細(xì)胞與胃癌細(xì)胞，為早期胃癌的篩選提供新的依據(jù)。需要指出的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員完全可以通過常識(shí)，將本發(fā)明以相對(duì)峰面積標(biāo)識(shí)的所述各目標(biāo)分子分析實(shí)驗(yàn)臨界點(diǎn)值轉(zhuǎn)換為其它單位，但不限于ng/ml、pg/ml所標(biāo)識(shí)的分析實(shí)驗(yàn)臨界點(diǎn)值。實(shí)施例1如圖3所示，取待測(cè)細(xì)胞，檢測(cè)其中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物中4-異丙氧基丁醇 (Peak5)、壬醛(peaM)以及4_ 丁氧基正丁醇(peak9)的濃度，將檢測(cè)結(jié)果與本發(fā)明所述的有機(jī)化合物指紋圖譜模型進(jìn)行比較，4-異丙氧基丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]彡0.31，壬醛[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]彡0·36，4-丁氧基正丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]< 0. 40，可以初步篩選為早期胃癌。實(shí)施例2如圖4所示，取受檢者待測(cè)細(xì)胞，檢測(cè)其中的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物，將檢測(cè)結(jié)果與本發(fā)明所述的有機(jī)化合物指紋圖譜模型進(jìn)行比較，按照該模型所示的流程進(jìn)行分析4-異丙氧基丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]<0.31，壬醛[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]< 0. 36，4_ 丁氧基正丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞](0.40，可以初步篩選為早期胃癌。進(jìn)一步檢測(cè)到揮發(fā)性有機(jī)代謝產(chǎn)物中存在特征峰3-辛酮(peak2)，2-丁酮 (peakS)。則可以進(jìn)一步加強(qiáng)提示早期胃癌的效果。本發(fā)明利用上述的模型，在體外細(xì)胞水平，進(jìn)行早期胃癌預(yù)警。該指紋圖譜模型在用于黑色素瘤細(xì)胞，肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞，對(duì)照組細(xì)胞的檢測(cè)中，對(duì)胃癌細(xì)胞的檢出率為 98%。本發(fā)明不受所述具體實(shí)施方案的限制，所述實(shí)施方案只預(yù)作為闡明本發(fā)明各個(gè)方面的單個(gè)例子，本發(fā)明內(nèi)容還包括功能等同的方法和組分。實(shí)際上除了本文所述的內(nèi)容外， 本領(lǐng)域技術(shù)人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對(duì)本發(fā)明的多種改進(jìn)。所述改進(jìn)也落入所附權(quán)利要求書的范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型，其特征在于是采用氣質(zhì)聯(lián)用儀分離和檢測(cè)胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物中痕量揮發(fā)性有機(jī)化合物4-異丙氧基丁醇，壬醛，4- 丁氧基正丁醇的質(zhì)量體積濃度，并將胃癌細(xì)胞中這些物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度與正常胃粘膜細(xì)胞中這些物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度進(jìn)行比對(duì)統(tǒng)計(jì)，根據(jù)比對(duì)結(jié)果繪制而成，所述模型中4-異丙氧基丁醇、壬醛以及4-丁氧基正丁醇質(zhì)量體積濃度之比為4-異丙氧基丁醇[胃癌細(xì)胞]/ [正常胃粘膜細(xì)胞]彡0.31，壬醛[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]彡0. 36，4_ 丁氧基正丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]<0.40，所述模型中的物質(zhì)濃度是以正常胃粘膜細(xì)胞中這些物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度為100%作為參考值。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型，其特征在于所述指紋圖譜模型，其中揮發(fā)性有機(jī)代謝產(chǎn)物中進(jìn)一步包括正常胃粘膜細(xì)胞中沒有的 3-辛酮，2-丁酮。
3.—種如權(quán)利要求1或2所述的用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型的建立方法，其特征在于包括如下步驟a)收集胃癌細(xì)胞MGC-803和胃粘膜細(xì)胞GES-I培養(yǎng)液；b)利用頂空固相微萃取技術(shù)對(duì)樣品中揮發(fā)性代謝物進(jìn)行富集濃縮，所用萃取頭為 75 μ m CAR/PDMS，富集時(shí)間為45分鐘；c)利用氣質(zhì)聯(lián)用儀對(duì)b)富集的物質(zhì)進(jìn)行分離和檢測(cè)；d)篩選胃癌細(xì)胞MGC-803和胃粘膜細(xì)胞GES-I代謝產(chǎn)物中存在質(zhì)量體積濃度差異的物質(zhì)；e)基于差異物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度，進(jìn)行比對(duì)統(tǒng)計(jì)，經(jīng)繪制建立指紋圖譜模型，所述指紋圖譜模型中4-異丙氧基丁醇、壬醛以及4-丁氧基正丁醇質(zhì)量體積濃度之比為4-異丙氧基丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]<0.31，壬醛[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]<0. 36，4_ 丁氧基正丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]<0.40，所述模型中的物質(zhì)濃度是以正常胃粘膜細(xì)胞中這些物質(zhì)的質(zhì)量體積濃度為100%作為參考值。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型的建立方法，其特征在于所述檢測(cè)方法為GC/MS，PTR-MS, SIFT-MS，或T0F-MS。
全文摘要
本發(fā)明公開一種用于早期胃癌診斷/預(yù)警的化合物指紋圖譜模型及建立，采用氣質(zhì)聯(lián)用儀分離和檢測(cè)胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物中痕量揮發(fā)性有機(jī)化合物的濃度并經(jīng)繪制而成，其中所述4-異丙氧基丁醇、壬醛以及4-丁氧基正丁醇質(zhì)量體積濃度之比為4-異丙氧基丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]≤0.31，壬醛[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]≤0.36，4-丁氧基正丁醇[胃癌細(xì)胞]/[正常胃粘膜細(xì)胞]≤0.40。胃癌細(xì)胞代謝產(chǎn)物還存在特征峰3-辛酮，2-丁酮。只要將被測(cè)細(xì)胞代謝產(chǎn)物中揮發(fā)性有機(jī)物與本發(fā)明指紋圖譜模型進(jìn)行比對(duì)，便可用于早期胃癌的篩選和預(yù)警。
文檔編號(hào)G01N30/02GK102495146SQ20111036294
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者崔大祥, 張益霞 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)