專利名稱：基于非損傷微測(cè)技術(shù)的動(dòng)態(tài)離子流篩選抗旱水稻的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗旱植株的篩選方法，具體地說，涉及一種基于非損傷微測(cè)技術(shù)的動(dòng)態(tài)離子流篩選抗旱水稻的方法。
背景技術(shù)：
全球水資源短缺，地下水位持續(xù)下降導(dǎo)致全球干旱災(zāi)害頻繁發(fā)生。而我國是農(nóng)業(yè)大國，干旱嚴(yán)重危害我國的農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和糧食安全，制約我國的農(nóng)業(yè)發(fā)展。據(jù)國家防汛抗旱總指揮部發(fā)布統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)2009、2010、2011連續(xù)三年受干旱影響損失嚴(yán)重。干旱造成了國民收入的大量損失，嚴(yán)重制約了我國經(jīng)濟(jì)社會(huì)的發(fā)展。因此，尋找或加速培育抗旱作物新品種， 有助于穩(wěn)定和促進(jìn)我國糧食生產(chǎn)。水稻作為我國的主要糧食作物之一，播種面積很大，但是隨著近些年來干旱災(zāi)害的頻繁發(fā)生育種家也開始關(guān)注旱稻育種，而旱稻育種缺少直接而有效的抗旱材料篩選工具，非損傷微測(cè)技術(shù)作為無損、快速的檢測(cè)方法用于旱稻的篩選是比較好的直接工具，利用該技術(shù)檢測(cè)不同品種在干旱條件下對(duì)K+的吸收能力可以快速篩選抗旱水稻品種。Maria(2008)在研究氣孔關(guān)閉時(shí)候發(fā)現(xiàn)，K+饑餓引起氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致生理學(xué)紊亂， 有可能使許多作物在水分脅迫下脫水(Mari' a Benlloch-Gonza' lez,Octavio Arquero, Jose ‘ Mari ‘ a Fournier, Diego Barranco, Manuel Benlloch. K+Starvation inhibits water-stress-induced stomatal closure (鉀離子饑餓抑制水分脅迫誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉).Journal of Plant Physiology, 2008,165 :623-630.)；由此推斷，K+可能對(duì)植物的耐旱性有所幫助。&ianasiri (19%)證實(shí)了高粱在干旱田間下除了積累K+和可溶性糖外Cl_也對(duì)維持細(xì)胞的膨壓起到了重要作用(Gnanasiri S. Premachandra, Daniel Τ. Hahn, David Rhodes and Robert J. J oly. Leaf water relations and solute accumulation in two grain sorghum lines exhibiting contrasting drought tolerance.(兩種高粱株系的葉片水勢(shì)關(guān)系和溶質(zhì)積累表現(xiàn)的不同耐旱性)Journal of Experimental Botany 1995， 46(12) :1833-1841)；上述研究表明，可溶性小分子物質(zhì)和無機(jī)離子在植物滲透調(diào)節(jié)中具有重要作用，因此用K+的吸收能力來判斷植物抗旱能力成為可能。非損傷微測(cè)技術(shù)(Non-InvasiveMicro-Test ^Technology，NMT)，是通過微電極和微傳感器獲取離子和分子的信號(hào)，基于Nernst方程和Fick' s第一擴(kuò)散定律計(jì)算離子和分子的濃度和流速的技術(shù)，精度達(dá)到pmol CnT2s-1,該技術(shù)是一項(xiàng)新型的無損檢測(cè)技術(shù)，能夠以單細(xì)胞、細(xì)胞層、組織、離體器官為檢測(cè)對(duì)象，來檢測(cè)離子、分子并且探知其流動(dòng)速率及其方向，檢測(cè)時(shí)不與被測(cè)材料接觸，植物不用去除細(xì)胞壁，進(jìn)行數(shù)小時(shí)、乃至十?dāng)?shù)小時(shí)以上的連續(xù)測(cè)量，能夠得到時(shí)時(shí)的分子和離子流動(dòng)的數(shù)據(jù)，從而判知被測(cè)對(duì)象生理狀況。近幾年來許多科學(xué)家通過這種技術(shù)研究了植物在不同環(huán)境下的離分子離子變化情況，取得了較好的成
果 ο張智猛等Q010)通過研究花生種子萌發(fā)期在干旱處理下抗旱性評(píng)價(jià)指標(biāo)(芽干重、根干重、生芽率、生根率等)篩選抗旱花生新品種(張智猛等，花生品種芽期抗旱性指標(biāo)篩選與綜合性評(píng)價(jià)，中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2010，12(1) :85-91)；劉鵬等(2009)，利用耐寒指數(shù)和抗旱指數(shù)評(píng)價(jià)方法篩選玉米抗旱新品種(劉鵬等，玉米品種抗旱性指標(biāo)篩選的研究，吉林農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，34 ) =21-24,34)；王麟等(2009)，利用抗旱指數(shù)評(píng)價(jià)方法篩選抗旱水稻品種(王麟等，黑龍江省抗旱水稻品種(系)的篩選，黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，4: 沈-29)。以上方法不能實(shí)現(xiàn)活體生物材料的動(dòng)態(tài)檢測(cè)，對(duì)珍稀材料造成浪費(fèi)。因此，開發(fā)新的篩選抗旱作物的方法具有非常重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在為水稻抗旱育種和水稻大田生產(chǎn)提供一種快速的、無損的篩選抗旱水稻的新方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種基于非損傷微測(cè)技術(shù)的動(dòng)態(tài)離子流篩選抗旱水稻的方法，其是利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)水稻根系K+的吸收能力，通過檢測(cè) PEG6000溶液處理前后幼苗的K+吸收變化篩選出抗旱水稻。本發(fā)明的目的是采用以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。依據(jù)本發(fā)明提供的，待水稻長至 1葉1心期，用PEG6000溶液進(jìn)行處理，利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)處理前后幼苗的 K+吸收流速和流向，篩選出抗旱水稻。優(yōu)選地，使用的PEG6000溶液濃度為10-20%，更優(yōu)選為20%。前述的方法，測(cè)試液中PEG6000溶液濃度為10 20%，優(yōu)選為20%。前述的方法，微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)中測(cè)試緩沖液中的測(cè)試離子濃度為 0. 05 0. 15mM。前述的方法，檢測(cè)使用的水稻處于1葉1心期，測(cè)量位置為距所述水稻苗根尖 200 500 μ m的根尖分生區(qū)的外表面20 40 μ m處。具體地，前述方法包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端0.8 1.5cm，再將電極前端吸入相應(yīng)的測(cè)試離子交換劑；( 將經(jīng)過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測(cè)水稻苗， 將其根部先放在測(cè)試緩沖液中平衡30min左右，再用校正后的電極對(duì)待測(cè)水稻苗進(jìn)行檢測(cè) 10 15min ； (4)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行處理和分析。其中，步驟(1)所述的灌充液為80 140mM KCl ；步驟⑵所述的校正液為 0. 05 0. 15mM KCl和0. 5 1. 5mM KCl ；步驟(3)所述的測(cè)試緩沖液為:K+ :0. 05 0. 15mM KCl、0. 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCl、0. 1 0. 3mM Na2SO4 和 0. 2 0. 5mM MES0前述方法中步驟(1)電極的前端吸入測(cè)試離子交換劑的長度為K+ :100 200μπι。前述方法中校正后電極的能斯特方程計(jì)算理想值為K+ 56 60mV ；前述方法中所述K+離子流的流速為40 500pmol. cm—2. s\本發(fā)明是基于非損傷微測(cè)技術(shù)，通過對(duì)水稻和旱稻的動(dòng)態(tài)K+流檢測(cè)來篩選抗旱水稻品種，實(shí)現(xiàn)對(duì)水稻抗旱性的無損、快速、活體檢測(cè)、檢測(cè)時(shí)間在10-15min左右，耗時(shí)短，檢測(cè)準(zhǔn)確性高，抗旱性幼苗與不抗旱性幼苗凈離子流對(duì)比差異明顯，評(píng)價(jià)方法簡單可靠，為水稻抗旱育種及水稻大田生產(chǎn)提供了直接而快速的篩選工具。


圖1為本發(fā)明基于非損傷微測(cè)技術(shù)的動(dòng)態(tài)離子流篩選抗旱水稻的實(shí)驗(yàn)過程圖。圖2為水稻品種日本晴和巴西旱稻經(jīng)PEG6000處理前后K+動(dòng)態(tài)吸收變化。其中， RBQ 日本晴；RBQ+PEG 日本晴+PEG ；BXHD 巴西旱稻；BXHD+PEG 巴西旱稻+PEG。圖3為水稻品種日本晴和巴西旱稻經(jīng)PEG6000處理前后K+凈離子流的比較。其中，RBQ 日本晴；RBQ+PEG 日本晴+PEG ；BXHD 巴西旱稻；BXHD+PEG 巴西旱稻+PEG。圖4為水稻品種日本晴和巴西旱稻幼苗經(jīng)20% PEG6000處理3天后的生長情況。圖5所示為利用微電極檢測(cè)時(shí)，電極距離根尖的位置。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。其中水稻品種日本晴由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院惠贈(zèng)，巴西旱稻的種子由北京農(nóng)業(yè)信息技術(shù)研究中心保存。實(shí)施例1.實(shí)驗(yàn)方法實(shí)驗(yàn)材料及培養(yǎng)條件為水稻品種日本晴和巴西旱稻，種子經(jīng)過次氯酸鈉消毒蒸餾水清洗后，加入適當(dāng)水浸種2小時(shí)，置于地墊濕潤濾紙的培養(yǎng)皿上25°C光照培養(yǎng)箱內(nèi)萌發(fā)，發(fā)芽后加入hogland營養(yǎng)液培養(yǎng)，生長至1葉1心期時(shí)開始加入PEG6000處理，測(cè)試處理前后的離子流。2.實(shí)驗(yàn)儀器及耗材離子流檢測(cè)用非損傷微測(cè)系統(tǒng)(BIO-OOlBJoungerUSA Sci. &Tech. Corp.，USA)， 系統(tǒng)軟件imFlux，微電極采用尖端直徑為2-4 μ m的玻璃微電極。3.實(shí)驗(yàn)試劑及溶液(1)液態(tài)離子交換劑包括K+ ^-^ Potassium ionophore I—cocktail A ；Sigma-Aldrich,Louis,M0 63103, USA ；(2)測(cè)試緩沖液成分K+離子0. ImM KC1、0. ImM CaCl2、0. ImM MgCl2、0. 5mM NaCl、0. 2mM Na2SO4^O. 3mM MES(3)電極灌充液K+: IOOmM KCl(4)校正液(濃度相差十倍也是必須的)K+:0. ImM 和 ImM KCl4.實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法實(shí)驗(yàn)過程如圖1所示。從電極末端灌入Icm左右的相應(yīng)測(cè)試離子的灌充液至電極尖端充滿，前端吸入適當(dāng)長度(K+:150-200 μ m)離子交換劑(LIX)。將電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座。 參比電極為固體低滲漏性電極(WPI)。電極在相應(yīng)的校正液中校正，其能斯特理想值是55-60mVo測(cè)試前將材料在相應(yīng)的測(cè)試液中平衡30-50min。然后在距離水稻根尖分生區(qū)(距離根尖300 μ m左右)外表面30 μ m的地方振動(dòng)檢測(cè)(圖5)，每個(gè)樣品檢測(cè)10-15min。5.數(shù)據(jù)處理離子流處理基于Fick' s擴(kuò)散定律，并通過在線軟件MageFlux_3DIon Flux Plotting System(http://www. xuyue. net/mageflux/)計(jì)算得出。由大于 3 次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)所得到的數(shù)據(jù)做統(tǒng)計(jì)分析，利用EXcel2003分析作圖。6.實(shí)驗(yàn)結(jié)果評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2和圖3所示。干旱敏感型水稻日本晴幼苗未處理前對(duì)K+吸收幅度很大，離子吸收平均流速達(dá)-74. 86pmol cm^s"1 ；加入20 % PEG6000處理30min之后K+吸收平均流速幅度降低至-29. 69pmol cnT2、1。干旱產(chǎn)生的滲透脅迫引起了日本晴根系對(duì)K+吸收幅度的迅速減小， 細(xì)胞內(nèi)的K+含量降低，造成細(xì)胞膨壓和滲透勢(shì)的改變，最終水稻枯萎死亡(圖4)。干旱耐受型的巴西旱稻幼苗未處理前對(duì)K+吸收幅度很小，離子吸收平均流速為-15. 52pmol cm-2s-l ；加入20% PEG6000處理30min之后K+吸收平均流速幅度迅速升高至-79. 2lpmol cm-k-l，可作為抗旱水稻評(píng)價(jià)指標(biāo)。短時(shí)間內(nèi)(30min) PEG6000處理后巴西旱稻對(duì)K+的吸收幅度較處理前大幅增多，這是由于巴西旱稻能夠通過吸收K+穩(wěn)定因干旱造成的滲透勢(shì)變化，保證細(xì)胞的膨壓，維持正常代謝活動(dòng)，從而提高了抗旱性。綜上，干旱敏感型水稻在干旱條件下細(xì)胞內(nèi)K+流失，細(xì)胞膨壓下降，體現(xiàn)了對(duì)干旱的敏感性；而干旱耐受型巴西旱稻能夠通過吸收K+維持細(xì)胞的滲透平衡，保證細(xì)胞的膨壓， 表現(xiàn)了很好的抗旱性，因此利用干旱條件下細(xì)胞對(duì)K+的吸收能力作為水稻抗旱植株的篩選是一種有效迅速而有效的手段。雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn)，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
權(quán)利要求
1.一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)篩選抗旱水稻的方法，其特征在于，利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)水稻根系K+的吸收能力，通過檢測(cè)PEG6000溶液處理前后幼苗的K+ 吸收變化篩選出抗旱水稻。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，待水稻長至1葉1心期，用PEG6000溶液進(jìn)行處理，利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)處理前后幼苗的K+吸收流速和流向，篩選出抗旱水稻。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，測(cè)試液中PEG6000溶液濃度為10 20%。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，測(cè)試液中PEG6000溶液濃度為20%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)中測(cè)試緩沖液中的測(cè)試離子濃度為0. 05 0. 15mM。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，檢測(cè)使用的水稻處于1葉1心期，測(cè)量位置為距所述水稻苗根尖200 500 μ m的根尖分生區(qū)的外表面20 40 μ m處。
7.根據(jù)權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，包括以下步驟(1)向微電極中灌入離子灌充液至充滿所述電極尖端0.8 1. 5cm，再將電極前端吸入相應(yīng)的測(cè)試離子交換劑；(2)將經(jīng)過步驟(1)處理后的電極套入已氯化的Ag/AgCl電極線基座，并放入校正液中校正；(3)取待測(cè)水稻苗，將其根部先放在測(cè)試緩沖液中平衡30min，再用校正后的電極對(duì)待測(cè)水稻苗進(jìn)行檢測(cè)10 15min ；(4)對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行處理和分析；其中，步驟⑴所述的灌充液為80 140mM KCl ；步驟(2)所述的校正液為0. 05 0. 15mM KCl和0. 5 1. 5mM KCl ；步驟(3)所述的測(cè)試緩沖液為:K+ :0. 05 0. 15mM KCl、0· 05 0. 15mM CaCl2,0. 05 0. 15mM MgCl2、0. 3 0. 6mM NaCU 0. 1 0. 3mM Na2SO4 和 0· 2 0. 5mM MES。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，步驟(1)電極的前端吸入測(cè)試離子交換劑的長度為K+ 100 200 μ m。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，校正后電極的能斯特方程計(jì)算理想值為 K+ 56 60mV ；
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述K+離子流的流速為40 500pmol.-2 -1 cm . s ο
全文摘要
本發(fā)明提供了一種基于微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)的篩選抗旱水稻的方法，其是利用微觀動(dòng)態(tài)離子流檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)水稻根系K+的吸收能力，通過檢測(cè)PEG6000溶液處理前后幼苗的K+吸收變化篩選出抗旱水稻。本發(fā)明能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)水稻抗旱性的無損、快速、活體檢測(cè)、檢測(cè)時(shí)間在10-15min左右，耗時(shí)短，檢測(cè)準(zhǔn)確性高，抗旱性幼苗與不抗旱性幼苗凈離子流對(duì)比差異明顯，評(píng)價(jià)方法簡單可靠，為水稻抗旱育種及水稻大田生產(chǎn)提供了直接而快速的篩選工具。
文檔編號(hào)G01N27/416GK102507701SQ20111036398
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者喬曉軍, 朱大洲, 王曉冬, 羅斌, 陳立平, 高權(quán) 申請(qǐng)人:北京農(nóng)業(yè)智能裝備技術(shù)研究中心