專(zhuān)利名稱(chēng)：一種f蛋白檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明專(zhuān)利屬于生物醫(yī)學(xué)工程和醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是指一種F蛋白檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
在生物醫(yī)學(xué)工程關(guān)于細(xì)胞的科研領(lǐng) 域及醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用中，F(xiàn)蛋白是一種特異存在于肝細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，只有當(dāng)肝實(shí)質(zhì)受損方釋放入血液中，因此現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為F蛋白是一種特異的肝細(xì)胞損害標(biāo)志物。肝病的診斷一直是醫(yī)學(xué)診斷學(xué)中一個(gè)重要的組成部分，肝臟F蛋白作為一種可直接反映肝損傷程度的血清學(xué)標(biāo)志，其血清含量與各種原因造成的肝損傷程度成正相關(guān)。無(wú)論何種原因?qū)е碌母尾?，均表現(xiàn)為肝細(xì)胞損害，血清中F抗原均可升高。血清F抗原的含量變化與肝組織學(xué)改變有密切的相關(guān)性。血清F抗原為肝臟特有，敏感性非常高，正常人血清F抗原濃度無(wú)年齡、性別差異，肝細(xì)胞受損時(shí)血液中出現(xiàn)的時(shí)間早，而且是不可誘導(dǎo)的，因此，血清F抗原是一種新的比常規(guī)肝功能項(xiàng)目更靈敏而特異的指標(biāo)。如果制成F蛋白的免疫試劑，其將在肝病早期診斷與治療、藥物的篩選與療效觀察、肝病預(yù)后的判斷等方面發(fā)揮重要作用。目前國(guó)內(nèi)外獲得F蛋白比較困難且缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，難以相互驗(yàn)證，不利于研究工作的深入；國(guó)內(nèi)外有學(xué)者通過(guò)提純的方法提取F蛋白，利用這種方法很難得到大量且較純的F蛋白；迄今為止用基因克隆的方法獲得F蛋白的基因序列只有在大鼠中獲得F蛋白克隆的報(bào)道，未見(jiàn)人肝臟F蛋白的克隆和表達(dá)的文獻(xiàn)報(bào)道，同時(shí)Genebank上亦沒(méi)有相應(yīng)的序列發(fā)布。在查閱大量國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，我們參照與人類(lèi)同源性較高的大鼠肝臟F蛋白的基因序列先后設(shè)計(jì)了 10對(duì)不同的上下游引物，成功擴(kuò)增出人肝臟F蛋白基因序列。我們將人類(lèi)肝臟F蛋白的基因序列在NCBI的GENEBANK上發(fā)布(序列號(hào)DQ188836)，并對(duì)此序列進(jìn)行了 Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，人類(lèi)肝臟F蛋白的基因序列與大鼠肝臟F蛋白的基因序列的同源性高達(dá)99%。進(jìn)而利用已獲得的F蛋白的cDNA在原核載體(大腸桿菌BL21 (DE3)PLysS)表達(dá)出F蛋白，使F蛋白的大量制備成為可能，解決其來(lái)源問(wèn)題；通過(guò)改進(jìn)提純的方法一方面得到人肝臟F蛋白的提純品，另一方面將提純的F蛋白與克隆表達(dá)的F蛋白通過(guò)免疫特性相互驗(yàn)證；同時(shí)制備其多克隆抗體和單克隆抗體，并通過(guò)多克隆抗體檢測(cè)部分臨床標(biāo)本，來(lái)初步驗(yàn)證F蛋白作為一種臨床診斷試劑的可打性，為使F蛋白的研究盡快地從實(shí)驗(yàn)室走向臨床奠定更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。在眾多的免疫測(cè)定技術(shù)中，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbentassay, ELISA)應(yīng)用最為廣泛，最具代表性。ELISA是60年代末，在酶免疫組織化學(xué)的基礎(chǔ)上由Engvall和Perlmann以及Van Weeman和Schuurs等發(fā)展的一種酶標(biāo)固相免疫測(cè)定技術(shù)。這種簡(jiǎn)單方便的免疫測(cè)定技術(shù)出現(xiàn)后，不但成為了一種非常簡(jiǎn)便的研究工具，而且迅速地應(yīng)用于各種生物活性物質(zhì)及標(biāo)志物的臨床檢測(cè)，并在臨床應(yīng)用中逐漸取代了有環(huán)境污染、廢液難以處理等缺點(diǎn)的放射免疫試驗(yàn)。免疫測(cè)定的基礎(chǔ)在于抗原抗體之間的特異結(jié)合反應(yīng)，而ELISA顧名思義就是以酶作為標(biāo)記物、以抗原抗體免疫反應(yīng)為基礎(chǔ)的固相吸附測(cè)定方法。ELISA的測(cè)定試劑的有機(jī)組成部分包括三個(gè)方面，即固相支持物及包被的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗體或抗原和酶反應(yīng)底物等。抗原或抗體的固相化并不影響其免疫結(jié)合活性，酶標(biāo)記的抗原或抗體亦是如此，并且標(biāo)記酶的活性不因標(biāo)記過(guò)程而喪失。整個(gè)測(cè)定中，抗原抗體結(jié)合反應(yīng)在固相支持物上進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)果的判斷以酶與其底物作用后的顯色或產(chǎn)生的熒光或發(fā)光反應(yīng)為準(zhǔn)則，顯色或產(chǎn)生熒光的強(qiáng)度與臨床標(biāo)本中待測(cè)物的濃度成正比或反比關(guān)系。以前用于免疫測(cè)定的抗原通常為各種純化抗原，近年來(lái)隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使用基因工程方法制備各種特殊的抗原或抗體及其酶結(jié)合物等免疫測(cè)定試劑已成為現(xiàn)實(shí)，各種新型實(shí)用的測(cè)定方法不斷出現(xiàn)，進(jìn)一步拓寬了免疫測(cè)定技術(shù)的發(fā)展途徑?，F(xiàn)在基因工程抗原在ELISA方法中的應(yīng)用得到了極大的拓展，有逐漸取代人工提純抗原的趨勢(shì)。最早是在HIV抗體免疫測(cè)定中所使用的抗原為用去垢劑裂解HIV感染的細(xì)胞后所提取的病毒抗原，這樣得到的抗原純度相對(duì)較差，因此影響測(cè)定的特異性和敏感性?，F(xiàn)在國(guó)內(nèi)外用于HIV抗體檢測(cè)的ELISA試劑盒均使用基因工程抗原如gp41，gp 120及gp 160等，大大提高了測(cè)定的特異性和敏感性。HCV目前尚不能體外培養(yǎng)，只能用基因工程或化學(xué)合成的方法獲得HCV結(jié)構(gòu)區(qū)和非結(jié)構(gòu)區(qū)的各種抗原片段。已知HCV基因組由7個(gè)功能區(qū)組 成；核心、E1、E2/NS1、NS2、NS3、NS4和NS5區(qū)。最近，美國(guó)Chiron公司Chien等研制了一種包括HCV基因組7個(gè)功能區(qū)所有免疫決定基的單一融合蛋白，稱(chēng)為多表位融合抗原_6。使用該融合蛋白建立的化學(xué)發(fā)光免疫測(cè)定方法，其測(cè)定敏感性較使用由NS3-NS4核心(C25)區(qū)組成的融合蛋白所建立的酶免疫測(cè)定方法要高2-4倍。此外，近年來(lái)不少研究者采用基因工程技術(shù)重組表達(dá)了梅毒螺旋體的具有高度免疫原性的膜脂蛋白TpN17、TpN44. 5 (TmpA)和TpN47等，用其建立梅毒抗體檢測(cè)的ELISA方法，表現(xiàn)了很好的測(cè)定特異性和敏感性，將成為取你快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀片試驗(yàn)(Rapidplasma reagin circle card test, RPR)和螺旋體血球凝集試驗(yàn)(Treponemal pallidumhemagglutination assay, TPHA)的梅毒抗體理想的檢測(cè)方法。由上述可見(jiàn)，基因工程抗原對(duì)建立高靈敏高特異的免疫測(cè)定方法具有不可替代的作用，已成為難以培養(yǎng)的病原體抗原的最佳來(lái)源，亦解決了病原體裂解提取抗原純度差的問(wèn)題。綜觀未來(lái)，基因工程抗原在免疫測(cè)定中的應(yīng)用，有其獨(dú)特的魅力和廣闊的應(yīng)用前景。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種既方便、快捷，又安全、經(jīng)濟(jì)的檢測(cè)各種肝病及肝細(xì)胞損傷的F蛋白檢測(cè)試劑及檢測(cè)方法，填補(bǔ)國(guó)內(nèi)在這一檢測(cè)領(lǐng)域的空白。本發(fā)明的目的是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種F蛋白檢測(cè)試劑，包括F蛋白的兔抗人多克隆抗體、酶標(biāo)抗體、顯色試劑和終止液。而且，所述酶標(biāo)抗體為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體。而且，所述顯色試劑為含O. 01% H2O2的水溶液和pH 7. 4，含O. 4mg/ml TMB (3, 3,5，5-四甲基連苯胺)的O. lmol/L枸椽酸緩沖液。而且，所述終止液味2M的硫酸水溶液。
而且，還包括緩沖液和洗滌液。而且，所述包括緩沖液為PBS O. 01M, pH 7. 4 ;所述洗滌液為PBST，配置方法為10XTBS pH 7.6 :Tris_ 堿，60. 57g ；1M HCl, 420ml ;NaCl，85_90g，用 HCl 調(diào) pH 至 7· 6 后，定容于IL ；1XTBST :將10XTBS稀釋10倍，同時(shí)加入O. I %的TWEEN-20。利用F蛋白檢測(cè)試劑檢測(cè)F蛋白含量的方法，其特征在于步驟如下(I)包被使用純化的F蛋白多克隆抗體按10 μ g/ml蛋白量進(jìn)行包被，100 μ I/孔，4°C過(guò)夜，O. OlM PBS pH 7. 4洗滌三次，含I %胎牛血清的PBS封閉，110 μ I/孔，37°C I小時(shí)，棄包被液待用；(2)取包被有F蛋白多克隆抗體的96孔板，加入待測(cè)血清50 μ I/孔，然后酶標(biāo)抗、體50 μ I/孔，用封板膜封住反應(yīng)孔，37°C恒溫箱溫育60min ；(3)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)PBST，靜置lmin，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3-8次；(4)每孔加入 O. 01% H2O2 的水溶液和 pH 7. 4 含 O. 4mg/ml TMB 的 O. lmol/L 枸椽酸緩沖液各50ul，37°C避光孵育15min ；(5)每孔加入終止液50 μ I,于15min內(nèi)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。一種F蛋白檢測(cè)試劑用于酶免儀檢測(cè)F蛋白的用途。一種用于免疫比濁法專(zhuān)用F蛋白檢測(cè)試劑盒，其特征在于試劑組成如下試劑Rl :含小鼠抗人F蛋白單克隆抗體的抗血清，試劑R2 :增濁劑，防腐劑，表面活性劑，Tris緩沖液；定值血清R3 :含定量純化的基因工程重組F蛋白；所述試劑Rl為小鼠抗人F蛋白單克隆抗體，抗血清濃度為10 μ g/ml ；所述試劑R2中的增濁劑采用4% g/ml的聚乙二醇-6000，所述防腐劑為山梨酸鉀；所述表面活性劑為1% SDS v/v, Tris緩沖液pH = 8. 2,濃度為20mmol/L。所述試劑R3為F蛋白凍干品，每份定值F蛋白含量為1000 μ g，使用時(shí)溶于IOmlTris緩沖液中，配制成濃度為100 μ g/mL的定值血清。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果為I、本發(fā)明根據(jù)F蛋白是一種能反映肝細(xì)胞損傷程度的靈敏和特異的指標(biāo)，采用生化分離提純的方法得到人類(lèi)肝臟的F蛋白的提純品及其抗體、采用RT-PCR的方法獲得人類(lèi)肝臟F抗原的cDNA序列克隆，并進(jìn)行原核表達(dá)F蛋白的基礎(chǔ)上，研究開(kāi)發(fā)F蛋白的ELSIA檢測(cè)試劑，為快速準(zhǔn)確檢測(cè)各種肝病所致肝損傷建立一種全新的試劑和方法。2、本發(fā)明經(jīng)過(guò)對(duì)F蛋白檢測(cè)試劑的各項(xiàng)方法學(xué)指標(biāo)如線性實(shí)驗(yàn)、靈敏度、重復(fù)性、交叉干擾最適反應(yīng)時(shí)間、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)等的實(shí)驗(yàn)探索，結(jié)果表明，F(xiàn)蛋白試劑檢測(cè)靈敏度達(dá)到O. 5 μ g/孔、批內(nèi)重復(fù)性CV值在5. 5%、批間CV值在范圍在10%左右、用本法在檢測(cè)F蛋白過(guò)程中與HbsAg陽(yáng)性對(duì)照、HbeAg陽(yáng)性對(duì)照、HAV抗原、HCV抗原、HDV抗原、HEV抗原、HSVI型抗原、HSVII型抗原、大腸桿菌等無(wú)交叉反應(yīng)、F蛋白檢測(cè)最適反應(yīng)時(shí)間確定為I小時(shí)、組成檢測(cè)試劑盒的各組成部分放于4°C保存經(jīng)過(guò)6個(gè)月P/N比值下降15%左右；陽(yáng)性標(biāo)本稀釋100倍其P/N比值仍在線性范圍內(nèi)。3、本發(fā)明根據(jù)F蛋白在肝臟組織受到損傷后從肝細(xì)胞大量釋放到循環(huán)中，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，采用基因工程制備并經(jīng)Ni2+柱層析高度純化后的HIS-F蛋白提高了診斷的精確度和診斷效率，節(jié)約了檢測(cè)成本，使其在臨床應(yīng)用方面具有重大的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。


圖I為本發(fā)明克隆載體pUCm-T示意圖；圖2-1為本發(fā)明表達(dá)載體pET_15b示意圖，圖2_2附表達(dá)載體關(guān)鍵位點(diǎn)定位信息；圖3為本發(fā)明Western blot法結(jié)果；圖4用于F蛋白濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明，下述實(shí)施例是說(shuō)明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來(lái)限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。在查閱大量國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)基礎(chǔ)上，參照與人類(lèi)同源性較高的大鼠肝臟F蛋白的基因序列先后設(shè)計(jì)了 10對(duì)不同的上下游引物，成功擴(kuò)增出人肝臟F蛋白基因序列，將人類(lèi)肝臟F蛋白的基因序列在NCBI的GENEBANK上發(fā)布(序列號(hào)DQ188836)，并對(duì)此序列進(jìn)行了Blast比對(duì)，結(jié)果顯示，人類(lèi)肝臟F蛋白的基因序列與大鼠肝臟F蛋白的基因序列的同源性高達(dá)99%。進(jìn)而利用已獲得的F蛋白的cDNA在原核載體(大腸桿菌BL21(DE3)pLysS)表達(dá)出F蛋白，使F蛋白的大量制備成為可能，解決其來(lái)源問(wèn)題；通過(guò)改進(jìn)提純的方法一方面得到人肝臟F蛋白的提純品，另一方面將提純的F蛋白與克隆表達(dá)的F蛋白通過(guò)免疫特性相互驗(yàn)證；同時(shí)制備其多克隆抗體和單克隆抗體,并通過(guò)多克隆抗體檢測(cè)部分臨床標(biāo)本,來(lái)初步驗(yàn)證F蛋白作為一種臨床檢測(cè)試劑的可打性，為使F蛋白的研究盡快地從實(shí)驗(yàn)室走向臨床奠定更堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。一、F蛋白檢測(cè)試劑的制備方法如下I、F蛋白的制備及純化提取車(chē)禍死亡的正常人的新鮮肝臟組織的總RNA，采用RT-PCR的方法獲得目的基因，進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)目的基因。以pUCm-T為克隆質(zhì)粒；pET-15b為表達(dá)載體；大腸桿菌BL21(DE3)pLysS為最終表達(dá)菌株。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白，應(yīng)用Ni2+-charged NTA His-binding column純化F蛋白，然后采用SDS-PAGE檢測(cè)目的蛋白的純度，并利用Western-blot進(jìn)行特異性鑒定。其中，人肝臟F蛋白的提取和純化方法如下取車(chē)禍死亡的正常人肝臟，經(jīng)低溫勻漿、飽和硫酸氨沉淀粗提后再經(jīng)DEAE-Cellulose 52、Sephacryl S-200 和 CM-Cellulose-23 柱層析，最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離。人肝臟組織經(jīng)勻漿、離心和硫酸氨沉淀后獲得粗制F蛋白，再經(jīng)DEAE-Cellulose 52、Sephacryl S-200 和 CM-Cellulose-23 柱層析后獲得的純度較高的 F蛋白，經(jīng)層析后的F蛋白進(jìn)行聚丙稀酰胺凝膠電泳。在人肝臟F蛋白提純的過(guò)程中，每一步均經(jīng)用BALB/c小鼠肝勻漿免疫C3H小鼠的抗F蛋白抗血清鑒定所提F蛋白的特異性，其純度鑒定采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。采用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)人肝臟 F 蛋白，用 Ni2+-charged NTA His-binding column 進(jìn)行純化。2、抗F蛋白多克隆抗體的制備
用生理鹽水將純化的F蛋白稀釋為100 μ g/ml濃度，取溶液Iml與Iml福氏完全佐劑充分混勻，用福氏完全佐劑充分混勻，取2ml混勻液免疫新西蘭純種大白兔。首次免疫，每只兔注射2ml的乳化抗原，于背部?jī)蓚?cè)、耳后等處皮下多點(diǎn)注射。2周后以同樣的劑量加強(qiáng)免疫，背部多點(diǎn)注射。10天后再次加強(qiáng)免疫。10天后進(jìn)行第3次加強(qiáng)免疫。末次免疫后，抗體效價(jià)達(dá)到要求即從頸靜脈取血，獲取大量的抗血清。依次采用飽和硫酸胺鹽析法、離子交換柱層析法和DEAE-Sephadex_A50柱層析法對(duì)多克隆抗體進(jìn)行純化。3、單克隆抗體制備采用基因工程獲得的F蛋白作為抗原免疫BALB-C小鼠后，用ELISA法測(cè)定血清中抗體滴度，選取抗體滴度I : 72000的BALB-C小鼠制備脾細(xì)胞，與骨髓瘤細(xì)胞融合，細(xì)胞融合后培養(yǎng)上清有15孔抗體陽(yáng)性，抗體滴度最高為I : 25600。Western-blotting試驗(yàn)顯示制備的單克隆抗體與基因工程表達(dá)的人肝臟F蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)，表明制備的抗體具有免疫活性。4、用純化人F蛋白及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的多克隆、單克隆抗體，采用雙夾心法制備ELISA試劑。 F蛋白檢測(cè)ELISA試劑(雙抗體夾心法)制備及操作步驟如下(I)包被使用純化的F蛋白多克隆抗體按10 μ g/ml蛋白量進(jìn)行包被，100 μ I/孔，4°C過(guò)夜，O. OlM PBS pH 7. 4洗滌三次，I %牛血清白蛋白PBS封閉，110 μ I/孔，37°C I小時(shí)，棄包被液待用；(2)同時(shí)加入標(biāo)本和酶結(jié)合物臨床標(biāo)本按50 μ I/孔加入，同時(shí)設(shè)陰陽(yáng)對(duì)照各二孔及空白對(duì)照一孔，并同時(shí)加入最適工作濃度的酶標(biāo)記抗體50 μ I/孔，37°C孵育I小時(shí)，PBST (含吐溫的Tris硼酸鹽緩沖液)洗五次；(3)顯色加入TMB底物A、B液各50 μ 1，37°C孵育15分鐘；(4)加入2M硫酸50 μ I終止反應(yīng)；(5) 450nm 波長(zhǎng)測(cè) OD 值；(6)結(jié)果判定P/N彡2. I為陽(yáng)性。二、F蛋白檢測(cè)試劑的組成如下(I)F蛋白的兔抗人多克隆抗體(10 μ g/ml，100 μ I/孔)；(2) 10% (v/v)胎牛血清；(3)自制辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體；制備方法如下i.取4mgHRP(辣根過(guò)氧化物酶)溶于O. 4ml去離子水中，加過(guò)碘酸鈉O. 4ml，4°C 30min，輕輕混勻。ii.加乙二醇液 0.4ml 4°C 30min,輕輕混勻。iii.加純化抗體4. 8mg/0. 4ml,室溫下2h輕輕混勻。iv.將樣品加入透析袋，對(duì)O. 05M pH9. 5碳酸鹽緩沖液透析，中間換液4次，透析18h以上。V.加入等量飽和硫酸銨，4°C靜置30min后IOOOrpm離心IOmin,沉淀用O. OlMPBS pH7. 4溶解至I. 6ml,加飽和硫酸銨O. 8ml 4°C靜置30min, IOOOrpm離心IOmin,沉淀用I-2ml PBS 溶解。vi.溶解后的沉淀裝入透析袋,對(duì)O. OlM PBS pH7. 4透析,直至用I %的氯化鋇檢測(cè)不出硫酸根離子為止。vii.柱層析在2. 5*30cm柱上采用Sephadex G200為介質(zhì),方法同離子交換層析，流速為lml/min,每管收集約3ml。(4) PBS (O. 01M, pH 7. 4)；(5) PBST (Tris 2. 42g, NaCl 29. 24g，Tween-202· 5ml 加水定容至 1000ml，調(diào) pH 至7. 5)；(6)底物 A 液(含 0.01% H2O2 的水溶液)和底物 B 液(pH 7. 4，含 O. 4mg/ml TMB (3，3，5，5-四甲基連苯胺)的O. lmol/L枸椽酸緩沖液)；(7)陽(yáng)性對(duì)照；(8)陰性對(duì)照； (9)終止液(2M硫酸)。三、F蛋白檢測(cè)試劑的制作方法如下I、利用純化的F蛋白多克隆抗體(10 μ g/ml)包被96孔板，每孔100 μ 1，4°C過(guò)夜，
O.01M,pH 7. 4的PBS洗滌三次，用含1%牛血清白蛋白PBS 110 μ I封閉各孔，37°C保溫lh，棄包被液待用；2、采用改良過(guò)碘酸鈉標(biāo)記法制備辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗F蛋白抗體；改良方法取4mg過(guò)氧化物酶(HRP)溶于O. 4ml水中，加過(guò)碘酸鈉O. 4ml,4°C 30min，輕輕混勻。
3、配制洗滌液PBST :10 X TBS (pH 7.6) :Tris_ 堿，60. 57g ; IM HCl，420ml ;NaCl，85_90g，用 HCl 調(diào) pH至
7.6后，定容于IL0IXTBSTjf 10 X TBS 稀釋 10 倍，同時(shí)加入 O. 1% (v/v)的 TWEEN-20 即可。4、配制顯色底物A 液(含 O. 01 % H2O2) ;B 液(含 O. 4mg/ml TMB 的 O. lmol/L 枸椽酸緩沖液)；5、反應(yīng)終止液硫酸溶液(2M)。四、F蛋白試劑的檢測(cè)方法簡(jiǎn)介如下(I)取包被有F蛋白多克隆抗體的96孔板，加入待測(cè)血清50μ I/孔，同時(shí)設(shè)陰、陽(yáng)對(duì)照各二孔，然后酶標(biāo)抗體50 μ I/孔，用封板膜封住反應(yīng)孔，37°C恒溫箱溫育60min ；(2)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)I XPBST，靜置lmin，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次；(3)每孔加入TMB底物A液和B液各50 μ 1，37°C避光孵育15min ；(4)每孔加入終止液50 μ I,于15min內(nèi)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。辣根過(guò)氧化物酶催化過(guò)氧化物的氧化反應(yīng)，最具代表性的過(guò)氧化物為H2O2, TMB為供氧體，H2O2為受氫體，反應(yīng)式為T(mén)MD+H202 —藍(lán)色可溶性產(chǎn)物+H2O,各類(lèi)酸性終止液(如硫酸溶液)則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此時(shí)可用特定的波長(zhǎng)(450nm)測(cè)讀吸光值。五、由此還可以擴(kuò)展為專(zhuān)用檢測(cè)試劑I、用于酶免儀專(zhuān)用酶免方法F蛋白檢測(cè)試劑，詳見(jiàn)前述。2、用于免疫比濁法專(zhuān)用F蛋白檢測(cè)試劑盒。2. I試劑組成試劑Rl (含小鼠抗人F蛋白單克隆抗體的抗血清)，試劑R2 (增濁齊U，防腐劑，表面活性劑，TriS緩沖液)；定值血清R3(含定量純化的基因工程重組F蛋白)試劑Rl中小鼠抗人F蛋白單克隆抗體來(lái)源于上述步驟(六)，抗血清濃度為10 μ g/ml。試劑R2中的增濁劑采用4% (w/v)的聚乙二醇-6000 (PEG-6000)，防腐劑為山梨酸鉀，表面活性劑為1% SDS (v/v)，Tris緩沖液(pH = 8. 2)濃度為20mmol/L。試劑R3為F蛋白凍干品(每份定值F蛋白含量為1000 μ g，使用時(shí)溶于IOmlTris緩沖液中，配制成濃度為100 μ g/mL的定值血清)2. 2試劑盒操作說(shuō)明2. 2. I按含F(xiàn)蛋白單克隆抗體的抗血清100 μ 1，加相應(yīng)的試劑R20. 9ml的比例混 合成單一試劑(F蛋白單抗抗體液)。最好臨用前配制當(dāng)天用量。2. 2. 2各試劑用量如下表
權(quán)利要求
1.一種F蛋白檢測(cè)試劑，其特征在于包括F蛋白的兔抗人多克隆抗體、酶標(biāo)抗體、顯色試劑和終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的F蛋白檢測(cè)試劑，其特征在于所述酶標(biāo)抗體為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的F蛋白檢測(cè)試劑，其特征在于所述顯色試劑為含O.Ol 1^H2O2的水溶液和PH 7. 4含O. 4mg/ml TMB的O. Imo 1/L枸椽酸緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的F蛋白檢測(cè)試劑，其特征在于所述終止液為2M的硫酸水溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的F蛋白檢測(cè)試劑，其特征在于還包括緩沖液和洗滌液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的F蛋白檢測(cè)試劑，其特征在于所述包括緩沖液為PBSO. 01M, pH 7. 4;所述洗滌液為 PBST，配置方法為10XTBSpH 7. 6 :Tris_ 堿，60. 57g ;IMHCl，420ml ;NaCl, 85_90g,用 HCl 調(diào) pH 至 7· 6 后，定容于 IL ；1 XTBST :將 10XTBS 稀釋 10倍，加入 O. 1% (v/v)的 TWEEN-20。
7.利用權(quán)利要求1-6之一所述的F蛋白檢測(cè)試劑檢測(cè)F蛋白含量的方法，其特征在于步驟如下 (1)包被使用純化的F蛋白多克隆抗體按10μ g/ml蛋白量進(jìn)行包被，100 μ I/孔，4°C過(guò)夜，O. OlM PBS pH 7. 4洗滌三次，含I %胎牛血清的PBS封閉，110 μ I/孔，37°C I小時(shí)，棄包被液待用； (2)取包被有F蛋白多克隆抗體的96孔板，加入待測(cè)血清50μ I/孔，然后酶標(biāo)抗體50 μ I/孔，用封板膜封住反應(yīng)孔，37°C恒溫箱溫育60min ； (3)棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿(mǎn)PBST，靜置lmin，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板3-8次； (4)每孔加入TMB底物O.01% H2O2的水溶液和pH 7. 4含O. 4mg/ml TMB的O. lmol/L枸椽酸緩沖液各50 μ 1，37°C避光孵育15min ； (5)每孔加入終止液50μ I,于15min內(nèi)在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值。
8.—種如權(quán)利要求I所述的F蛋白檢測(cè)試劑用于酶免儀檢測(cè)F蛋白的用途。
9.一種用于免疫比濁法專(zhuān)用F蛋白檢測(cè)試劑盒，其特征在于試劑組成如下 試劑Rl :含小鼠抗人F蛋白單克隆抗體的抗血清， 試劑R2 :增濁劑，防腐劑，表面活性劑，Tris緩沖液； 定值血清R3 :含定量純化的基因工程重組F蛋白； 所述試劑Rl為小鼠抗人F蛋白單克隆抗體，抗血清濃度為10 μ g/ml ； 所述試劑R2中的增濁劑采用4% g/ml的聚乙二醇-6000， 所述防腐劑為山梨酸鉀； 所述表面活性劑為1% SDS v/v, Tris緩沖液pH = 8. 2，濃度為20mmol/L。
所述試劑R3為F蛋白凍干品，每份定值F蛋白含量為1000 μ g，使用時(shí)溶于IOmlTris緩沖液中，配制成濃度為100μ g/mL的定值血清。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種F蛋白檢測(cè)試劑，包括F蛋白的兔抗人多克隆抗體、酶標(biāo)抗體、顯色試劑和終止液，所述酶標(biāo)抗體為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)抗體，所述顯色試劑為A液(含0.01％H2O2)和B液(pH 7.4，含0.4mg/ml TMB(3，3，5，5-四甲基連苯胺)的0.1mol/L枸椽酸緩沖液)；所述終止液為2M的硫酸水溶液。本發(fā)明根據(jù)F蛋白在肝臟組織受到損傷后從肝細(xì)胞大量釋放到血液循環(huán)中，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答，采用基因工程制備并經(jīng)Ni2+柱層析高度純化后的HIS-F蛋白提高了診斷的精確度和診斷效率，節(jié)約了檢測(cè)成本，使其在臨床應(yīng)用方面具有重大的理論意義和潛在的應(yīng)用價(jià)值。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102721814SQ20111036427
公開(kāi)日2012年10月10日 申請(qǐng)日期2011年11月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月16日
發(fā)明者任峰, 劉樹(shù)業(yè) 申請(qǐng)人:天津美德太平洋科技有限公司