專利名稱：一種檢測膠基型無煙氣煙草制品中煙堿釋放行為的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及煙草領(lǐng)域，具體講是涉及一種檢測膠基型無煙氣煙草制品煙堿釋放行為的方法，通過該方法可以為研究或衡量膠基型無煙氣煙草制品的安全性和進行品質(zhì)調(diào)控提供具體的數(shù)據(jù)支撐。
背景技術(shù)：
膠基型無煙氣煙草制品是一種添加煙草提取物的咀嚼型煙草制品。該類制品與卷煙的最大區(qū)別是屬于無煙氣煙草制品。使用時像嚼口香糖一樣，通過咀嚼使此類煙草制品中含有的煙堿等煙草成分經(jīng)唾液溶解后通過口腔粘膜被人體吸收。近年來，由于各國政府對公共場所吸煙行為的限制，使得無煙氣煙草制品的消費量呈逐年增加的趨勢，尤其是膠基型煙草制品，它既有口香糖的作用，又能滿足人體對煙堿的需求。作為現(xiàn)階段卷煙的有效替代品，在咀嚼膠基型煙草制品時能夠令人產(chǎn)生與抽吸卷煙相同的滿足感。與此同時，使用膠基型煙草制品不會產(chǎn)生煙霧，能夠避免被動吸煙，既能降低公眾危害，又能降低對含食者自身的危害，具有替煙、控?zé)煹墓π?。但是，目前關(guān)于該類產(chǎn)品的質(zhì)量檢測與控制還缺少相關(guān)技術(shù)方法。煙堿是煙草中重要的生物堿，煙堿釋放量是膠基型無煙氣煙草制品安全和品質(zhì)的重要指標(biāo)，通過煙堿釋放實驗可以了解食用產(chǎn)品時的煙堿吸收情況，進而可用于指導(dǎo)品質(zhì)管理和產(chǎn)品開發(fā)。目前，對煙堿釋放情況研究工作分兩種方式一種是體內(nèi)實驗，檢測人體血液或尿液中的煙堿變化情況。該方法實驗結(jié)果易受志愿者個體生理差異及消費煙草制品的習(xí)慣影響，實驗不易控制且對人體傷害較大。另一種是體外實驗，模擬人體咀嚼膠基型煙草制品時煙堿的釋放情況，自創(chuàng)裝置進行研究。體外實驗相對較為簡單，可控性強，實驗周期短，易于實現(xiàn)對煙堿釋放的監(jiān)測。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的正是針對目前膠基型無煙氣煙草制品煙堿釋放檢測方法的缺失或不足，提出了一種檢測膠基型無煙氣煙草制品煙堿釋放情況的方法，該方法可以檢測膠基型煙草制品的煙堿釋放速率以及釋放程度，為研究和衡量膠基型無煙氣煙草制品安全性和進行品質(zhì)調(diào)控提供技術(shù)支持。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的
本發(fā)明的檢測膠基型無煙氣煙草制品中煙堿釋放行為的方法，能夠模擬膠基型煙草制品中的煙堿在人體口腔咀嚼過程中的釋放情況，并對釋放量和釋放速率進行即時定量檢測，具體步驟如下
1)、體外煙堿釋放與收集創(chuàng)建模擬膠基型無煙氣煙草制品在人體口腔中煙堿釋放情況的模型，該模型包括人工唾液和模擬咀嚼機，即模擬人在使用膠基型煙草制品時的情況，使人工唾液在恒溫條件下不斷注入模擬咀嚼機，模擬咀嚼機通過對夾擠壓、轉(zhuǎn)動膠基型煙草制品的方式實現(xiàn)煙草制品和人工唾液的充分接觸和咀嚼攪拌，促使煙草制品中煙堿充分釋放，并實時收集咀嚼過程中的煙堿釋放液進行分析檢測；
2)、收集液及殘留樣品中煙堿含量定量分析利用高效液相色譜儀實現(xiàn)對收集液及殘留樣品中煙堿含量的定量分析；
3)、繪制體外煙堿釋放曲線由煙堿定量結(jié)果計算煙堿累積釋放率，根據(jù)煙堿累積釋放率，繪制煙堿釋放曲線(利用Origin軟件繪制曲線。)。在本發(fā)明中，所述人工唾液組分包括三類化合物無機鹽類化合物(包括氯化鈉、 氯化鉀、氯化鈣、氯化鎂等)，有機化合物(包括檸檬酸、葡萄糖等)，生物活性酶蛋白(粘蛋白、溶菌酶、淀粉酶等)。具體配方如下氯化鈉0.85 mg/mL;氯化鉀0.35 mg/mL ；氯化鈣 0. 15 mg/mL ；磷酸二氫鉀 0. 18 mg/mL ；氯化鎂 0. 25 mg/mL ；檸檬酸 0. 06 mg/mL ；葡萄糖 0. 20 mg/mL -MM 0. 08 mg/mL ；_占胃白(mucin) 2. 45 mg/mL ；(lysozyme) 0. 60 units/mL ； 淀粉酶(σ-amylase》· 50 units/mL ；酸性磷酸酶(acid phosphatase)0. 01 units/mL。加入粘蛋白等活性物質(zhì)前，PH值用鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)至6. 2 7. 5的某一值，室溫攪拌10 min后加入粘蛋白等活性物質(zhì)，再室溫攪拌30 min即完成配制。人工唾液可以按照上述配方自行配置，也可通過市場渠道購買。本人工唾液的有益效果是使用本發(fā)明所制的人工唾液與膠基型無煙氣煙草制品混合咀嚼后，能夠模擬被測樣品化學(xué)成份在口腔分泌物作用下的釋放行為，與真實情況接近，為膠基型煙草制品化學(xué)成份的提取搭建統(tǒng)一的平臺，便于分析測定該類制品的化學(xué)成分及含量，進而客觀地評價該制品的品質(zhì)及特點。所用的高效液相色譜儀中的液相色譜參數(shù)如下色譜柱為C18反相色譜柱，流動相為甲醇和0.05 M的磷酸鹽緩沖溶液，流速1 mL/min，柱溫為30°C;檢測器為紫外檢測器， 最大吸收波長λ· = 254 nm。所述C18反相色譜柱可以為Waters XTerra RP C18色譜柱， 也可以為Waters XTerra MS C18色譜柱或Kromasil C18色譜柱等。所述模擬咀嚼機包括由圓柱形水浴循環(huán)箱和環(huán)繞該循環(huán)箱設(shè)置的環(huán)形水浴循環(huán)箱構(gòu)成的測試腔，在圓柱形水浴循環(huán)箱上坐放有用于盛放人工唾液及測試物的小碗，與電機轉(zhuǎn)動軸相連接的氣動夾子通過吊裝方式伸入碗腔中，進液管和出液管設(shè)置在碗腔兩側(cè)， 圓柱形水浴循環(huán)箱底面與氣缸連接并可在氣缸作用下升降。所述小碗外壁為圓柱形結(jié)構(gòu)，嵌放在圓柱形水浴循環(huán)箱的圓柱形內(nèi)凹腔中，以保證小碗內(nèi)的環(huán)境溫度與人體溫度一致。氣動夾子由空氣壓縮機提供動力實現(xiàn)張開和夾持，氣動夾子的牙口為波浪形或者是鋸齒形，以模擬牙齒咀嚼動作保證咀嚼力；氣動夾子的牙口表面和小碗內(nèi)表面涂覆有防粘涂層。氣動夾子的下邊緣為圓弧形，其弧度與小碗內(nèi)表面的弧度相吻合，盡量保證氣動夾子在張合時與小碗內(nèi)表面不留間隙。進液管和出液管分別通過電磁閥與雙泵頭蠕動泵相連接。氣動夾子和小碗的材質(zhì)可以是不銹鋼、聚四氟乙烯、環(huán)氧樹脂、鍍鎳碳鋼、尼龍棒寸。本發(fā)明的具體操作是先打開恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng)，設(shè)置溫度37°C，等待一定時間，使測試腔內(nèi)的溫度達到37°C后，開始測試動作。首先為防止測試過程中膠基型無煙氣煙草制品粘在氣動夾子上，可將膠基型無煙氣煙草制品用一層透水性尼龍布包裹，放入小碗中。 之后，升降氣缸上升，將圓柱形水浴循環(huán)箱連同小碗升至測試腔內(nèi)，開啟蠕動泵，通過進液管向小碗中注入一定量的人工唾液。開啟氣動夾子和電機，使咀嚼動作開始，氣動夾子收縮，將被測試物體對夾，然后夾子松開，轉(zhuǎn)動一定角度，重復(fù)對夾動作。測試過程中，蠕動泵通過進液管定時、定量將新鮮恒溫的人工唾液注入到小碗內(nèi)，通過出液管定時抽取人工唾液(煙堿釋放液)進行分析檢測。到達系統(tǒng)設(shè)定時間后，電機停止轉(zhuǎn)動，氣動夾子張開，實驗結(jié)束。此時可將升降氣缸降下，取出殘留樣品，放入50 100 mL的錐形瓶中，加入少量正己烷，置于搖床上震蕩15 min，待膠基質(zhì)樣品完全溶解后，再向其中加入20 50 mL混合磷酸鹽緩沖溶液，再次置于搖床震蕩30 min。煙堿釋放液和殘留樣品萃取液過0.45 ym濾膜后，進入高效液相色譜儀進行定量檢測，根據(jù)定量結(jié)果計算煙堿釋放程度和速率。煙堿釋放程度和速率通過煙堿隨時間的累積釋放率求得，煙堿累積釋放率由一段時間的煙堿累積釋放量除以樣品總煙堿含量計算(樣品總煙堿含量為測試時間內(nèi)的煙堿釋放總量與殘留樣品中煙堿含量的總和)，并根據(jù)需要繪制膠基型無煙氣煙草制品煙堿釋放曲線。本發(fā)明能夠模擬膠基型無煙氣煙草制品中煙堿在人體口腔咀嚼過程中的釋放情況，并對釋放量和釋放速率進行即時定量，可以檢測膠基型無煙氣煙草制品的煙堿釋放速率以及釋放程度，為研究衡量膠基型煙草制品安全和品質(zhì)優(yōu)劣提供具體技術(shù)數(shù)據(jù)支持。該檢測方法快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好，適用于各種規(guī)格膠基型無煙氣煙草制品的檢測，便于推廣。本發(fā)明所述檢測方法與人體消費膠基型無煙氣煙草制品的真實情況接近，靈敏度高，重復(fù)性好，檢測周期短，適用于不同行業(yè)不同目的研究和較大批量樣品的快速分析，可在煙草、醫(yī)藥等行業(yè)的普通化學(xué)分析實驗室推廣應(yīng)用。


圖1為本發(fā)明的檢測流程圖。圖2為本發(fā)明中所用的對夾型模擬咀嚼機結(jié)構(gòu)示意圖。圖2中各部件標(biāo)號如下1.電機，2.出液管，3.氣動夾子，4.環(huán)形水浴循環(huán)箱， 5.圓柱形水浴循環(huán)箱，6.升降氣缸，7.支架，8.小碗，9.進液管，10.測試腔。圖3為煙堿標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖4為實施例1條件下煙堿釋放曲線。圖5為實施例2條件下煙堿釋放曲線。
具體實施例方式首先對模擬咀嚼機的結(jié)構(gòu)及使用方法結(jié)合圖2予以描述該模擬咀嚼機的支架 (7)上固定有電機(1)、升降氣缸(6)和環(huán)形水浴循環(huán)箱(4)，電機(1)下端連接有氣動夾子 (3)，該氣動夾子由空氣壓縮機提供動力實現(xiàn)張開和夾持，升降氣缸(6)上端連接著圓柱形恒溫水浴循環(huán)箱(5)，其上固定著放置測試樣品的小碗(8)，此外，雙泵頭蠕動泵的進液管 (9)和出液管( 通過支架伸入到環(huán)形水浴循環(huán)箱圍繞的測試腔(10)內(nèi)，固定在靠近小碗(8)內(nèi)側(cè)邊緣處。使用該咀嚼機時，設(shè)定恒溫水浴循環(huán)系統(tǒng)溫度為37°C，并保持測試過程中測試腔(10)內(nèi)溫度恒定在37°C的人體溫度。首先用一層透水性尼龍布將膠基型煙草制品包裹好放入小碗(8)中。之后，升降氣缸上升，將圓柱形水浴循環(huán)箱連同小碗(8)升至測試腔(10) 內(nèi)，開啟蠕動泵，向小碗中注入5 30 mL恒溫37°C的人工唾液。開啟氣動夾子(3)和電機(1)，使咀嚼動作開始，氣動夾子收縮，將被測試物體對夾，然后夾子松開，在電機帶動下轉(zhuǎn)動一定角度，重復(fù)對夾動作。測試過程中，雙泵頭蠕動泵通過進液管電磁閥控制定時向小碗中注入新鮮的人工唾液，通過出液管電磁閥控制定時抽取人工唾液(煙堿釋放液)，蠕動泵的流速為0. 5 20 mL/min。到達系統(tǒng)設(shè)定時間后，電機(1)停止轉(zhuǎn)動，氣動夾子(3)張開，實驗結(jié)束。此時可將升降氣缸(6)降下，取出殘留樣品。釋放液和殘留樣品中的煙堿含量可通過高效液相色譜進行定量分析，根據(jù)定量結(jié)果計算煙堿釋放程度和釋放速率，繪制膠基型無煙氣煙草制品煙堿釋放曲線。以下結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步描述 實施例1
測試樣品Nicorette Classical 4mg Gum (Sweden)。人工唾液pH為6· 7，小碗中人工唾液的起始量為20 mL，蠕動泵的流速為20 mL/min，測試共進行60 min。分別在實驗進行 2 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min、35 min、40 min、45 min、50 min、55 min時抽取煙堿釋放液和補充新鮮人工唾液，抽取和補充人工唾液的量均為5 mL,按先取液后補充的順序進行；60 min時系統(tǒng)自動停止，此時蠕動泵抽取最后一份釋放液。取出殘留膠基樣品，放入100 mL錐形瓶中，加入5.0 mL正己烷，蓋上塞子，置于搖床上震蕩15 min, 待膠基質(zhì)樣品完全溶解后，再向其中加入40 mL混合磷酸鹽緩沖溶液(pH = 6. 86)，再次置于搖床震蕩30 min，分液取下層緩沖溶液層。釋放液和殘留樣品萃取液中煙堿的檢測采用高效液相色譜法，色譜參數(shù)如下色譜柱為Waters XTerra RP C18柱，流動相為甲醇和0. 05 M的磷酸鹽緩沖溶液(流動相中添加三乙胺，含量為0. 2 %，其作用是有效地改善煙堿色譜峰的拖尾，保留時間變大；磷酸鹽緩沖溶液的PH = 5. 8)，其比例為8 92，流速1 mL/min，柱溫為30°C，進樣量10 yL，檢測波長為254 nm。首先，稱取一定量的煙堿標(biāo)準(zhǔn)品(99. 7 %，Sigma)，采用流動相作溶劑，配制成濃度為 10.0，20.0，30.0，40.0，60.0，80.0，100.0，120.0 μ g/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述色譜條件進行高效液相色譜分析。以煙堿濃度為橫坐標(biāo)，以紫外檢測器信號響應(yīng)的峰面積值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖3)。采用相同色譜條件對煙堿釋放液和殘留樣品萃取液中煙堿含量進行測定，根據(jù)測定結(jié)果計算煙堿累積釋放率，繪制該煙草制品的煙堿釋放曲線(見圖4)。從圖4中可以看出，該膠基型無煙氣煙草制品煙堿前15 min釋放相對較快，15 min內(nèi)的煙堿釋放量已超過 50 %，15 min到60 min釋放速率明顯減慢，60 min內(nèi)該產(chǎn)品的煙堿共釋放了 79.5 %。實施例2
測試樣品:Nicotinell Fruit 4mg Medicated Chewing Gum (Germany)。人工唾液 pH 為6. 7，小碗中人工唾液的起始量為10 mL，蠕動泵以2. 5 mL/min的流速連續(xù)不斷地更新模擬咀嚼機內(nèi)的人工唾液，測試共進行30 min。收集每2分鐘的煙堿釋放液，實驗進行至觀 min時關(guān)閉蠕動泵，30 min時系統(tǒng)自動停止，此時手動采集最后一份釋放液。采用與實施例 1中相同的方法處理殘留樣品。用高效液相色譜儀檢測煙堿釋放液和殘留樣品萃取液中的
6煙堿含量，色譜條件同實施例1。根據(jù)定量結(jié)果計算煙堿累積釋放率，繪制該煙草制品的煙堿釋放曲線(見圖5)。從圖5中可以看出，該膠基型無煙氣煙草制品煙堿前10 min釋放相對較快，10 min內(nèi)的煙堿釋放量已接近60 %，10 min到30 min釋放速率明顯減慢，30 min 內(nèi)該產(chǎn)品的煙堿共釋放了 82. 75 %。對比實施例1，該產(chǎn)品煙堿釋放速率明顯快一些，其原因可能與膠基的配方有關(guān)，實施例1中樣品膠基的包埋緩釋作用要強一些，在咀嚼相當(dāng)長的時間后，其膠基中仍然能夠檢測到煙堿殘留。
權(quán)利要求
1.一種檢測膠基型無煙氣煙草制品中煙堿釋放行為的方法，其特征在于該方法能夠模擬膠基型煙草制品中的煙堿在人體口腔咀嚼過程中的釋放情況，并對釋放量和釋放速率進行即時定量檢測，具體步驟如下1)、體外煙堿釋放與收集創(chuàng)建模擬膠基型無煙氣煙草制品在人體口腔中煙堿釋放情況的模型，該模型包括人工唾液和模擬咀嚼機，即模擬人在使用膠基型煙草制品時的情況，使人工唾液在恒溫條件下不斷注入模擬咀嚼機，模擬咀嚼機通過對夾擠壓、轉(zhuǎn)動膠基型煙草制品的方式實現(xiàn)煙草制品和人工唾液的充分接觸和咀嚼攪拌，促使煙草制品中煙堿充分釋放，并實時收集咀嚼過程中的煙堿釋放液進行分析檢測；2)、收集液及殘留樣品中煙堿含量定量分析利用高效液相色譜儀實現(xiàn)對收集液及殘留樣品中煙堿含量的定量分析；3)、繪制體外煙堿釋放曲線由煙堿定量結(jié)果計算煙堿累積釋放率，根據(jù)煙堿累積釋放率，繪制煙堿釋放曲線。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測膠基型無煙氣煙草制品中煙堿釋放行為的方法，其特征在于所述人工唾液組分包括三類化合物無機鹽類化合物，有機化合物，生物活性酶蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測膠基型無煙氣煙草制品中煙堿釋放行為的方法，其特征在于利用Origin軟件繪制曲線。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測膠基型無煙氣煙草制品中煙堿釋放行為的方法，其特征在于所用的高效液相色譜儀中的液相色譜參數(shù)如下色譜柱為C18反相色譜柱，流動相為甲醇和0.05 M的磷酸鹽緩沖溶液，流速1 mL/min，柱溫為30°C;檢測器為紫外檢測器，最大吸收波長λ max = 254 nm。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的檢測膠基型無煙氣煙草制品中煙堿釋放行為的方法，其特征在于所述C18反相色譜柱可以為Waters XTerra RP C18色譜柱，也可以為Waters XTerra MS C18色譜柱或Kromasil C18色譜柱。
全文摘要
一種檢測膠基型無煙氣煙草制品中煙堿釋放行為的方法，其特征在于該方法能夠模擬膠基型煙草制品中的煙堿在人體口腔咀嚼過程中的釋放情況，并對釋放量和釋放速率進行實時定量檢測，具體步驟如下1)體外煙堿釋放與收集；2)收集液及殘留樣品中煙堿含量定量分析；3)繪制體外煙堿釋放曲線。該方法可以檢測膠基型煙草制品的煙堿釋放速率以及釋放程度，為研究和衡量膠基型無煙氣煙草制品安全性和進行品質(zhì)調(diào)控提供技術(shù)支持。該檢測方法與人體消費膠基型無煙氣煙草制品的真實情況接近，快速準(zhǔn)確、重復(fù)性好，檢測周期短，適用于各種規(guī)格膠基型無煙氣煙草制品的檢測，便于推廣。
文檔編號G01N30/02GK102507789SQ20111036443
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者宗永立, 張建勛, 張文娟, 慎龍舞, 曾波, 李鵬, 黃衛(wèi)東 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院, 鄭州嘉德機電科技有限公司