專利名稱：以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)用試劑盒領(lǐng)域，特別涉及一種用于檢測妊娠期婦女子癇前期 (preeclampsia,簡稱PE)的試劑盒及其制備方法。
背景技術(shù)：
子癇前期(preeclampsia，簡稱PE)是發(fā)生于妊娠20周后的產(chǎn)科并發(fā)癥，是孕婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一。子癇前期在全世界范圍內(nèi)孕產(chǎn)婦中的發(fā)病率為2-8%，在我國孕產(chǎn)婦中的發(fā)病率可達(dá)10%。重度子癇前期患者可出現(xiàn)高血壓、水腫和重度蛋白尿等嚴(yán)重的臨床表現(xiàn)，還容易并發(fā)肺水腫、腎功能衰竭、HELLP綜合征等不良結(jié)局，遠(yuǎn)期罹患心血管疾病、腎臟疾病和代謝性疾病的風(fēng)險也明顯增高。對于胎兒而言，孕周越小，存活率越低，孕 32周之前的早產(chǎn)兒，死亡率高達(dá)50%，新生兒發(fā)生窒息、顱內(nèi)出血、感染等嚴(yán)重并發(fā)癥的機率達(dá)5-10%，遠(yuǎn)期的代謝性疾病、心血管疾病的發(fā)病率也增加，嚴(yán)重影響了子代的健康，給家庭及社會帶來沉重的心理及衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)?，F(xiàn)有技術(shù)關(guān)于子癇前期的臨床診斷需滿足如下三個依據(jù)(1)孕產(chǎn)婦自訴有頭痛、頭暈等臨床癥狀；(2)經(jīng)臨床醫(yī)生檢測，孕產(chǎn)婦的血壓符合高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)，收縮壓/舒張壓彡140/90讓?。?3)24小時尿白蛋白定量檢測結(jié)果為對小時蛋白尿彡0.38/(1對。24 小時尿白蛋白定量檢測需收集患者連續(xù)M小時的尿樣進(jìn)行檢測。這種方法采集樣本的方法繁瑣，耗時長。Adipsin (又名 factor D，或 complement factor D，中文名為“補體因子 D”)是脂肪細(xì)胞產(chǎn)生的一種絲氨酸蛋白酶，存在于循環(huán)血液中，與機體的脂肪代謝密切相關(guān)。健康妊娠婦女和患有子癇前期的妊娠婦女循環(huán)血液中的Adipsin含量穩(wěn)定，兩組之間沒有顯著性差異。但是，由于患有子癇前期的妊娠婦女存在血管內(nèi)皮損傷，腎臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷造成腎臟滲透和回收功能受損，導(dǎo)致高濃度的Adipsin出現(xiàn)在患有子癇前期的妊娠婦女的尿樣本中，因此，可以基于這一研究基礎(chǔ)將Adipsin作為子癇前期的診斷與預(yù)測指標(biāo)。目前尚未發(fā)現(xiàn)以尿樣本中的Adipsin含量作為子癇前期的檢測指標(biāo)的報道，也未發(fā)現(xiàn)以尿樣本中的Adipsin含量為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒及其制備方法的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種以尿樣本中所含的Adipsin為檢測指標(biāo)的新型子癇前期檢測試劑盒及其制備方法，以簡化子癇前期的檢測程序，降低檢測費用，減輕患者的痛苦。本專利申請的發(fā)明人通過實驗發(fā)現(xiàn)=Adipsin在健康妊娠婦女和患有子癇前期的妊娠婦女循環(huán)血液中含量穩(wěn)定，子癇前期組血液中Adipsin的含量為四四.37士814. OSng/ mL，健康妊娠組血液中Adipsin的含量為2359. 76士667. 63ng/mL，兩組之間沒有顯著性差異。但是，由于患有子癇前期的妊娠婦女存在血管內(nèi)皮損傷，腎臟的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷造成腎臟滲透和回收功能受損，導(dǎo)致高濃度的Adipsin出現(xiàn)在患有子癇前期的妊娠婦女的尿樣本中，蛋白芯片篩選實驗發(fā)現(xiàn)確診的子癇前期產(chǎn)婦與確診的非子癇前期產(chǎn)婦相比(兩組產(chǎn)婦的年齡與妊娠周齡匹配，無基礎(chǔ)疾病，無其他妊娠合并癥)，尿樣本中的Adipsin濃度具有明顯差異，定量研究發(fā)現(xiàn)子癇前期組尿樣本中Adipsin的含量為349. 04士557. IOng/ mL，健康妊娠組尿樣本中Adipsin的含量為8. 69士6. 34ng/mL,由于子癇前期組與健康妊娠組尿樣本中Adipsin的含量存在顯著的差異，因此可將尿樣本中Adipsin的含量作為判斷妊娠婦女是否患有子癇前期的檢測指標(biāo)。本發(fā)明所述以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒，包括包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板、生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)檢測液、與生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體 (Biotin-AdipsinAb)結(jié)合的親和素-辣根過氧化物酶、顯色底物3' ,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。實驗表明，上述試劑盒所含包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板，優(yōu)選每孔包被抗人Adipsin單克隆抗體0. 9 μ g 1 μ g。上述試劑盒中，所述生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb) 檢測液主要由生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)、牛血清白蛋白、甘油和磷酸鹽緩沖液組成，生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體 (Biotin-AdipsinAb)的濃度為Mmg/mL，牛血清白蛋白的濃度為1. 5g 3g/100mL，甘油的濃度為 50mL/100mL。所述生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)由生物素酰-N 羥基丁二酰亞胺酯和抗人Adipsin單克隆抗體耦聯(lián)而成，酰-N羥基丁二酰亞胺酯與抗人 Adipsin單克隆抗體的質(zhì)量比為0.5 1 7。為了方便用戶使用，本發(fā)明所述試劑盒還可配備樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)或濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，牛血清白蛋白的濃度為Ig 2g/100mL。本發(fā)明所述以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒的制備方法，工藝步驟如下(1)制備包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板用pH = 8 10的碳酸鹽緩沖液將抗人Adipsin單克隆抗體稀釋為濃度10 μ g/ mL稀釋液，在所述抗人Adipsin單克隆抗體稀釋液中加入無水甲醇，無水甲醇的加入量以其濃度達(dá)到3mL/100mL為限，然后將所述含甲醇的抗人Adipsin單克隆抗體稀釋液加入多孔板的各孔內(nèi)，在4°C包被至少12小時；包被時間屆滿后，將濃度為lg/100mL的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37°C進(jìn)行封閉反應(yīng)，反應(yīng)時間至少為1小時；封閉反應(yīng)結(jié)束后，用pH = 7. 2的磷酸鹽緩沖液洗滌多孔板，當(dāng)多孔板上的未反應(yīng)物被去除后即獲得包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板，其保存溫度為4°C ；(2)制備生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)檢測液①以N，N- 二甲基甲酰胺為溶劑，生物素酰-N羥基丁二酰亞胺酯為溶質(zhì)配制濃度為50 μ g/ μ L的酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液，以pH = 9. 6的碳酸鹽緩沖液為溶劑，抗人 Adipsin單克隆抗體為溶質(zhì)配制濃度為2%ig/mL的抗人Adipsin單克隆抗體溶液，將所述酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液和所述抗人Adipsin單克隆抗體溶液的混合液在攪拌下于室溫反應(yīng)至少4小時，即獲得生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)； 反應(yīng)結(jié)束后，將含生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)的反應(yīng)液裝入透析袋中，用PH = 9. 2的磷酸鹽緩沖液在4°C進(jìn)行透析，透析時間至少為12小時，其間更換透析液至少3次；繼后在透析后的所述反應(yīng)液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到3g 6g/100mL為限；②將步驟①制備的含生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體 (Biotin-AdipsinAb)和牛血清白蛋白的透析后反應(yīng)液與甘油按體積比1 1計量，在室溫下混合均勻即形成生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)檢測液，其保存溫度為-20°C ；C3)配備親和素-辣根過氧化物酶、顯色底物3' ,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和 Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。所述親和素-辣根過氧化物酶、3'，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和 Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品均為市售商品，可直接從市場購買。本發(fā)明所述方法中，制備包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板時，所述抗人 Adipsin單克隆抗體稀釋液的加入量優(yōu)選100 μ L/孔，所述濃度為lg/100mL的牛血清白蛋白溶液的加入量為120 μ L/孔。本發(fā)明所述方法中，制備生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體 (Biotin-AdipsinAb)時，優(yōu)選按酰-N羥基丁二酰亞胺酯與抗人Adipsin單克隆抗體的質(zhì)量比=0. 5 i 7量取所述酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液和所述抗人Adipsin單克隆抗體溶液形成混合液。為方便用戶，本發(fā)明所述方法還配備了樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度 0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液(PBS)或濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液，TBS)中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到Ig 2g/100mL為限。本發(fā)明具有以下有益效果(1)本發(fā)明為子癇前期的檢測提供了一種采用新檢測指標(biāo)的試劑盒及其制備方法。(2)使用本發(fā)明所述試劑盒，可定量檢測出妊娠婦女的尿樣本中Adipsin的準(zhǔn)確含量。(3)使用本發(fā)明所述試劑盒對確診子癇前期婦女和健康妊娠婦女進(jìn)行采樣檢測 (見實施例幻，檢測結(jié)果表明該試劑盒的敏感性為90%，特異性為80%左右，因而可提高子癇前期檢測的準(zhǔn)確性。(4)由于檢測樣品是妊娠婦女的尿樣本，因而是一種無創(chuàng)檢測。本發(fā)明所述試劑盒適用于所有妊娠期婦女。


圖1是本發(fā)明所述以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒中多孔板的一種形狀構(gòu)造示意圖。圖2為A450值-Adipsin濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實施例方式下面通過實施例對本發(fā)明所述以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒及其制備方法和使用方法作進(jìn)一步說明。下述實施例中涉及的材料來源如下鼠抗人Adipsin單克隆抗體，購自美國R&D公司或RayBiotec公司；Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，購自美國R&D公司或RayBiotec公司；碳酸鹽緩沖液(CB)，購自美國sigma公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)，購自美國sigma公司；三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液，TBS)，購自美國sigma公司；牛血清白蛋白，購自美國sigma公司；N，N-二甲基甲酰胺，購自美國sigma公司；酰-N羥基丁二酰亞胺酯，購自美國sigma公司；甘油的規(guī)格是分析醇，購自美國sigma公司；辣根過氧化物酶，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；3'，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；多孔板為96孔的多孔板，購自丹麥Nunc公司，其形狀和構(gòu)造如圖1所示。實施例1本實施例中，采用以下工藝步驟制備以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑
ιπτ.(1)制備包被有鼠抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板用pH = 9的碳酸鹽緩沖液將鼠抗人Adipsin單克隆抗體稀釋為濃度10 μ g/mL 的稀釋液，在抗體稀釋液中加入無水甲醇，無水甲醇的加入量以其濃度達(dá)到3mL/100mL為限，然后將所述含甲醇的鼠抗人Adipsin單克隆抗體稀釋液按100 μ L/孔的量加入96孔板的各孔內(nèi)，在4°C包被12小時；包被時間屆滿后，將濃度lg/100mL的牛血清白蛋白溶液按 120 μ L/孔的量加入多孔板上的各孔并在37°C進(jìn)行封閉反應(yīng)，反應(yīng)時間為1小時；封閉反應(yīng)結(jié)束后，用PH = 7. 2、濃度為0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌多孔板，當(dāng)多孔板上的未反應(yīng)物被去除后即獲得包被有鼠抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板，然后將其置于4°C冰箱中保存?zhèn)溆茫?2)制備生物素標(biāo)記的鼠抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)檢測液①以N，N- 二甲基甲酰胺為溶劑，生物素酰-N羥基丁二酰亞胺酯為溶質(zhì)配制濃度為50 μ g/ μ L的酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液，以pH = 9. 6、濃度為lmol/L的碳酸鹽緩沖液為溶劑、鼠抗人Adipsin單克隆抗體為溶質(zhì)配制濃度為2%ig/mL的鼠抗人Adipsin單克隆抗體溶液，按酰-N羥基丁二酰亞胺酯與與鼠抗人Adipsin單克隆抗體的質(zhì)量比=1 7 量取所述酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液和所述鼠抗人Adipsin單克隆抗體溶液形成混合液， 將所述酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液和所述鼠抗人Adipsin單克隆抗體溶液的混合液在攪拌下(磁力攪拌器，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分)于室溫反應(yīng)4小時，即獲得生物素標(biāo)記的鼠抗人 Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)；反應(yīng)結(jié)束后，將含生物素標(biāo)記的鼠抗人Adipsin 單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)的反應(yīng)液裝入透析袋中，用pH = 9. 2、濃度為0. 05mol/L的磷酸鹽緩沖液在4°C進(jìn)行透析，透析時間為12小時，其間更換透析液3次；繼后在透析后的所述反應(yīng)液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到4g/100mL 為限；②將步驟①制備的含生物素標(biāo)記的鼠抗人Adipsin單克隆抗體 (Biotin-AdipsinAb)和牛血清白蛋白的透析后反應(yīng)液與甘油按體積比1 1計量，在室溫下混合均勻即形成生物素標(biāo)記的鼠抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)檢測液， 其保存溫度為-20°C ；(3)每個試劑盒配備親和素-辣根過氧化物酶12mL、顯色底物3' ,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺12mL、Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(Adipsin的濃度為lOng/mL) ImL和樣本稀釋液 30mL，樣本稀釋液是在濃度濃度0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液(Tris緩沖液，TBS) 中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到2g/100mL為限； 所述親和素-辣根過氧化物酶與生物素標(biāo)記的鼠抗人Adipsin單克隆抗體檢測液的體積比為 1 1。實施例2本實施例以實施例1制備的子癇前期檢測試劑盒對待測樣本進(jìn)行檢測。1、待測樣本(1)標(biāo)樣準(zhǔn)備將實施例1所述試劑盒中配備的Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)為含Adipsin濃度最高的標(biāo)樣，命名為標(biāo)樣1，其Adipsin的濃度為6ng/mL，然后用實施例1所述試劑盒中配備的樣本稀釋液將所述Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋成Adipsin濃度為2000pg/mL、666. 7pg/mL、 222. 2pg/mL、74. 07pg/mL、24. 69pg/mL、8. 23pg/mL 的標(biāo)樣，依次命名為標(biāo)樣 2、標(biāo)樣 3、標(biāo)樣 4、標(biāo)樣5、標(biāo)樣6和標(biāo)樣7，共計有7個標(biāo)樣。(2)試樣以四川大學(xué)華西第二醫(yī)院門診及住院的孕婦為實驗對象，根據(jù)現(xiàn)有檢測方法的檢測結(jié)果將實驗對象分為子癇組和健康對照組，收集兩組孕婦的尿樣本作為試樣，共計40個試樣，其中，試樣1-20取自于子癇組，試樣21-40取自于健康對照組。(3)空白對照實施例1所述試劑盒中配備的樣本稀釋液——為空白對照。2、樣本檢測(1)檢測前將試劑盒的所有試劑、待測樣本緩慢均衡至室溫(18°C 25°C )；(2)將步驟1所準(zhǔn)備的標(biāo)樣、空白對照、試樣分別加入包被有鼠抗人Adipsin單克隆抗體的96孔板上的相應(yīng)加樣孔中，各標(biāo)樣、空白對照、試樣均設(shè)復(fù)孔對照；各加樣孔中的加樣量為100 μ L。用膠膜遮蓋所述96孔板，并將所述96孔板置于振搖儀上在振搖狀態(tài)下室溫孵育2. 5小時，振搖速度為100轉(zhuǎn)/分。(3)孵育時間屆滿后，吸盡各加樣孔中的液體，在自動洗板機上設(shè)置清洗程序，以 400 μ L/孔洗液(濃度0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液或濃度為0. 02mol/L的Tris緩沖液)將每個加樣孔清洗兩次，每次清洗時，洗液需在孔中停留10秒 15秒；清洗完畢后，將96孔板翻轉(zhuǎn)，使各加樣孔孔口向下，在吸水濾紙上輕拍使各加樣孔中殘留的洗液完全去除。(4)向96孔板上的各加樣孔中分別加入100 μ L生物素標(biāo)記的鼠抗人Adipsin單克隆抗體(Biotin-AdipsinAb)檢測液，然后用膠膜遮蓋所述96孔板，并將所述96孔板置于振搖儀上在振搖狀態(tài)下室溫孵育1. 5小時，振搖速度為100轉(zhuǎn)/分；孵育時間屆滿后，吸盡各加樣孔中的液體，按步驟C3)所述方法清洗所述96孔板。(5)向所述96孔板上的各加樣孔中分別加入100 μ L親和素-辣根過氧化物酶，然后用膠膜遮蓋所述96孔板，并將所述96孔板置于振搖儀上在振搖狀態(tài)下室溫孵育1. 5小時，振搖速度為100轉(zhuǎn)/分；孵育時間屆滿后，吸盡各加樣孔中的液體，按步驟C3)所述方法清洗所述96孔板。(6)向所述96孔板上的各加樣孔中分別加入IOOyL 3'，3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺，然后在室溫避光孵育10分鐘，孵育時間屆滿后，向各加樣孔中分別加入100 μ L終止液，所述終止液為硫酸和亞硫酸鈉配制的水溶液，硫酸的濃度為2mol/L，亞硫酸鈉的濃度為 0.lmol/L0(7)將所述96孔板放置在酶標(biāo)儀中，用酶標(biāo)儀測各孔的A450值(光密度值或吸光度值)，所測結(jié)果見下表(表中的A450值為兩孔的加權(quán)平均值)。表1:標(biāo)樣的A450值
權(quán)利要求
1.一種以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒包括包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板、生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體檢測液、 與生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體結(jié)合的親和素-辣根過氧化物酶、顯色底物3‘， 3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒，其特征在于所述多孔板每孔包被抗人Adipsin單克隆抗體0. 9 μ g 1 μ g。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒，其特征在于所述生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體檢測液主要由生物素標(biāo)記的抗人Adipsin 單克隆抗體、牛血清白蛋白、甘油和磷酸鹽緩沖液組成，生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體的濃度為2%ig/mL，牛血清白蛋白的濃度為1.5g 3g/100mL，甘油的濃度為 50mL/100mL。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒，其特征在于所述生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體由生物素酰-N羥基丁二酰亞胺酯和抗人 Adipsin單克隆抗體耦聯(lián)而成，酰-N羥基丁二酰亞胺酯與抗人Adipsin單克隆抗體的質(zhì)量比為0. 5 1 7。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒，其特征在于還包括樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液或濃度0. Olmol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配制而成，牛血清白蛋白的濃度為Ig 2g/100mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒，其特征在于還包括樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液或濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配制而成， 牛血清白蛋白的濃度為Ig 2g/100mL。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒，其特征在于還包括樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液或濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配制而成， 牛血清白蛋白的濃度為Ig 2g/100mL。
8.—種以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒的制備方法，其特征在于工藝步驟如下(1)制備包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板用pH = 8 10的碳酸鹽緩沖液將抗人Adipsin單克隆抗體稀釋為濃度10 μ g/mL的稀釋液，在所述抗人Adipsin單克隆抗體稀釋液中加入無水甲醇，無水甲醇的加入量以其濃度達(dá)到3mL/100mL為限，然后將所述含甲醇的抗人Adipsin單克隆抗體稀釋液加入多孔板的各孔內(nèi)，在4°C包被至少12小時；包被時間屆滿后，將濃度為lg/100mL的牛血清白蛋白溶液加入多孔板上的各孔并在37°C進(jìn)行封閉反應(yīng)，反應(yīng)時間至少為1小時；封閉反應(yīng)結(jié)束后，用pH = 7. 2的磷酸鹽緩沖液洗滌多孔板，當(dāng)多孔板上的未反應(yīng)物被去除后即獲得包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板；(2)制備生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體檢測液①以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，生物素酰-N羥基丁二酰亞胺酯為溶質(zhì)配制濃度為50 μ g/ μ L的酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液，以pH = 9. 6的碳酸鹽緩沖液為溶劑，抗人 Adipsin單克隆抗體為溶質(zhì)配制濃度為2%ig/mL的抗人Adipsin單克隆抗體溶液，將所述酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液和所述抗人Adipsin單克隆抗體溶液的混合液在攪拌下于室溫反應(yīng)至少4小時，即獲得生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體；反應(yīng)結(jié)束后，將含生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體的反應(yīng)液裝入透析袋中，用 PH = 9. 2的磷酸鹽緩沖液在4°C進(jìn)行透析，透析時間至少為12小時，其間更換透析液至少3 次；繼后在透析后的所述反應(yīng)液中加入牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到3g 6g/100mL為限；②將步驟①制備的含生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體和牛血清白蛋白的透析后反應(yīng)液與甘油按體積比1 1計量，在室溫下混合均勻即形成生物素標(biāo)記的抗人Adipsin 單克隆抗體檢測液；(3)配備親和素-辣根過氧化物酶、顯色底物3' ,3' ,5,5'-四甲基聯(lián)苯胺和 Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒的制備方法， 其特征在于還配備樣本稀釋液，所述樣本稀釋液是在濃度0. 01mol/L 0. 02mol/L的磷酸鹽緩沖液或濃度O.Olmol/L 0. 02mol/L的三羥甲基氨基甲烷緩沖液中加入牛血清白蛋白配制而成，所述牛血清白蛋白的加入量以其濃度達(dá)到Ig 2g/100mL為限。
10.根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒的制備方法，其特征在于(1)制備包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板時，所述抗人Adipsin單克隆抗體稀釋液的加入量為IOOyL/孔，所述濃度為lg/100mL的牛血清白蛋白溶液的加入量為 120 μ L/ 孔；(2)制備生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體時，按酰-N羥基丁二酰亞胺酯與抗人 Adipsin單克隆抗體的質(zhì)量比=0.5 1 7量取所述酰-N羥基丁二酰亞胺酯溶液和所述抗人Adipsin單克隆抗體溶液形成混合液。
全文摘要
一種以Adipsin為檢測指標(biāo)的子癇前期檢測試劑盒，包括包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板、生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體檢測液、與生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體結(jié)合的親和素-辣根過氧化物酶、顯色底物3′，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺和Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。上述試劑盒的制備方法有以下工藝步驟(1)制備包被有抗人Adipsin單克隆抗體的多孔板；(2)制備生物素標(biāo)記的抗人Adipsin單克隆抗體檢測液；(3)配備親和素-辣根過氧化物酶、顯色底物3′，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺和Adipsin蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。
文檔編號G01N33/577GK102426243SQ201110365299
公開日2012年4月25日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月17日
發(fā)明者胡懷忠 申請人:成都創(chuàng)宜生物科技有限公司