專利名稱：檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法。
背景技術：
多糖是自然界含量最豐富的高分子化合物，其在自然界分布極其廣泛，高等植物、 藻類、菌類及動物體內均有存在，多糖類物質所具有的多種生物學及藥理功能已經引起人們的高度重視，多糖科學作為后基因組時代異軍突起的學科已納入國際前沿研究領域，多糖具有自身無光學功能團，其分子量在一定范圍內變化等特點，無法直接用高靈敏的紫外、 熒光或質譜檢測器檢測多糖含量，目前，常用的多糖含量檢測方法主要有顯色法、同位素標記法、免疫學法、生物檢定法等，顯色法檢測限約10微克，具有專屬性差等缺點；同位素標記法、免疫學法及生物檢定法檢測限均可小于10納克，但均不能同時測定代謝產物，同位素標記法不適用于人體的藥代研究，且標記可能改變多糖結構，具有抗原決定簇的代謝片斷可能增加免疫學法的誤差等缺點；生物檢定法需要找到靈敏的生化指標，具有應用范圍非常有限等缺點，現(xiàn)有的多糖含量檢測方法以及其它酶聯(lián)免疫法在檢測發(fā)酵液中莢膜多糖含量時具有不能直接檢測，特異性不強，線性和檢測的精密度和準確度較差等缺點。
發(fā)明內容
本發(fā)明的目的即在于克服現(xiàn)有技術的不足，提供一種可直接測量，特異性強，線性和檢測的精密度和準確度較好，可為發(fā)酵階段工藝改進提高重要量化手段的檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟
(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內，樣品液的濃度為10 IOOpg/
ml ；
(2)收集經b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為0.5 1. 5ng/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進行純度檢測，待純度為90%以上時，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體，洗滌除去雜質；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體，洗滌除去未結合的抗體、雜質；
(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，HRP的濃度為0. 5 1. 5ng/ml，洗滌除去未結合的抗原、雜質；
(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標抗體復合物徹底洗滌，除去未結合的酶標抗體、雜質，加入TMB進行顯色反應，TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，在酸的作用下轉化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關；
(6)用酶標儀在400 500nm波長下測定吸光度，通過標準曲線，計算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供一種檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法，采用經高度純化的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標板，并制成酶標記復合物，在兔血清b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體分離純化上，得到單抗，解決了發(fā)酵液莢膜多糖酶聯(lián)免疫檢測法特異性問題，克服了現(xiàn)有檢測方法不能直接、正確檢測發(fā)酵液多糖含量的不足，可直觀、準確、迅速的檢測發(fā)酵液中莢膜多糖的含量，可作為發(fā)酵工藝的重要監(jiān)控手段，為發(fā)酵收罐時間的確定提供了重要的依據(jù)，同時為發(fā)酵工藝的改進提供了量化指標，間接降低了生產成本，保證了收率的穩(wěn)定，具有可直接測量，特異性強，線性和檢測的精密度和準確度均較好， 可為發(fā)酵階段工藝改進提高重要的量化手段等優(yōu)點。
具體實施例方式下面結合實施例對本發(fā)明做進一步的描述，但本發(fā)明的保護范圍不局限于以下所述。實施例1
檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟
(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內，樣品液的濃度為10pg/ml；
(2)收集經b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為0.5ng/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進行純度檢測，待純度為90%以上時，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體，洗滌除去雜質；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體，洗滌除去未結合的抗體、雜質；
(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，HRP的濃度為0. 5ng/ ml，洗滌除去未結合的抗原、雜質；
(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標抗體復合物徹底洗滌，除去未結合的酶標抗體、雜質，加入TMB進行顯色反應，TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，在酸的作用下轉化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關；
(6)用酶標儀在400nm波長下測定吸光度，通過標準曲線，計算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。實施例2
檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟
(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內，樣品液的濃度為100pg/ml；
(2)收集經b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為1.5ng/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進行純度檢測，待純度為90%以上時，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體，洗滌除去雜質；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體，洗滌除去未結合的抗體、雜質；
(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，HRP的濃度為1. 5ng/ml，洗滌除去未結合的抗原、雜質；
(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標抗體復合物徹底洗滌，除去未結合的酶標抗體、雜質，加入TMB進行顯色反應，TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，在酸的作用下轉化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關；
(6)用酶標儀在500nm波長下測定吸光度，通過標準曲線，計算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。 實施例3
檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟
(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內，樣品液的濃度為50pg/ml；
(2)收集經b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為l.Ong/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進行純度檢測，待純度為90%以上時，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體，洗滌除去雜質；
(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體，洗滌除去未結合的抗體、雜質；
(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，HRP的濃度為Ing/ ml，洗滌除去未結合的抗原、雜質；
(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標抗體復合物徹底洗滌，除去未結合的酶標抗體、雜質，加入TMB進行顯色反應，TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，在酸的作用下轉化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關；
(6)用酶標儀在450nm波長下測定吸光度，通過標準曲線，計算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。
權利要求
1.檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法，其特征在于它包括以下步驟(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品置于干凈的容器內，樣品液的濃度為10 IOOpg/ml ；(2)收集經b型流感嗜血桿菌免疫的濃度為0.5 1.5ng/ml的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，用SDS-PAGE電泳進行純度檢測，待純度為90%以上時，即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體；(3)用(2)中所得的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體包被酶標微孔板，制成兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體；(4)往微孔板中逐漸加入發(fā)酵液多糖樣品，加入完全后與用HRP標記的兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖固相抗體結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，HRP的濃度為0. 5 1. 5ng/ml ；(5)將(4)中所得的固相抗體-抗原-酶標抗體復合物徹底洗滌，除去未結合的酶標抗體、雜質，加入TMB進行顯色反應，TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，在酸的作用下轉化成黃色，顏色的深淺和樣品中的b型流感嗜血桿菌莢膜多糖含量呈正相關；(6)用酶標儀在400 500nm波長下測定吸光度，通過標準曲線，計算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖的濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法，它包括以下步驟(1)稱取一定量的發(fā)酵液多糖樣品；(2)收集經b型流感嗜血桿菌免疫的家兔血清，分離并用蛋白A親和層析法純化，待純度為90%以上時即得兔b型流感嗜血桿菌莢膜多糖抗體；(3)用(2)中所得抗體包被酶標微孔板，制成固相抗體；(4)往微孔板中加入樣品，并與用HRP標記的固相抗體結合，形成固相抗體-抗原-酶標抗體復合物；(5)徹底洗滌固相抗體-抗原-酶標抗體復合物，加入TMB進行顯色反應；(6)用酶標儀在400～500nm波長下測吸光度，計算樣品中b型流感嗜血桿菌莢膜多糖濃度。本發(fā)明提供一種檢測發(fā)酵液多糖濃度的方法，具有直接測量，特異性強等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/543GK102507924SQ201110365639
公開日2012年6月20日 申請日期2011年11月17日 優(yōu)先權日2011年11月17日
發(fā)明者曾令學, 朱琳, 朱聰, 李洪光, 楊襄誠, 羅芹, 趙丹, 趙濤, 陳克平, 韓煉 申請人:成都歐林生物科技股份有限公司