專利名稱：一種基于聚苯胺納米金復(fù)合膜免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基于聚苯胺納米金復(fù)合膜免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用，本發(fā)明屬于乳品質(zhì)量檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus)是一種廣泛存在于自然界的革蘭氏陽性球菌。金黃色葡萄球菌的致病能力主要取決于其產(chǎn)腸毒素和酶的能力。金黃色葡萄球菌腸毒素(staphylococcal enterotoxin簡稱SE)，是金黃色葡萄球菌分泌的一種細(xì)胞外毒素，是一組結(jié)構(gòu)相關(guān)，毒力相近的單肽鏈毒性蛋白質(zhì)。按血清學(xué)分類，主要有A、B、Cs、D、 E等血清型，主要存在于肉類，乳類等蛋白質(zhì)含量較高的食物中。Ses熱穩(wěn)定性高，在70 80°C 30min內(nèi)不會被完全破壞，仍有致病性，并且不被胰蛋白酶所降解。
金黃色葡萄球菌腸毒素最初采用的檢測方法就是動物學(xué)試驗(yàn)方法，但是由于實(shí)驗(yàn)動物的來源較困難，而靈敏度又比較低，致使檢測結(jié)果不是很理想。酶聯(lián)免疫法的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標(biāo)記。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達(dá)到很高的靈敏度。酶聯(lián)免疫法靈敏、簡單、快速，并且，技術(shù)人員不需要特別訓(xùn)練，適用于葡萄球菌食物中毒的檢測和鑒定。研究的比較多的是雙抗體夾心法和間接競爭法，其最低檢測量能夠達(dá)到lng/ml，且線性范圍良好。酶聯(lián)免疫方法效果的優(yōu)劣很大部分取決于抗體的制備。
90年代以來，以生物傳感器技術(shù)為基礎(chǔ)的各類生物檢測系統(tǒng)迅速興起，一些快速和采用現(xiàn)代技術(shù)的檢測方法不斷出現(xiàn)，并日趨成熟，不斷的應(yīng)用于各類毒素的檢測中去。利用表面等離子體共振(SPR)傳感技術(shù)針對葡萄球菌腸毒素的檢測最為常見的監(jiān)測對象是抗原/抗體的相互識別過程，抗原抗體反應(yīng)特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，響應(yīng)時(shí)間往往在十幾分鐘左右。利用Sra技術(shù)對葡萄球菌腸毒素B進(jìn)行測定，其檢出限可達(dá)到ng/ml級， 響應(yīng)時(shí)間IOmin左右。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測金黃色葡萄球菌腸毒素的免疫傳感器的制備方法。
本發(fā)明提供如下技術(shù)方案將聚苯胺納米金液體滴涂于經(jīng)過清潔的金電極表面， 室溫下靜置，待修飾完全后，在修飾好的電極表面上滴加金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，孵育20 lOOmin，以BSA-PBS封閉20 140Min，制得基于聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。
所述金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體為市場上購買或制備得到，制備方法見 Jeremy Μ. Yarwood, John K.McCormick，Michael L Paustian，Vivek Kapur, and Patrick M.Schlievert， Repression of the Staphylococcus aureus Accessory Gene Regulatorin Serum and In Vivo, JOURNAL OF BACTERIOLOGY, Feb. 2002,p.1095-1101。所述聚苯胺納米金液體是將HAuCl4溶解于水中，待其沸騰，加入檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)5-15min后，依次加入氫氧化鈉溶液、苯胺溶液、過硫酸鈉溶液，攪拌條件下沸騰 20-50min,停止加熱，攪拌至室溫。優(yōu)選地，所述聚苯胺納米金液體制備方法如下將250 μ L 4%的HAuCl4溶解于 IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應(yīng)8min后，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. lmolL"1的苯胺溶液1000 μ L、0. ImoIL"1的過硫酸鈉溶液1500 μ L， 攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至室溫。優(yōu)選地，金電極清潔方法如下將金電極(φ = 2mm)置于Piranha溶液中浸泡 15Min,依次用0. 3，0. 05 μ m的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用再用1 1 (體積比) 的硝酸、無水乙醇、超純水超聲清洗5min，氮?dú)獯蹈桑?°C備用；優(yōu)選地，在修飾好的電極表面上滴加IOul 200 900ug/ml金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，37°C孵育20 lOOmin，以1 % BSA_PBS37°C下封閉20 140Min，制得基于聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。上述抗體濃度為700ug/ml時(shí)，材料所結(jié)合的抗體達(dá)到飽和狀態(tài)，若抗體濃度過高，則會造成抗體的浪費(fèi)；上述抗體孵育時(shí)間為60min，當(dāng)抗體濃度為60min時(shí)，抗體能夠最大程度的結(jié)合在材料上；所述的封閉時(shí)間為120min，當(dāng)封閉時(shí)間達(dá)到120min時(shí)，1 % BSA-PBS能夠較好的封閉住抗體的未結(jié)合位點(diǎn)。本發(fā)明還提供了一種所述免疫傳感器的應(yīng)用，步驟如下取出已修飾完成的金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫電極，依次滴加10 μ L不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品37°C孵育5 30min后，采用循環(huán)伏安法和交流阻抗法考察工作電極界面的變化，并對電極表進(jìn)行表征。CV測試條件電壓0. 2-0. 6V，掃描速率0. lV/s ；EIS測試條件初幅0. 05V，頻率為 1 100kHz，靜置時(shí)間2s。反應(yīng)介質(zhì)液為2. 5mmolFe (CN)63^溶液(所有測試均在室溫下進(jìn)行)。所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品孵育時(shí)間為5 30min，優(yōu)選地，所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品孵育時(shí)間為25min，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到25min時(shí)，金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體能夠充分與金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)。所述依次滴加的不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0. 1、0.5、 l、2、3、4、5、6、7、8ng/ml，模擬電路得到阻抗值，以金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，阻抗值的大小為縱坐標(biāo)作圖，得到金黃色葡萄球菌腸毒素B自組裝免疫電極檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。阻抗值的大小與金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別在0. 1 Sng/ ml之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程分別為Y = 1262. 2x+1540. 8，相關(guān)系數(shù)分別為R2 = 0. 9932，最低檢測限為0. 033ng/ml。金黃色葡萄球菌腸毒素B的分析方法如下電化學(xué)工作站CHI760在初幅0. 05V, 頻率為1 IOOkHz的條件下，在反應(yīng)介質(zhì)液為2. 5mm0lFe(CN)63-/4-溶液中進(jìn)行測量，采用 EIS法，并通過最佳等效電路計(jì)算，以工作電極經(jīng)BSA封閉后的阻抗值作為空白交流阻抗值 Ret(Ab)，以此電極與含有不同濃度金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品中反應(yīng)后在同一電解液中所測阻抗值為Rrt (Ab-Ag)，求出在不同金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品濃度中Rrt的變化值 ARrt:Δ Ret = Ret (Ab-Ag) -Ret (Ab)Ret (Ab)空白交流阻抗值；Ret(Ab-Ag)與金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后的電極電子傳遞電阻值；ARet 反應(yīng)前后極電子傳遞電阻的變化值；以電子傳遞電阻的變化值和金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系作圖， 即得金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫傳感器的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。金黃色葡萄球菌腸毒素B的回收率將樣品以PBS(PH = 7. 4)稀釋至一定濃度后，應(yīng)用自組裝免疫傳感器對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測定。本發(fā)明的方法具有下述有益效果(1)聚苯胺納米金復(fù)合膜結(jié)構(gòu)改善了納米金離子的分散性，有效的阻止了金的聚合，從而使其分散的更為均勻。(2)聚苯胺納米金復(fù)合膜結(jié)構(gòu)有效的促進(jìn)了電子的轉(zhuǎn)移，進(jìn)而有效的提高材料本身的傳導(dǎo)性，大大降低了檢測限。(3)自組裝免疫傳感器能夠結(jié)合多種材料的優(yōu)點(diǎn)，充分發(fā)揮抗原抗體特異性結(jié)合的優(yōu)勢，極大的降低檢測限。


圖1表示自組裝免疫傳感器的組裝示意圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 免疫傳感器的制備方法步驟A:將250yL 4%的HAuCl4溶解于IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應(yīng)8min后，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. lmolL—1的苯胺溶液1000 μ L、0. Imoir1的過硫酸鈉溶液1500 μ L，攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至
室溫；步驟B 將金電極(Φ = 2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0. 3， 0.05μπι的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用再用1 1(體積比)的硝酸、無水乙醇、 超純水超聲清洗5min，氮?dú)獯蹈桑?°C備用；步驟C 將步驟A得到的聚苯胺納米金液體滴涂于步驟B中徹底清潔的金電極表面，室溫下靜置，待修飾完全后，在修飾好的電極表面上滴加IOul 700ug/ml金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，37°C孵育60min，以1 % BSA_PBS37°C下封閉120Min，制得基于聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。實(shí)施例2 免疫傳感器的制備方法步驟A:將250yL 4%的HAuCl4溶解于IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應(yīng)8min后，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. lmolL—1的苯胺溶液1000 μ L、0. Imoir1的過硫酸鈉溶液1500 μ L，攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至
室溫；
步驟B 將金電極(Φ = 2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0. 3， 0.05μπι的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用再用1 1(體積比)的硝酸、無水乙醇、 超純水超聲清洗5min，氮?dú)獯蹈桑?°C備用；步驟C 將步驟A得到的聚苯胺納米金液體滴涂于步驟B中徹底清潔的金電極表面，室溫下靜置，待修飾完全后，在修飾好的電極表面上滴加IOul 200ug/ml金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，37°C孵育20min，以1 % BSA_PBS37°C下封閉20Min，制得基于聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。實(shí)施例3 免疫傳感器的制備方法步驟A:將250yL 4%的HAuCl4溶解于IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應(yīng)8min后，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. lmolL—1的苯胺溶液1000 μ L、0. Imoir1的過硫酸鈉溶液1500 μ L，攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至
室溫；步驟B 將金電極(Φ = 2mm)置于Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0. 3，
0.05μπι的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用再用1 1(體積比)的硝酸、無水乙醇、 超純水超聲清洗5min，氮?dú)獯蹈桑?°C備用；步驟C 將步驟A得到的聚苯胺納米金液體滴涂于步驟B中徹底清潔的金電極表面，室溫下靜置，待修飾完全后，在修飾好的電極表面上滴加IOul 900ug/ml金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，37°C孵育lOOmin，以BSA_PBS37°C下封閉140Min，制得基于聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。實(shí)施例4 取出已修飾完成的金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫電極，依次滴加10 μ L不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品37°C孵育5 30min后，采用循環(huán)伏安法和交流阻抗法考察工作電極界面的變化，并對電極表進(jìn)行表征。CV測試條件電壓0. 2-0. 6V，掃描速率0. lV/s ；EIS測試條件初幅0. 05V，頻率為 1 100kHz，靜置時(shí)間2s。反應(yīng)介質(zhì)液為2. 5mmolFe (CN)63^溶液(所有測試均在室溫下進(jìn)行)。所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品孵育時(shí)間為5 30min，優(yōu)選地，所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品孵育時(shí)間為25min，當(dāng)孵育時(shí)間達(dá)到25min時(shí)，金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體能夠充分與金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)。所述依次滴加的不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品的濃度為0. 1、0.5、
1、2、3、4、5、6、7、8ng/ml，模擬電路得到阻抗值，以金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，阻抗值的大小為縱坐標(biāo)作圖，得到金黃色葡萄球菌腸毒素B自組裝免疫電極檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線。阻抗值的大小與金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品的濃度分別在0. 1 Sng/ ml之間存在良好的線性關(guān)系，線性方程分別為Y = 1262. 2x+1540. 8，相關(guān)系數(shù)分別為R2 = 0. 9932，最低檢測限為0. 033ng/ml。金黃色葡萄球菌腸毒素B的分析方法如下電化學(xué)工作站CHI760在初幅0. 05V, 頻率為1 IOOkHz的條件下，在反應(yīng)介質(zhì)液為2. 5mm0lFe(CN)63-/4-溶液中進(jìn)行測量，采用 EIS法，并通過最佳等效電路計(jì)算，以工作電極經(jīng)BSA封閉后的阻抗值作為空白交流阻抗值 Ret(Ab)，以此電極與含有不同濃度金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品中反應(yīng)后在同一電解液中所測阻抗值為Rrt (Ab-Ag)，求出在不同金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品濃度中Rrt的變化值 ARrt:Δ Ret = Ret (Ab-Ag) -Ret (Ab)Ret (Ab)空白交流阻抗值；Ret(Ab-Ag)與金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)后的電極電子傳遞電阻值；ARet 反應(yīng)前后極電子傳遞電阻的變化值；以電子傳遞電阻的變化值和金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度的關(guān)系作圖， 即得金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫傳感器的檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線。金黃色葡萄球菌腸毒素B的回收率將樣品以PBS(PH = 7. 4)稀釋至一定濃度后，應(yīng)用自組裝免疫傳感器對樣品進(jìn)行加標(biāo)回收測定。根據(jù)上述測定方法與分析方法得到脫脂乳粉在^g/ml的加標(biāo)濃度下的回收率為 92%。實(shí)施例5 根據(jù)實(shí)施例4測定方法與分析方法得到脫脂乳在0. 5ng/ml的加標(biāo)濃度下的回收率為84%。實(shí)施例6 根據(jù)實(shí)施例4測定方法與分析方法得到鮮牛乳在^g/ml的加標(biāo)濃度下的回收率為 111%。
權(quán)利要求
1.一種基于聚苯胺納米金復(fù)合膜免疫傳感器的制備方法，其特征在于，將聚苯胺納米金液體滴涂于經(jīng)過清潔的金電極表面，室溫下靜置，待修飾完全后，在修飾好的電極表面上滴加金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體，孵育20 lOOmin，以BSA-PBS封閉20 140Min，制得基于聚苯胺修飾納米金自組裝免疫傳感器。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述聚苯胺納米金液體制備方法如下將 HAuCl4溶解于水中，待其沸騰，加入檸檬酸鈉溶液，反應(yīng)5-15min后，依次加入氫氧化鈉溶液、苯胺溶液、過硫酸鈉溶液，攪拌條件下沸騰20-50min，停止加熱，攪拌至室溫。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述聚苯胺納米金液體制備方法如下將250 μ L 4%的HAuCl4溶解于IOOmL水中，待其沸騰，加入800 μ L 4%的檸檬酸鈉，反應(yīng)8min后，依次加入0. 2moir1的氫氧化鈉溶液1200 μ L、0. ImoIL"1的苯胺溶液1000 μ L、 0. Imoir1的過硫酸鈉溶液1500 μ L，攪拌條件下沸騰30min，停止加熱，攪拌至室溫。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，金電極清潔方法如下將金電極置于 Piranha溶液中浸泡15Min，依次用0. 3、0. 05 μ m的Al2O3拋光粉將電極表面拋成鏡面，再用體積比1 1的硝酸、無水乙醇、超純水超聲清洗5min，氮?dú)獯蹈桑?°C備用。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體滴加量為 200 900ug/ml。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述金黃色葡萄球菌腸毒素B抗體滴加量為 700ug/ml。
7.—種權(quán)利要求1所述方法構(gòu)建的免疫電極的應(yīng)用，其特征在于，步驟如下取出已修飾完成的金黃色葡萄球菌腸毒素B免疫電極，依次滴加10 μ L不同濃度的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品37°C孵育5 30min后，采用循環(huán)伏安法和交流阻抗法考察工作電極界面的變化，并對電極表進(jìn)行表征。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的金黃色葡萄球菌腸毒素B標(biāo)準(zhǔn)品孵育時(shí)間為25min。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種基于聚苯胺納米金復(fù)合膜免疫傳感器的制備方法及其應(yīng)用，通過制備聚苯胺納米金復(fù)合膜，提高了材料自身傳導(dǎo)性，并成功應(yīng)用于免疫傳感器中，極大的降低了傳感器的檢測限并獲得了更好的穩(wěn)定性，采用循環(huán)伏安法及交流阻抗法對傳感器進(jìn)行表征與測定，建立了金黃色葡萄球菌腸毒素B檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性范圍在0.1～8ng/ml之間，相關(guān)系數(shù)為R2＝0.9932，檢測限為0.033ng/ml(S/N＝3)。本發(fā)明特異性良好，乳品檢測回收率在84～111％之間，可再生使用，穩(wěn)定性好，可應(yīng)用于乳品中的金黃色葡萄球菌腸毒素B快速檢測，具有非常廣泛的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N27/327GK102520187SQ20111037755
公開日2012年6月27日 申請日期2011年11月23日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月23日
發(fā)明者吳龍?jiān)? 孫秀蘭, 張銀志, 李在均, 田秀梅, 高博 申請人:江南大學(xué)