專(zhuān)利名稱(chēng)：乙醇濃度檢測(cè)試劑盒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種乙醇濃度檢測(cè)試劑盒，以及該試劑盒的制備方法。
背景技術(shù)：
近年來(lái)，酒后引起的刑事案件和酒后駕車(chē)引起的交通事故案不斷上升，2011年5 月1日《中華人民共和國(guó)刑法修正案(八)》正式實(shí)施，醉酒駕駛作為危險(xiǎn)駕駛罪被追究駕駛?cè)诵淌仑?zé)任，有關(guān)酒駕的話(huà)題再次成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。目前，許多國(guó)家都制定了血液中乙醇濃度與交通事故責(zé)任認(rèn)定的關(guān)系，建立了多種能夠檢測(cè)血液中乙醇含量的方法，如GM/ MS法等，雖然這些方法可以準(zhǔn)確定量，但是存在著購(gòu)買(mǎi)儀器價(jià)格昂貴，檢測(cè)成本高，需專(zhuān)門(mén)培訓(xùn)，無(wú)法在案發(fā)現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的缺點(diǎn)。在我國(guó)，對(duì)醉酒駕駛的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)主要使用呼氣式乙醇測(cè)定儀，根據(jù)國(guó)家相關(guān)規(guī)定， 氣體中酒精含量的檢測(cè)設(shè)備有燃料電池式和半導(dǎo)體氣敏元件式。由于檢測(cè)駕駛員是否飲酒，是根據(jù)駕駛員呼出氣體來(lái)測(cè)量的，呼氣壓力的大小直接影響測(cè)量結(jié)果，此外，呼出氣體酒精含量探測(cè)器是靠空氣中酒精標(biāo)準(zhǔn)氣體來(lái)校準(zhǔn)的，空氣中酒精標(biāo)準(zhǔn)氣體量值的準(zhǔn)確性決定了檢定結(jié)果的準(zhǔn)確性，由于乙醇在常溫下是液體，且沸點(diǎn)較高(78. 5°C )，因揮發(fā)及汽化不完全使配制較高濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)氣體均勻性不太理想，這使呼出氣體酒精含量探測(cè)器的檢定重復(fù)性難于保證，兩次檢定結(jié)果相差很大，同時(shí)其價(jià)格也十分昂貴，而且不衛(wèi)生，容易發(fā)生交叉感染疾病。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種乙醇濃度檢測(cè)試劑盒，用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)醉酒者的乙醇濃度時(shí)簡(jiǎn)便衛(wèi)生、速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性高，且該試劑盒易攜帶、尤其適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。一種乙醇濃度檢測(cè)試劑盒，由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡組成，其中試劑條為寬0. 5-lcm 的濾紙條，濾紙條上含有固相化的乙醇脫氫酶、黃遞酶、氧化型INT及輔酶，標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括不同乙醇濃度的顯色比對(duì)區(qū)。該乙醇濃度檢測(cè)試劑盒的反應(yīng)原理為采用循環(huán)酶法進(jìn)行測(cè)定乙醇濃度。具體為 輔酶和乙醇在乙醇脫氫酶的作用下生成乙醛和還原型輔酶，生成的還原型輔酶在黃遞酶的作用下，與色原物質(zhì)氧化型INT (硝基四氮唑藍(lán))發(fā)生顯色反應(yīng)，生成紅色的還原型INT和
輔酶。反應(yīng)步驟如下
乙解脫氧酷
(1)乙醇+輔酶乙醛+還原型輔酶1
(2)還原型輔酶1 +氧化型INT 趙, ”輔酶+還原型INT
生成的紅色還原型INT的顏色深淺和顯色速度的快慢與樣品中乙醇的濃度成線(xiàn)性關(guān)系。將試劑條直接放入嘴中，或蘸取少量已吐入器皿的唾液，等待10秒鐘后，與標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡進(jìn)行比對(duì)，半定量測(cè)定醉酒者唾液中的乙醇濃度。而根據(jù)人體唾液和血液中乙醇濃度一致性的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，人體唾液中乙醇濃度即人體血液中乙醇濃度。
所述輔酶為NAD (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸)、NADP (煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸)、 thio-NAD (硫代氧化型輔酶I)中的一種。
作為優(yōu)選，所述標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括乙醇濃度分別為Omg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、 1. 5mg/ml、3. Omg/ml的五個(gè)顯色比對(duì)區(qū)。
本發(fā)明結(jié)合循環(huán)酶法、酶比色法和酶偶聯(lián)法，解決了酶比色法檢測(cè)需要加入反應(yīng)促進(jìn)劑使反應(yīng)盡快達(dá)終，但反應(yīng)促進(jìn)劑又對(duì)乙醇脫氫酶有抑制作用的問(wèn)題，并且乙醇脫氫酶的運(yùn)用保證了反應(yīng)的專(zhuān)一性和測(cè)定的高特異性，使其靈敏度較現(xiàn)有技術(shù)的酶比色法大大提高。由于該試劑盒為試劑條，一人一條，非常衛(wèi)生，且10秒鐘即可判斷檢測(cè)結(jié)果，檢測(cè)速度快。由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡組成的試劑盒攜帶方便，尤其適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
本發(fā)明還提供該乙醇濃度檢測(cè)試劑盒的制備方法，用該制備方法制得的試劑盒在保證檢測(cè)精確和準(zhǔn)確性的同時(shí)，成本低廉。
該乙醇濃度檢測(cè)試劑盒的制備方法包括試劑條的制備和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備，其中
試劑條的制備包括以下步驟
(1)配制乙醇脫氫酶和黃遞酶的酶混合液將乙醇脫氫酶與黃遞酶溶于pH 7. 0-9.0的0. 05-2M三羥甲基氨基緩沖液中，使每毫升緩沖液中每個(gè)酶的總活性為 100-1000U ；
(2)配制氧化型INT溶液將I-IOg INT溶于50_500ml乙二醇中；
(3)配制輔酶溶液將I-IOg輔酶溶于50_500ml水中；
(4)酶和底物的固相化將濾紙浸入步驟(1)配制的酶混合液中，取出濾紙干燥； 接著將步驟( 配制的氧化型INT溶液滴在已干燥的濾紙上，干燥；然后將步驟C3)配制的輔酶溶液滴在已干燥的濾紙上，干燥；
(5)制備試劑條將步驟⑷中干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端， 用切紙機(jī)切成寬0. 5-lcm的長(zhǎng)條，即成檢測(cè)試劑條。
標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備步驟為
將濃度為0mg/ml、0. 2mg/ml,0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的乙醇分別滴加到上述制備成的試紙條上，30°C熱風(fēng)、避光下干燥lOmin，用掃描儀輸入電腦中，用photoshop軟件吸管測(cè)量顏色信息(RGB模式)，根據(jù)每個(gè)濃度梯度顏色值用Photoshope. 0軟件制成5個(gè)梯度(Omg/ml,0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)比色卡，即成標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡。
該試劑盒的制備方法按照上述循環(huán)酶法的原理進(jìn)行制備，保證了試劑盒檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性，所用試劑全部進(jìn)行固相化于濾紙，故易于保存、穩(wěn)定性好。另外，該試劑盒用常規(guī)的實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行制備，且無(wú)需用到價(jià)格昂貴的儀器，故該試劑盒的制備方法成本低。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步具體描述，但不局限于此。
實(shí)施例1
本實(shí)施例乙醇濃度檢測(cè)試劑盒由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡組成，其中試劑條為寬 0. 5cm的濾紙條，濾紙條上含有固相化的乙醇脫氫酶、黃遞酶、氧化型INT溶液及輔酶，標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括不同乙醇濃度的顯色比對(duì)區(qū)。所述輔酶為NAD。所述標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括乙醇濃度分別為 0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的五個(gè)顯色比對(duì)區(qū)。
該乙醇濃度檢測(cè)試劑盒的制備方法包括試劑條的制備和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備，其中
試劑條的制備包括以下步驟
(1)配制乙醇脫氫酶和黃遞酶溶液將乙醇脫氫酶與黃遞酶溶于pH 7. O的0. IM 三羥甲基氨基緩沖液中，使每毫升緩沖液中每個(gè)酶的總活性為IOOU ；
(2)配制INT溶液將Ig INT溶于IOOml乙二醇中。
(3)配制NAD溶液將Ig NAD溶于50ml水中。
(4)酶和底物的固相化將濾紙浸入步驟(1)配制的酶混合液中，取出濾紙?jiān)?0°C 熱風(fēng)、避光下干燥30min;將步驟(2)配制的INT溶液均勻地滴在已干燥的濾紙上，再經(jīng) 30°C熱風(fēng)、避光下干燥30min ；將步驟(；3)配制的NAD溶液均勻地滴在已干燥的濾紙上，再經(jīng)30°C熱風(fēng)、避光下干燥30min。
(5)制備試紙條把干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端，用切紙機(jī)切成寬0. 5cm的長(zhǎng)條，即制成檢測(cè)試劑條。
標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備步驟為將濃度為Omg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、 3. Omg/ml的乙醇分別滴加到上述制備成的試紙條上，30°C熱風(fēng)、避光下干燥lOmin，用掃描儀輸入電腦中，用photoshop軟件吸管測(cè)量顏色信息(RGB模式)，根據(jù)每個(gè)濃度梯度顏色值用 Photoshop6. 0 軟件制成 5 個(gè)梯度(0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml)的標(biāo)準(zhǔn)比色卡，即成標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡。
實(shí)施例2
本實(shí)施例乙醇濃度檢測(cè)試劑盒由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡組成，其中試劑條為寬 0. 5cm的濾紙條，濾紙條上含有固相化的乙醇脫氫酶、黃遞酶、氧化型INT溶液及輔酶，標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括不同乙醇濃度的顯色比對(duì)區(qū)。所述輔酶為thio-NAD。所述標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括乙醇濃度分別為 0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的五個(gè)顯色比對(duì)區(qū)。
該乙醇濃度檢測(cè)試劑盒的制備方法包括試劑條的制備和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備，其中
試劑條的制備包括以下步驟
(1)配制乙醇脫氫酶和黃遞酶溶液將乙醇脫氫酶與黃遞酶溶于PH 8. 0的0. 2M 三羥甲基氨基緩沖液中，使每毫升緩沖液中每個(gè)酶的總活性為500U ；
(2)配制INT溶液將5g INT溶于50ml乙二醇中。
(3)配制 thio-NAD 溶液將 2g thio-NAD 溶于 50ml 水中。
(4)酶和底物的固相化將濾紙浸入步驟(1)配制的酶混合液中，取出濾紙?jiān)?0°C 熱風(fēng)、避光下干燥60min ；將步驟( 配制的INT溶液均勻地滴在已干燥的濾紙上，再經(jīng) 30°C熱風(fēng)、避光下干燥60min;將步驟(3)配制的NAD溶液均勻地滴在已干燥的濾紙上，再經(jīng)30°C熱風(fēng)、避光下干燥60min。
(5)制備試紙條把干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端，用切紙機(jī)切成寬0. 5cm的長(zhǎng)條，即制成檢測(cè)試劑條。
標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備步驟同實(shí)施例1。
實(shí)施例3
本實(shí)施例乙醇濃度檢測(cè)試劑盒由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡組成，其中試劑條為寬 0. 5cm的濾紙條，濾紙條上含有固相化的乙醇脫氫酶、黃遞酶、氧化型INT溶液及輔酶，標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括不同乙醇濃度的顯色比對(duì)區(qū)。所述輔酶為NADP。所述標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括乙醇濃度分別為 0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的五個(gè)顯色比對(duì)區(qū)。
該乙醇濃度檢測(cè)試劑盒的制備方法包括試劑條的制備和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備，其中
試劑條的制備包括以下步驟
(1)配制乙醇脫氫酶和黃遞酶溶液將乙醇脫氫酶與黃遞酶溶于pH 9. O的0. IM 三羥甲基氨基緩沖液中，使每毫升緩沖液中每個(gè)酶的總活性為IOOOU ；
(2)配制INT溶液將IOg INT溶于50ml乙二醇中。
(3)配制NADP溶液將IOg NADP溶于50ml水中。
(4)酶和底物的固相化將濾紙浸入步驟(1)配制的酶混合液中，取出濾紙?jiān)?0°C 熱風(fēng)、避光下干燥60min ；將步驟( 配制的INT溶液均勻地滴在已干燥的濾紙上，再經(jīng) 30°C熱風(fēng)、避光下干燥60min;將步驟(3)配制的NAD溶液均勻地滴在已干燥的濾紙上，再經(jīng)30°C熱風(fēng)、避光下干燥60min。
(5)制備試紙條把干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端，用切紙機(jī)切成寬0. 5cm的長(zhǎng)條，即制成檢測(cè)試劑條。
標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備步驟同實(shí)施例1。
實(shí)施例所用的原料，除另有說(shuō)明外，均為市售工業(yè)品。
本發(fā)明的上述實(shí)施例是對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明而不能用于限制本發(fā)明，與本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)相當(dāng)?shù)暮x和范圍內(nèi)的任何改變，都應(yīng)認(rèn)為是包括在權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種乙醇濃度檢測(cè)試劑盒，其特征在于由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡組成，其中試劑條為寬0. 5-lcm的濾紙條，濾紙條上含有固相化的乙醇脫氫酶、黃遞酶、氧化型INT及輔酶，標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括不同乙醇濃度的顯色比對(duì)區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醇濃度檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述輔酶為NAD、NADP, thio-NAD 中的一種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乙醇濃度檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括乙醇濃度分別為 0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml 的五個(gè)顯色比對(duì)區(qū)。
4.權(quán)利要求1所述的乙醇濃度檢測(cè)試劑盒的制備方法，其特征在于包括試劑條的制備和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備，其中試劑條的制備包括以下步驟(1)配制乙醇脫氫酶和黃遞酶的酶混合液將乙醇脫氫酶與黃遞酶溶于PH7. 0-9. O的 0. 05-2M三羥甲基氨基緩沖液中，使每毫升緩沖液中每個(gè)酶的總活性為100-1000U，(2)配制氧化型INT溶液將I-IOgINT溶于50-500ml乙二醇中，(3)配制輔酶溶液將I-IOg輔酶溶于50-500ml水中，(4)酶和底物的固相化將濾紙浸入步驟(1)配制的酶混合液中，取出濾紙干燥；接著將步驟( 配制的氧化型INT溶液滴在已干燥的濾紙上，干燥；然后將步驟C3)配制的輔酶溶液滴在已干燥的濾紙上，干燥，(5)制備試劑條將步驟⑷中干燥后的濾紙貼在單面含膠的白色聚酯板的前端，用切紙機(jī)切成寬0. 5-lcm的長(zhǎng)條，即成檢測(cè)試劑條；標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡的制備步驟為將濃度為0mg/ml、0. 2mg/ml、0. 8mg/ml、l. 5mg/ml、3. Omg/ml的乙醇分別滴加到制備成的試紙條上，30°C熱風(fēng)、避光下干燥lOmin，用掃描儀輸入電腦中，用photoshop軟件吸管測(cè)量顏色信息，根據(jù)每個(gè)濃度梯度顏色值用Photoshope. O軟件制成5個(gè)梯度的標(biāo)準(zhǔn)比色卡， 即成標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種乙醇濃度檢測(cè)試劑盒及其制備方法，該試劑盒由試劑條和標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡組成，其中試劑條為寬0.5-1cm的濾紙條，濾紙條上含有固相化的乙醇脫氫酶、黃遞酶、氧化型INT及輔酶，標(biāo)準(zhǔn)比對(duì)卡包括不同乙醇濃度的顯色比對(duì)區(qū)。用該試劑盒進(jìn)行檢測(cè)醉酒者的乙醇濃度時(shí)簡(jiǎn)便衛(wèi)生、速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性高，且該試劑盒易攜帶、尤其適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/98GK102520198SQ20111038212
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月21日
發(fā)明者沃燕波, 鄒炳德 申請(qǐng)人:寧波美康生物科技股份有限公司