專利名稱：一種過氧化氫生物傳感器及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物材料領(lǐng)域，具體涉及一種過氧化氫生物傳感器及其制備方法。
背景技術(shù)：
H2O2作為一種重要的化工產(chǎn)品，兼具殺菌、漂白、氧化和消毒等多種功效。它的應(yīng)用十分廣泛，所以對(duì)H2O2含量的測(cè)定在生物制藥、食品科學(xué)、工業(yè)分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)和臨床化學(xué)等領(lǐng)域具有非常重要的意義?，F(xiàn)在檢測(cè)H2O2時(shí)采用的主要手段有熒光法、化學(xué)發(fā)光法、 電化學(xué)法、光譜法和滴定法等。近年來，電化學(xué)方法，尤其是基于酶的直接電化學(xué)的無媒介體生物傳感器得到了迅速的發(fā)展，這是因?yàn)橛秒娀瘜W(xué)方法研制的H2A生物傳感器其制備簡(jiǎn)單，成本低，并且具有很高的選擇性和靈敏度。另外，酶在生物體內(nèi)以及藥物和食物中有極為重要的作用，而H2O2作為生物體內(nèi)許多過氧化酶參與酶促反應(yīng)的副產(chǎn)物，對(duì)其濃度進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定則具有十分重要的研究意義。生物傳感器具有對(duì)酶的分子識(shí)別和催化選擇功能，使用它來檢測(cè)H2A濃度不但能體現(xiàn)出操作便捷，響應(yīng)迅速快的特點(diǎn)，而且只需少量的試樣就可以檢測(cè)出H2A的濃度。因此，如何在對(duì)H2A進(jìn)行精確檢測(cè)時(shí)充分發(fā)揮生物傳感器的信號(hào)檢測(cè)高靈敏性和反應(yīng)高度專一性等優(yōu)勢(shì)，將會(huì)是研究者們?yōu)橹粩鄪^斗的目標(biāo)。生物納米材料具有生物兼容性好、比表面積大和穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，并且其表面所帶有的功能基團(tuán)能對(duì)酶的電化學(xué)行為產(chǎn)生特有的催化效應(yīng)。環(huán)境友好型試劑肌醇六磷酸鈣 (Ca-IP6)，其分子的結(jié)構(gòu)上含有6個(gè)非共平面的磷酸酯鍵，使其具有很強(qiáng)的螯合多價(jià)金屬離子的能力，Ca2+也具有很強(qiáng)的螯合能力，因此肌醇六磷酸鈣比其他肌醇六磷酸鹽都易與帶正電的蛋白質(zhì)或金屬和金屬氧化物納米粒子通過螯合和靜電作用結(jié)合。這些獨(dú)特的性質(zhì)類似于生物磷酸酯膜，與蛋白質(zhì)或酶結(jié)合，為酶在生物傳感器的固定上提供良好的微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)酶與電極之間的直接電子轉(zhuǎn)移，用于高靈敏度檢測(cè)H2A。迄今為止，國(guó)內(nèi)外尚未有利用“綠色經(jīng)濟(jì)”肌醇六磷酸鈣膜制備的檢測(cè)過氧化氫的生物傳感器。所以發(fā)明一種檢測(cè)限低，響應(yīng)時(shí)間短，米氏常數(shù)較小，靈敏度高，穩(wěn)定性好的檢測(cè)H2A的生物傳感器是一個(gè)迫切需要解決的重要技術(shù)問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測(cè)限低，響應(yīng)時(shí)間短，米氏常數(shù)較小，靈敏度高，穩(wěn)定性好的檢測(cè)H2A生物傳感器及其制備方法。本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種過氧化氫生物傳感器的制備方法，包括如下步驟(1)將肌醇六磷酸鈣溶液在90°C下加熱回流30分鐘；(2)將步驟(1)所得肌醇六磷酸鈣溶液滴在經(jīng)預(yù)處理的玻碳電極(GCE)表面并于 4 8°C冰箱內(nèi)晾干，得肌醇六磷酸鈣膜修飾的玻碳電極；(3)將辣根過氧化物酶(HRP)溶液滴涂固定到步驟( 所得肌醇六磷酸鈣膜修飾的玻碳電極上，置4 8°C冰箱內(nèi)晾干，得辣根過氧化物酶-肌醇六磷酸鈣膜修飾的玻碳電極；(4)將全氟磺酸(Nafion)溶液滴加到步驟( 所得的辣根過氧化物酶-肌醇六磷酸鈣膜修飾的玻碳電極上，于4 8°C冰箱內(nèi)晾干；步驟(1)中所述肌醇六磷酸鈣溶液的濃度為0. 001 0. 002mol/L。步驟( 所述預(yù)處理的過程如下用氧化鋁粉拋光處理玻碳電極，再依次用去離子水，無水乙醇，去離子水清洗，最后超聲清洗3 5分鐘，使得玻碳電極表面無劃痕。步驟(3)中HRP溶液為HRP的PBS溶液，濃度為3 8mg/mL，溶液pH為7. 4 7. 5。步驟⑷中溶液全氟磺酸溶液濃度為Iwt% 1. 5wt%。根據(jù)以上技術(shù)方案制得的過氧化氫生物傳感器，其特征在于，包括玻碳電極，玻碳電極表面修飾有肌醇六磷酸鈣膜，肌醇六磷酸鈣膜上修飾辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶膜表面再修飾一層全氟磺酸膜。本發(fā)明采用自組裝方法，利用肌醇六磷酸鈣作為連接劑，通過磷酸酯鍵及Ca2+的靜電和螯合作用將HRP吸附到電極表面，獲得了 Nafi0n/HRP/Ca-IP6/GCE傳感器，所采用的肌醇六磷酸鈣是一種用途廣泛的藥物原料，其具有生物相容性好、易降解、無毒副作用等優(yōu)良的生物性能。由于上述技術(shù)方案的采用，本發(fā)明制備的電極中的辣根過氧化物酶保持了很好的生物活性，實(shí)現(xiàn)了與電極表面的直接電子轉(zhuǎn)移，對(duì)過氧化氫有很好的響應(yīng)，并具有檢測(cè)限低、響應(yīng)時(shí)間短、電催化活性高和穩(wěn)定性良好等優(yōu)點(diǎn)，是一種優(yōu)良的檢測(cè)過氧化氫的新型生物傳感器。同時(shí)，本發(fā)明的制備方法還具有操作簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保、成本較低的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為本發(fā)明中不同修飾層數(shù)的電極的電化學(xué)交流阻抗圖。圖2為本發(fā)明中Ca_IP6、HRP這兩種溶液及混合溶液的紫外-可見吸收光譜圖。圖3為不同修飾電極的循環(huán)伏安圖。圖4為本發(fā)明傳感器對(duì)不同濃度H2A的循環(huán)伏安圖。圖5為本發(fā)明傳感器在PBS中連續(xù)加入H2A的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線。圖6為本發(fā)明響應(yīng)電流與H2A濃度的校正曲線的計(jì)時(shí)電流圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。實(shí)施例本實(shí)施例電化學(xué)實(shí)驗(yàn)在CHI 660D型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)上進(jìn)行；紫外-可見(UV-vis)光譜實(shí)驗(yàn)采用UV-8500型紫外-可見分光光度計(jì)(上海天美科學(xué)儀器有限公司)；其他儀器為FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)； SK2200H超聲儀(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)。本發(fā)明過氧化氫生物傳感器的制備方法如下(1)將0. 001mol/L的肌醇六磷酸鈣溶液在90°C下加熱回流30分鐘；
(2)移取4 μ L上述肌醇六磷酸鈣溶液滴加到預(yù)處理過的玻碳電極表面(7mm2)，于 4°C冰箱內(nèi)晾干，得到修飾肌醇六磷酸鈣(Ca-IP6)膜的玻碳電極(Ca-IP6/GCE)；( 取4 μ L 5mg/mL的辣根過氧化物酶溶液滴涂在上述玻碳電極上，置4°C冰箱內(nèi)晾干，得辣根過氧化物酶-肌醇六磷酸鈣膜修飾的玻碳電極(HRP/Ca-IP6/GCE)；(4)將質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的全氟磺酸溶液用pH 7. 0磷酸緩沖液稀釋至質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%>ρΗ = 7. 0，滴加3μ L所得全氟磺酸溶液，置4°C冰箱內(nèi)晾干，即得本發(fā)明的過氧化氫生物傳感器(Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE)。電化學(xué)交流阻抗技術(shù)(EIQ可以根據(jù)電極在修飾過程中阻抗的變化表征電極組裝的不同階段，是一種研究表面修飾電極界面性質(zhì)的有效手段。圖1是不同修飾層數(shù)的電極的電化學(xué)交流阻抗圖，利用電化學(xué)交流阻抗法(EIS) 表征了 Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE 制備過程曲線(a)是裸玻碳電極的交流阻抗曲線，近似為一條直線，表明裸玻碳電極表面的電子遷移幾乎不受什么阻礙，其表面?zhèn)鬟f的電子受擴(kuò)散控制；曲線(b)是在裸電極上修飾了 Ca-IP6后的交流阻抗譜，由圖可觀察到一個(gè)微小的半圓，表明Ca-IP6膜的形成使 [Fe(CN)6]4_Λ_在電極表面的電子轉(zhuǎn)移阻力加大；曲線(c)是自組裝HRP之后的交流阻抗譜， 由圖看出HRP/Ca-IP6/GCE(c)半徑明顯增大，這說明HRP通過與Ca-IP6的磷酸酯鍵和Ca2+ 的螯合作用，吸附于電極表面，在電極表面形成了介電子層，阻礙了 Fe (CN)廣/Fe (CN) 64-在電極表面的電子傳遞過程；由曲線(d)可以看出，Nafi0n/HRP/Ca-IP6/GCE阻抗弧的半徑表明電子在電極表面的遷移更加困難，因此證明HRP成功地固定到了玻碳電極上。紫外可見光譜能夠有效的監(jiān)測(cè)亞鐵血紅素基團(tuán)吸收帶的變化，以表征其結(jié)構(gòu)的變化。圖2是本發(fā)明中Ca_IP6、HRP這兩種溶液及混合溶液的紫外-可見吸收光譜圖在波長(zhǎng)396nm處出現(xiàn)HRP (b)的吸收峰，而Ca-IP6 (a)在所給的波長(zhǎng)范圍內(nèi)沒有任何吸收峰；當(dāng)HR和Ca-IP6混合后，混合溶液HRP-Ca-IP6 (c)中HRP的Soret吸收帶位置與純HRP溶液中的Soret吸收帶位置基本一致，說明在Ca-IP6溶液中的HRP能夠保持自身天然的生物活性和天然結(jié)構(gòu)。圖3為不同修飾電極的循環(huán)伏安圖，顯示(a)裸玻碳電極，(b)Nafi0n/Ca-IP6/ GCE, (c)Nafion/HRP/GCE 和(d) Naf ion/HRP/Ca_IP6/GCE 在 PBS 中的循環(huán)伏安(CV)響應(yīng)信號(hào)。結(jié)果表明，在裸玻碳電極(a)和Nafi0n/Ca-IP6/GCE(b)中未觀察到任何峰，在曲線(d)Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE上可以觀察到一對(duì)明顯的氧化還原峰，而在(c) Naf ion/HRP/ GCE上有一對(duì)小峰，這說明Ca-IP6的存在促進(jìn)HRP在電極表面的直接電化學(xué)行為，為HRP提供一個(gè)具有生物相容性的界面，有效地加快HRP的直接電子轉(zhuǎn)移速率。另外，Nafion膜起到了保護(hù)HRP生物活性，防止酶流失的作用。圖4為本發(fā)明傳感器對(duì)不同濃度H2A的循環(huán)伏安圖，考察了 Nafion/HRP/Ca-IPy GCE對(duì)H2A的電催化性能。從圖上可以觀察到，在PBS (pH = 7.0)溶液中，當(dāng)H2O2加入到PBS后，Naf ion/HRP/ Ca-IP6/GCE中HRP的!^3+的還原峰電流隨著H2A濃度的增加而逐漸增大，對(duì)應(yīng)的HRP的!^2+ 的氧化峰電流逐漸減小乃至消失，表明Nafi0n/HRP/Ca-IP6/GCE對(duì)H2A具有良好的電催化還原性能，也進(jìn)一步證明了 Ca-IP6保持了 HRP的電催化活性。圖5是本發(fā)明傳感器Naf ion/HRP/Ca_IP6/GCE在-0. 25V的工作電位下，向PBS (pH 7.0)中連續(xù)加入H2O2的計(jì)時(shí)電流響應(yīng)曲線，隨著H2O2濃度的不斷增大，還原電流逐漸增大。圖6為本發(fā)明響應(yīng)電流與H2A濃度的校正曲線的計(jì)時(shí)電流圖，反映了該傳感器在不同H2O2濃度下對(duì)催化電流的線性校正關(guān)系，看出響應(yīng)電流和過氧化氫的濃度成線性關(guān)系，在2. 67 ΧΙΟ—7 1.067 X 10_6mOl L—1濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0. 998 (n = 10)，最低檢測(cè)限為 1. 3Xl(T7mol L-l(信噪比 S/N = 3)。表觀米氏常數(shù)(apparent Michaelis-Menten constant,^")是一種與酶的濃度無關(guān)的酶促反應(yīng)特征常數(shù)，它可以表征酶與底物之間親合力的大小?？梢酝ㄟ^Lineweaver-Burk方程求得1/Iss =^f/ImaxC + 1/Imax式中，Iss是加入底物后測(cè)得的穩(wěn)態(tài)電流，C是底物濃度，Imax是底物達(dá)飽和后測(cè)得的最大電流。米氏常數(shù)可根據(jù)穩(wěn)態(tài)電流的倒數(shù)和H2A濃度的倒數(shù)作圖后，所得到的斜率和截距求得。按此公式測(cè)得Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE的米氏常數(shù)為0. 259mmol L—1，此處表觀米氏常數(shù)較低的米氏常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于文獻(xiàn)中所報(bào)道的值，表明用該方法制作的傳感器對(duì)辣根過化物酶有較高的活性，且具有更大的親和力。將本發(fā)明傳感器Nafion/HRP/Ca_IP6/GCE 對(duì)同一濃度 H2R 溶液(0. Immol L—1)進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)5組數(shù)據(jù)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(R.S.D.)為3.0%。用相同方法所制備的6支不同Naf i0n/HRP/Ca-IP6/GCE電極，對(duì)H2O2溶液(0. Immol L—1)的電流檢測(cè)的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 6. 8%，這表明Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE有較好的重現(xiàn)性。將修飾好的電極在pH為7. 0的PBS溶液中在掃速為lOOmV—1下進(jìn)行循環(huán)掃描50 圈，峰電位不變，峰電流僅下降3. 6%。實(shí)驗(yàn)后將修飾電極于4°C下置于pH為7. 0的PBS溶液中放置一周，其響應(yīng)信號(hào)基本不變；20天后，其響應(yīng)信號(hào)為初始信號(hào)的94%，一個(gè)月后， 其響應(yīng)信號(hào)仍為初始信號(hào)的91%，這表明Nafi0n/HRP/Ca-IP6/GCE具有較好的穩(wěn)定性。上述實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。在閱讀了本發(fā)明記載的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等效變化和修飾同樣落入本發(fā)明權(quán)利要求所限定的范圍。
權(quán)利要求
1.一種過氧化氫生物傳感器的制備方法，其特征在于，包括如下步驟(1)將肌醇六磷酸鈣溶液在90°c下加熱回流30分鐘；(2)將步驟(1)所得肌醇六磷酸鈣溶液滴涂在經(jīng)預(yù)處理的玻碳電極表面于4 8°C冰箱內(nèi)晾干，得肌醇六磷酸鈣膜修飾的玻碳電極；(3)將辣根過氧化物酶溶液滴涂固定到步驟( 所得肌醇六磷酸鈣膜修飾的玻碳電極上，置4 8°C冰箱內(nèi)晾干，得辣根過氧化物酶-肌醇六磷酸鈣膜修飾的玻碳電極；(4)將全氟磺酸溶液滴加到步驟( 所得的辣根過氧化物酶-肌醇六磷酸鈣膜修飾的玻碳電極上，置4 8°C冰箱內(nèi)晾干后，制備得辣根過氧化物酶-植酸鈣膜修飾的玻碳電極。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(1)中所述肌醇六磷酸鈣溶液的濃度為0. 001 0. OOaiiol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟( 所述預(yù)處理的過程如下用氧化鋁粉拋光處理玻碳電極，再依次用去離子水，無水乙醇，去離子水清洗，最后超聲清洗3 5分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(3)中 HRP溶液為HRP的PBS溶液，濃度為3 8mg/mL，溶液pH為7. 4 7. 5。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的過氧化氫生物傳感器的制備方法，其特征在于，步驟(4)中溶液全氟磺酸溶液的濃度為Iwt% 1. 5wt%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1 5所述制備方法制得的過氧化氫生物傳感器，其特征在于，包括玻碳電極，玻碳電極表面修飾有肌醇六磷酸鈣膜，肌醇六磷酸鈣膜上修飾辣根過氧化物酶，辣根過氧化物酶膜表面再修飾一層全氟磺酸膜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種過氧化氫生物傳感器及其制備方法，采用自組裝方法，利用肌醇六磷酸鈣作為連接劑，通過磷酸酯鍵及Ca2+的靜電和螯合作用將HRP吸附到電極表面，獲得了Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE傳感器，所制備的傳感器與酶底物的親和力高，能夠?qū)崿F(xiàn)辣根過氧化物酶的直接電子轉(zhuǎn)移，對(duì)過氧化氫的響應(yīng)時(shí)間短，檢測(cè)限低，靈敏度高等性能，同時(shí)，本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，環(huán)保經(jīng)濟(jì)。
文檔編號(hào)G01N27/327GK102495116SQ20111038843
公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年11月29日
發(fā)明者接德麗, 楊海峰 申請(qǐng)人:上海師范大學(xué)