專(zhuān)利名稱(chēng)：一種用于快速檢測(cè)大腸桿菌的納米生物膜及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及納米生物膜領(lǐng)域，具體涉及一種用于快速檢測(cè)大腸桿菌的納米生物膜及其制備方法。
背景技術(shù)：
常規(guī)的微生物分析需要針對(duì)性選擇培養(yǎng)基以富集樣品中的病原體數(shù)量，這樣從送樣到實(shí)驗(yàn)室出結(jié)果需要4-8天，耗時(shí)較長(zhǎng)，而微生物的繁殖往往在1-2天內(nèi)就可能形成爆發(fā)的態(tài)勢(shì)，因此急需可以顯著降低分析時(shí)間、減少使用成本及有效阻止或減少食源性疾病爆發(fā)的快速診斷檢測(cè)技術(shù)。目前，食源性疾病的快速診斷檢測(cè)技術(shù)主要是基于免疫學(xué)測(cè)定的橫向流格式(the lateral flow format)診斷，雖然快速，但需要的病源樣品量(0. Iml)檢測(cè)限較高，約為41og cfu/ml，同樣需要對(duì)病原體的數(shù)量進(jìn)行富集，因而耗時(shí)。電紡是將融化態(tài)的高聚物通過(guò)針頭在高電壓的靜電力作用下形成納米纖維收集在極性碟上，形成高表面積的纖維。電紡纖維目前多用于皮膚移植，骨骼支架，藥物傳送，及過(guò)濾材料和包裝材料等。目前，關(guān)于電紡纖維作為生物傳感器應(yīng)用的研究報(bào)道很少，盡管它的大比表面積、材料的牢固性非常適于做為傳感器的載體，固定較多的生物親和分子(如抗體)。典型的電紡纖維常用惰性材料如尼龍制備，它可以提供機(jī)械強(qiáng)度但不能傳遞生物分子相互反應(yīng)的信號(hào)，因此，需將惰性的電紡纖維用攜帶電荷的導(dǎo)電聚合物改性，形成可以固定抗體的導(dǎo)電聚合膜，微量的抗原與抗體反應(yīng)則導(dǎo)致支撐膜的電化學(xué)特性發(fā)生變化，其變化可用電化學(xué)方法測(cè)定，制備成病源樣品量少且快速的免疫傳感器。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測(cè)大腸桿菌的納米生物膜及其制備方法。用本發(fā)明的納米生物膜可以在30分鐘內(nèi)檢出大腸桿菌的存在，檢測(cè)限在 10-106CFU/mL，具有較高的靈敏度。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種納米生物膜，該納米生物膜采用以下步驟制得(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16% 的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0.35mol/ L-0. 45mol/L苯胺鹽酸溶液38°C _43°C反應(yīng)85min-95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過(guò)硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合40min-90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無(wú)色，干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2% -4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)5mg-50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。一種納米生物膜的制備方法，包括如下步驟(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16% 的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0.35mol/ L-0. 45mol/L苯胺鹽酸溶液38°C _43°C反應(yīng)85min-95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過(guò)硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合40min-90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無(wú)色，干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2% -4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)5mg-50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。所述納米纖維膜的制備優(yōu)選為尼龍6甲酸溶液的質(zhì)量濃度為16%-24%，裝入注射器，控制溶液在18kv的高壓下以0. lmL/h的流速?lài)姵觯芤涸诟邏红o電作用下甲酸揮發(fā)， 尼龍6形成納米纖維附著在鋁碟成膜。所用設(shè)備是購(gòu)買(mǎi)的現(xiàn)有設(shè)備，如永清華源生物材料科技有限公司的型號(hào)為SS-I型的靜電紡絲設(shè)備。所述納米纖維膜中的納米纖維的平均直徑為94. llnm-209. 49nm。另外，本發(fā)明還提供了所述納米生物膜在快速檢測(cè)大腸桿菌方面的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)是本發(fā)明的納米生物膜可以用于快速檢測(cè)大腸桿菌的存在，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)耗時(shí)短， 可在30分鐘內(nèi)檢出大腸桿菌的存在，檢測(cè)限在10-106CFU/mL，具有較高的靈敏度。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋和說(shuō)明。實(shí)施例1 納米生物膜的制備(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為20%的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；取膜用電鏡測(cè)量100條纖維，平均直徑為94. llnm-209. 49nm。(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0. 40mol/L苯胺鹽酸溶液40°C反應(yīng)90min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過(guò)硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合60min，棄去聚合液，漂洗至洗液無(wú)色，室溫干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以3% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)30mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。納米生物膜的應(yīng)用將上述制備的納米生物膜安裝在帶有電極的支撐結(jié)構(gòu)(試劑盒)上，將電極與萬(wàn)用電表連接，組成簡(jiǎn)單的傳感器。將培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)1天的大腸桿菌hcherichia coli K-12稀釋至濃度為10CFU/mL，先用萬(wàn)用電表測(cè)定試劑盒中納米生物膜的電阻，滴加IOyL 稀釋液至試劑盒，使其均勻分布在膜上，室溫靜置20min，再測(cè)定納米生物膜的電阻，此時(shí)電阻約降低至原生物膜電阻的20%。實(shí)施例2 納米生物膜的制備(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16%的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；取膜用電鏡測(cè)量100條纖維，平均直徑為94. llnm-209. 49nm。(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0. 35mol/L苯胺鹽酸溶液38°C反應(yīng)85min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過(guò)硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合45min，棄去聚合液，漂洗至洗液無(wú)色，室溫干燥得到聚苯胺_尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)15mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。納米生物膜的應(yīng)用將上述制備的納米生物膜安裝在帶有電極的支撐結(jié)構(gòu)(試劑盒)上，將電極與萬(wàn)用電表連接，組成簡(jiǎn)單的傳感器。將培養(yǎng)液中37°C培養(yǎng)1天的大腸桿菌hcherichia coli K-12稀釋至濃度為104CFU/mL，先用萬(wàn)用電表測(cè)定試劑盒中納米生物膜的電阻，滴加20 μ L 稀釋液至試劑盒，使其均勻分布在膜上，室溫靜置lOmin，再測(cè)定納米生物膜的電阻，此時(shí)電阻約降低至原生物膜電阻的90%。實(shí)施例3 納米生物膜的制備(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；取膜用電鏡測(cè)量100條纖維，平均直徑為94. llnm-209. 49nm。(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0. 45mol/L苯胺鹽酸溶液43°C反應(yīng)95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過(guò)硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無(wú)色，室溫干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。納米生物膜的應(yīng)用將上述制備的納米生物膜安裝在帶有電極的支撐結(jié)構(gòu)(試劑盒)上，將電極與萬(wàn)用電表連接，組成簡(jiǎn)單的傳感器。將生菜葉用蒸餾水?dāng)嚢枨逑?，洗液用磁性粒子富集大腸桿菌，先用萬(wàn)用電表測(cè)定試劑盒中納米生物膜的電阻，滴加20 μ L稀釋液至試劑盒，使其均勻分布在膜上，室溫靜置lOmin，再測(cè)定納米生物膜的電阻，如果洗液含有大腸桿菌， 電阻降低至原生物膜電阻的10-90% ；如果不含，則電阻基本保持不變；如果含假單胞菌 Pseudomonas，則電阻升高。
權(quán)利要求
1.一種納米生物膜，其特征是，該納米生物膜采用以下步驟制得(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16%的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0.35mol/L-0. 45mol/L 苯胺鹽酸溶液38°C _43°C反應(yīng)85min-95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過(guò)硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合40min-90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無(wú)色，干燥得到聚苯胺_尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2%-4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)5mg-50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述納米生物膜，其特征是，所述納米纖維膜的制備為將質(zhì)量濃度為16% 的尼龍6甲酸溶液裝入注射器，控制溶液在18kv的高壓下以0. lmL/h的流速?lài)姵?，溶液在高壓靜電作用下甲酸揮發(fā)，尼龍6形成納米纖維附著在鋁碟成膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述納米生物膜，其特征是，所述納米纖維膜中的納米纖維的平均直徑為 94. llnm-209. 49nm。
4.一種納米生物膜的制備方法，其特征是，包括如下步驟(1)納米纖維膜的制備將質(zhì)量濃度為16%的尼龍6甲酸溶液靜電紡絲成納米纖維膜；(2)聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成將上述納米纖維膜放入0.35mol/L-0. 45mol/L 苯胺鹽酸溶液38°C _43°C反應(yīng)85min-95min，棄去反應(yīng)液，再加入與苯胺等摩爾比的過(guò)硫酸銨鹽酸溶液，0°C聚合40min-90min，棄去聚合液，漂洗至洗液無(wú)色，干燥得到聚苯胺-尼龍納米纖維膜；(3)抗體的標(biāo)記；在上述聚苯胺-尼龍納米纖維膜上以2%-4% (w/v)的戊二醛為交聯(lián)劑偶聯(lián)5mg-50mg/100ml牛血清白蛋白，在此基礎(chǔ)上標(biāo)記大腸桿菌羊多克隆抗體。
5.權(quán)利要求1-3之一所述納米生物膜在快速檢測(cè)大腸桿菌方面的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于快速檢測(cè)大腸桿菌的納米生物膜及其制備方法，該納米生物膜的制備包括納米纖維膜的制備、聚苯胺-尼龍納米纖維膜的合成和抗體的標(biāo)記。用本發(fā)明納米生物膜可以在30分鐘內(nèi)檢出大腸桿菌的存在，檢測(cè)限在10-106CFU/mL，具有較高的靈敏度。
文檔編號(hào)G01N33/569GK102520170SQ20111039680
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月5日
發(fā)明者易翠平 申請(qǐng)人:長(zhǎng)沙理工大學(xué)