專利名稱：小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原多組分直接競爭免疫分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及不同小分子有機(jī)物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的納米熒光探針標(biāo)記多組分直接競爭免疫分析新技術(shù)。
背景技術(shù)：
環(huán)境和農(nóng)畜產(chǎn)品中農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物多殘留超標(biāo)，對環(huán)境和環(huán)境生物構(gòu)成一定威脅，影響食品安全和人類健康。加強(qiáng)環(huán)境和食品中多種殘留物的監(jiān)控，需要高效快速的多組分分析技術(shù)。
目前已報(bào)道的農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物多殘留檢測方法主要有色譜法和色質(zhì)聯(lián)用法，采用這些方法需要昂貴的儀器設(shè)備、專業(yè)化的實(shí)驗(yàn)室和訓(xùn)練有素的專門人才，樣品前處理要求高、過程復(fù)雜、速度慢，檢測成本高，特異性不強(qiáng)，難以適應(yīng)大量樣品和現(xiàn)場快速檢測的要求?，F(xiàn)有小分子有機(jī)物多組分免疫分析，通常采用在聚苯乙烯微孔板的不同部位固定不同抗體或抗原，通過空間分辨進(jìn)行不同免疫反應(yīng)，反應(yīng)在固相和液相界面進(jìn)行，反應(yīng)后通過洗滌方式實(shí)現(xiàn)固液分離，操作復(fù)雜；或采用不同標(biāo)記物，如酶、熒光素等標(biāo)記不同抗體或抗原，反應(yīng)條件和檢測手段難以兼容。因此，真正意義上的小分子有機(jī)物多組分免疫分析技術(shù)尚待建立。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以不同熒光發(fā)射波長的高效水溶性量子點(diǎn)作為納米熒光探針標(biāo)記不同目標(biāo)分析物半抗原，建立一種特異性強(qiáng)、靈敏度高、簡便高效、可同時(shí)快速檢測多種小分子目標(biāo)分析物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的直接競爭免疫分析技術(shù)。
本發(fā)明的技術(shù)方案是采用混合酸酐法或碳二亞胺法，將激發(fā)波長寬、熒光光譜窄、穩(wěn)定性好、熒光發(fā)射波長不同的高效水溶性量子點(diǎn)分別與含活性羧基末端的不同目標(biāo)分析小分子有機(jī)物半抗原共價(jià)偶聯(lián)制備具有特征熒光發(fā)射波長的不同量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原。
將抗不同目標(biāo)分析物的抗體分別固定于水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，封閉微球表面未結(jié)合抗體的位點(diǎn)。
取適量固定有抗不同目標(biāo)分析物抗體的聚苯乙烯磁性微球、對應(yīng)目標(biāo)分析物標(biāo)樣及對應(yīng)的不同量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原，共同分散于磷酸鹽緩沖液中，在室溫下同時(shí)進(jìn)行競爭性免疫反應(yīng)，在同樣條件下以待測樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對照反應(yīng)體系。反應(yīng)平衡后的體系在磁性微球分離器上使聚苯乙烯磁性微球與液相快速分離，在同一波長紫外光激發(fā)下對液相進(jìn)行熒光掃描或多波長檢測，測定標(biāo)樣和樣品體系中各量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的特征熒光強(qiáng)度(Fs)與目標(biāo)分析物空白對照的特征熒光強(qiáng)度(Ftl)之比(Fs/ F0)。
依據(jù)FsZ^Fci與體系中對應(yīng)目標(biāo)分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比(聚苯乙烯磁性微球上結(jié)合的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的量與對應(yīng)目標(biāo)分析物濃度在一定范圍內(nèi)成反比)的規(guī)律，在條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上建立各目標(biāo)分析小分子有機(jī)物(農(nóng)藥、藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物)的量子點(diǎn)標(biāo)記直接競爭免疫分析方法；根據(jù)待測樣品中各目標(biāo)分析物的Fs/^計(jì)算樣品中對應(yīng)目標(biāo)分析物的含量，從而建立高靈敏度快速檢測多種目標(biāo)分析小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記多組分直接競爭免疫分析技術(shù)。
本發(fā)明綜合利用免疫分析特異性強(qiáng)、量子點(diǎn)熒光量子效率高而穩(wěn)定、不同量子點(diǎn)可在同一激發(fā)波長下發(fā)射互不干擾的熒光、聚苯乙烯磁性微球可在水相中分散且可在磁場中與液相快速分離等優(yōu)勢。與常規(guī)免疫分析相比，本發(fā)明所建立的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原多組分直接競爭免疫分析在同一水分散相中進(jìn)行，平衡時(shí)間短；固相和液相可在磁場中快速分離，在同一激發(fā)波長下同時(shí)檢測液相中不同量子點(diǎn)標(biāo)記物的特征熒光強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)對多種目標(biāo)分析小分子有機(jī)物的同時(shí)定性定量檢測，省去了洗滌和顯色反應(yīng)步驟，操作簡便快速，顯著提高了檢測效率和檢測靈敏度，重現(xiàn)性好，是對現(xiàn)有小分子有機(jī)物多組分免疫分析技術(shù)的突破與創(chuàng)新，國內(nèi)外尚未見報(bào)道。


圖1為量子點(diǎn)標(biāo)記3種農(nóng)藥半抗原直接競爭多組分免疫分析熒光光譜圖。
圖2為量子點(diǎn)標(biāo)記3種藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物半抗原直接競爭多組分免疫分析熒光光譜圖。
具體實(shí)施方式
一、量子點(diǎn)標(biāo)記農(nóng)藥半抗原多組分直接競爭免疫分析技術(shù)實(shí)施例采用經(jīng)典的混合酸酐法或碳二亞胺法將氰戊菊酯半抗原0,0^^^^4 40-丁酸JX 夂·和克百威半抗原tiOoLp^(n=l-5)分別與表面修飾有活性氨基、熒光發(fā)射波長為655nm、585nm、525nm的核殼結(jié)構(gòu) (CdSe/ZnS)高效水溶性量子點(diǎn)共價(jià)偶聯(lián)，制備特征熒光發(fā)射波長約為655nm的量子點(diǎn)標(biāo)記氰戊菊酯半抗原、特征熒光發(fā)射波長約為585nm的量子點(diǎn)標(biāo)記2，4D_ 丁酸和特征熒光發(fā)射波長約為525nm的量子點(diǎn)標(biāo)記克百威半抗原。用截留分子量為5000道爾頓的超濾離心管離心去除游離的小分子化合物，量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原分別用PH8. 3、含0. 5g/L疊氮化鈉和 lmol/L甜菜堿的0. 05mol/L硼酸鹽緩沖液定容，使量子點(diǎn)濃度為lMfflol/L，4°C儲(chǔ)存，臨用前分別將量子點(diǎn)標(biāo)記氰戊菊酯半抗原、量子點(diǎn)標(biāo)記2，4D- 丁酸和量子點(diǎn)標(biāo)記克百威半抗原用 0. 02mol/L、ρΗ7· 2 PB稀釋200倍、100倍和50倍后等體積混合。
用0. 02mol/L、ρΗ7. 2的PB分別配置濃度為lOPg/mL的抗氰戊菊酯抗體、抗 2，4D- 丁酸抗體和抗克百威抗體溶液，然后在各抗體溶液中加入等體積的10mg/mL的聚苯乙烯磁性微球水分散液，4°C吸附8 12小時(shí)，用磁性微球分離器將包被有抗體的聚苯乙烯磁性微球與液相快速分離，固相加原體積2倍的0. 02mol/L、pH7. 2 PB分散后，再用磁性微球分離器進(jìn)行固液分離，如此重復(fù)2次，最后在固相中加入含NaN3 0. 5g/L、濃度為5g/L的明膠溶液混勻，使聚苯乙烯磁性微球的含量為:3mg/mL，室溫下靜置2小時(shí)，封閉微球表面未吸附抗體的位點(diǎn)，4°C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩Ｊ褂们皩⒐潭ㄓ胁煌贵w的所述3種聚苯乙烯磁性微球儲(chǔ)備液搖勻，等體積混合。
先用甲醇配置含氰戊菊酯、克百威和2，4D_ 丁酸標(biāo)樣各lmg/mL的母液，再用 0. 02mol/L、pH7. 2 PB稀釋成分別含氰戊菊酯、克百威和2，4D- 丁酸標(biāo)樣10 lO—Vg/mL的混合標(biāo)樣系列，以0. 02mol/L、pH7. 2的PB作空白對照。
在IOOPL標(biāo)樣、待測樣品和空白對照溶液中分別加入固定有抗對應(yīng)3種目標(biāo)分析物抗體的聚苯乙烯磁性微球混合液50μ 和對應(yīng)3種量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原混合液50μ ，在室溫下混合反應(yīng)約20min。反應(yīng)平衡后用磁性微球分離器進(jìn)行固液分離，分別取液相150μ 加入熒光微孔板的不同孔內(nèi)，在226nm激發(fā)波長下掃描(見圖1所示)或分別檢測655nm、585nm 和525nm附近的最大特征熒光強(qiáng)度。
優(yōu)化反應(yīng)介質(zhì)、反應(yīng)物濃度比、反應(yīng)溫度和時(shí)間、激發(fā)波長與熒光發(fā)射波長等相關(guān)條件，選擇抗體與對應(yīng)目標(biāo)分析物免疫反應(yīng)速度快、敏感性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、固定有抗體的聚苯乙烯磁性微球和量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原用量少、含目標(biāo)分析物反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度(Fs)與空白對照熒光強(qiáng)度(Ftl)比值高、背景干擾少的條件組合；在此基礎(chǔ)上，依據(jù)FsZiFtl與對應(yīng)目標(biāo)分析物濃度在一定范圍內(nèi)成正比(聚苯乙烯磁性微球上結(jié)合的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的量與對應(yīng)目標(biāo)分析物濃度在一定范圍內(nèi)成反比)的規(guī)律以及各樣品的FsAV計(jì)算樣品中對應(yīng)目標(biāo)分析物的含量，對待測樣品中的對應(yīng)目標(biāo)分析物進(jìn)行定性定量快速檢測，從而建立對應(yīng)目標(biāo)分析小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原直接競爭多組分免疫分析技術(shù)。
二、量子點(diǎn)標(biāo)記藥物、環(huán)境內(nèi)分泌干擾物半抗原多組分直接競爭免疫分析技術(shù)實(shí)施例采用混合酸酐法或碳二亞胺法將己烯雌酚半抗原
權(quán)利要求
1.一種小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原多組分直接競爭免疫分析方法，其特征在于以不同熒光發(fā)射波長、表面具有活性氨基的核殼結(jié)構(gòu)高效水溶性量子點(diǎn)作為納米熒光探針，采用混合酸酐法或碳二亞胺法標(biāo)記不同目標(biāo)分析小分子有機(jī)物半抗原；將抗不同目標(biāo)分析物的抗體分別固定于水分散性聚苯乙烯磁性微球表面，封閉微球表面未結(jié)合抗體的位點(diǎn)；分別取固定有不同抗體的聚苯乙烯磁性微球、對應(yīng)目標(biāo)分析物標(biāo)樣和對應(yīng)量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原，共同分散于磷酸鹽緩沖液中，室溫下進(jìn)行競爭性免疫反應(yīng)至平衡，同樣條件下以待測樣品和目標(biāo)分析物空白代替標(biāo)樣，設(shè)置樣品和空白對照反應(yīng)體系；將反應(yīng)平衡的體系在磁場中使聚苯乙烯磁性微球與液相分離，在同一激發(fā)波長下對液相進(jìn)行熒光掃描或多波長檢測；依據(jù)標(biāo)樣體系中不同量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的特征熒光強(qiáng)度Fs與對應(yīng)空白對照的熒光強(qiáng)度Ftl之比值FsZiFtl與對應(yīng)目標(biāo)分析物的濃度在一定范圍內(nèi)呈正比的規(guī)律以及待測樣品中各目標(biāo)分析物的FsAV計(jì)算待測樣品中各目標(biāo)分析物的含量，建立高靈敏度快速檢測多種目標(biāo)分析小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原直接競爭多組分免疫分析方法。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原多組分直接競爭免疫分析方法，其特征在于所述不同熒光發(fā)射波長、表面具有活性氨基的核殼結(jié)構(gòu)的高效水溶性量子點(diǎn)在200 350nm范圍內(nèi)用同一波長紫外光激發(fā)，發(fā)射半峰寬小于30nm、互不干擾的特征熒光，不同量子點(diǎn)的最大發(fā)射波長的間隔>50nm，熒光量子效率高于60%。
全文摘要
小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原多組分直接競爭免疫分析方法，涉及多組分直接競爭免疫分析技術(shù)，以不同熒光發(fā)射波長的高效水溶性量子點(diǎn)標(biāo)記不同目標(biāo)分析物半抗原，取固定有不同抗體的聚苯乙烯磁性微球、對應(yīng)目標(biāo)分析物標(biāo)樣及對應(yīng)量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原共同分散于磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行競爭性免疫反應(yīng)；將反應(yīng)平衡的體系在磁場中使聚苯乙烯磁性微球和液相快速分離，在同一波長紫外光激發(fā)下對液相進(jìn)行熒光掃描或多波長檢測，依據(jù)標(biāo)樣體系中不同量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原的特征熒光強(qiáng)度與對應(yīng)空白對照的熒光強(qiáng)度之比值與對應(yīng)目標(biāo)分析物的濃度呈正比的規(guī)律，建立快速檢測多種目標(biāo)分析小分子有機(jī)物的量子點(diǎn)標(biāo)記半抗原直接競爭多組分免疫分析方法。
文檔編號G01N33/542GK102520152SQ20111039940
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者馮大和, 劉曙照, 徐科 申請人:揚(yáng)州大學(xué)