專利名稱：一種熒光分析方法和裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于體外檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種基于測量熒光強度的分析方法和
>J-U裝直。
背景技術(shù)：
在免疫檢測領(lǐng)域中，常常需要對各類抗原或抗體進(jìn)行定性或定量檢測，現(xiàn)有技術(shù)中，以“競爭抑制和雙抗夾心”為基礎(chǔ)衍生出多種免疫反應(yīng)分析方法，如:放射免疫法、酶聯(lián)免疫法、化學(xué)發(fā)光法、時間分辨熒光法和熒光免疫法等，可用于確定病原微生物，對人體的特異性蛋白定量檢測從而對疾病進(jìn)行輔助診斷或監(jiān)測等等，用途非常廣泛。這類免疫反應(yīng)分析方法的通常作法是:將捕獲抗體固定于固相載體，然后與抗原(目標(biāo)蛋白)反應(yīng)，洗滌后再與標(biāo)記抗體反應(yīng)，洗滌，最后檢測放射性強度、溶液吸光度或光信號，從而報告檢測樣本中目標(biāo)蛋白的濃度，上述方法的自動化免去了人工洗滌的煩瑣，但正因為自動化，使得儀器體積龐大價格昂貴，一般只在大型實驗室使用。1990年，Beggs等綜合膠體金和免疫分析技術(shù)，建立了膠體金免疫層析法(GICA)，用于檢測人尿和血清中的 HCG(BEGGS M, NOVOTNY M, SAMPEDRO S.A selfperformingchromatographic immunoassay for the qualitative determination of humanchorionicgonadotrophin(HCG) in urine and serum[J].Clin Chem, 1990, 36:1084-1085)。此后20年，人們在GICA的基礎(chǔ)上，開發(fā)出了用于病原體(CN 03115143.4)、激素(CN200610014168.3)、心臟標(biāo)志物(CN 200410011165.5)、腫瘤標(biāo)志物(CN 200510104796.6)、自身免疫病標(biāo)志物(CN 200410027291.X)、毒品(CN 201010578686.4)等的檢測試劑；同時也應(yīng)用到食品、環(huán)境(CN 03116692.X)和獸醫(yī)(CN 02139704.X)領(lǐng)域。由于該方法快速、簡便、成本低廉、無需儀器，非專業(yè)人士也可操作，只需肉眼觀察即可，使急診、基層醫(yī)院、病人床邊和現(xiàn)場等遠(yuǎn)離大型實驗室的地方開展相關(guān)檢測成為可能，所以應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛。雖然這種免疫分析技術(shù)經(jīng)超過20年的發(fā)展，但其基本的工作原理并未改變，這決定了到目前為止，它只用于定性或半定量檢測(根據(jù)檢測線灰度深淺定量)，且靈敏度也不如前述的定量免分析方法，其進(jìn)一步的應(yīng)用遇到了瓶頸。因此，本領(lǐng)域急需對現(xiàn)有的膠體金層析方法進(jìn)行變革，在保持其諸如快捷、簡便、成本低廉等原有的一切優(yōu)勢的前提下，又賦予其高靈敏度和定量準(zhǔn)確的新優(yōu)勢，進(jìn)一步深入而廣泛地擴展其應(yīng)用領(lǐng)域。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種測試片，用于定量檢測樣品中的待測物。本發(fā)明提供了一種定量檢測待測物的檢測方法，所述方法靈敏度高，定量準(zhǔn)確。本發(fā)明還提供了 一種定量檢測待測物的檢測裝置。本發(fā)明第一方面提供了一種測試片，用于定量檢測樣品中的待測物，該測試片包括:
可加入樣品的加樣區(qū)；位于加樣區(qū)近端的結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含一種或多種可流動的、可與待測物結(jié)合的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑中至少一種被吸光物質(zhì)標(biāo)記，所述結(jié)合劑能與待測物或其等同物結(jié)合形成含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物；位于結(jié)合區(qū)近端和加樣區(qū)遠(yuǎn)端的測試區(qū)，所述測試區(qū)包含固定化的檢測劑，所述檢測劑被熒光物質(zhì)標(biāo)記，所述檢測劑用于捕獲從結(jié)合區(qū)移動至測試區(qū)的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物；和位于測試區(qū)近端和結(jié)合區(qū)遠(yuǎn)端的樣品吸收區(qū)，其中吸收區(qū)具有吸收能力，從而使得加至加樣區(qū)的樣品從加樣區(qū)擴散至末端樣品吸收區(qū)；其中，當(dāng)所述檢測劑捕獲含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物時，所述吸光物質(zhì)影響所述熒光物質(zhì)的熒光強度。在另一優(yōu)選例中，所述待測物為抗原或抗體。在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合劑特異性結(jié)合待測物或其等同物；較佳地，所述結(jié)合劑為抗原、抗體或寡核苷酸。在另一優(yōu)選例中，所述含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物可以含有待測物，也可以含有其等同物。在另一優(yōu)選例中，所述檢測劑特異性結(jié)合所述含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物；較佳地，所述檢測劑為熒光標(biāo)記的抗原或抗體。在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合區(qū)可以包含兩種結(jié)合劑，其中，一種被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑，另一種被生物素標(biāo)記的結(jié)合劑，所述兩種結(jié)合劑同時與待測物結(jié)合，從而形成一種被生物素標(biāo)記的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，所述測試區(qū)的檢測劑為熒光標(biāo)記的鏈親和素。在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合劑的數(shù)量大于所述待測物的數(shù)量；所述檢測劑的數(shù)量大于含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物的數(shù)量。在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合區(qū)包括第一結(jié)合區(qū)和第二結(jié)合區(qū)，其中，所述第一結(jié)合區(qū)位于加樣區(qū)近端，包含被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑；所述第二結(jié)合區(qū)位于加樣區(qū)的遠(yuǎn)端，包含被生物素標(biāo)記的待測物等同物；其中，所述被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑的數(shù)量大于待測物的數(shù)量，所述結(jié)合劑與待測物結(jié)合后，剩余的結(jié)合劑移動至第二結(jié)合區(qū)，與所述被生物素標(biāo)記的待測物等同物結(jié)合形成被生物素標(biāo)記的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，所述測試區(qū)的檢測劑為熒光標(biāo)記的鏈親和素。在另一優(yōu)選例中，所述被生物素標(biāo)記的待測物等同物的數(shù)量大于所述剩余的結(jié)合劑的數(shù)量。在另一優(yōu)選例中，所述的待測物包括:蛋白、核酸或小分子化合物。在另一優(yōu)選例中，所述的待測物是液相(溶液)、懸浮液或固相。在另一優(yōu)選例中，當(dāng)待測物為固相時，步驟(2)還包括加入溶劑(如水或緩沖液)。在另一優(yōu)選例中，所述的待測物包括腫瘤標(biāo)志物、心肌標(biāo)志物等特異性的蛋白。在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合劑和待測物或其等同物、檢測劑和復(fù)合物的結(jié)合為特異性結(jié)合。
在另一優(yōu)選例中，所述的待測物或其等同物是抗原，且所述的結(jié)合劑和檢測劑是可同時結(jié)合于所述抗原的抗體；或者所述的待測物或其等同物是抗體，且所述的結(jié)合劑和檢測劑是可同時結(jié)合于所述抗體的抗原或所述抗體的抗體(抗抗體)。在另一優(yōu)選例中，所述結(jié)合劑為被生物素標(biāo)記的結(jié)合劑，所述檢測劑為熒光標(biāo)記的鏈親和素。在另一優(yōu)選例中，所述待測物等同物被生物素標(biāo)記，所述檢測劑為熒光標(biāo)記的鏈
親和素。在另一優(yōu)選例中，所述熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜與所述吸光物質(zhì)的吸收光譜全部或部分重疊。在另一優(yōu)選例中，所述熒光物質(zhì)選自下組:熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4，5_ 二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點、或稀土元素離子或其螯合物。在另一優(yōu)選例中，所述的吸光物質(zhì)選自下組:膠體金、納米金棒、納米銀棒或其組
八
口 o在另一優(yōu)選例中，所述的吸光物質(zhì)為納米金棒。在另一優(yōu)選例中，所述的納米金棒的縱橫比為1.5-10，較佳地為1.5-5。在另一優(yōu)選例中，所述的納米金棒的長度為10-200nm，較佳地為20-100nm。在另一優(yōu)選例中，所述的膠體金是平均粒徑為10_70nm的膠體金顆粒。在另一優(yōu)選例中，在測試區(qū)和樣品吸收區(qū)之間還包含至少一個對照區(qū)，所述對照區(qū)含有固定化的對照劑，其中，所述對照劑用于特異性結(jié)合被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑。在另一優(yōu)選例中，所述對照區(qū)用于控制待測物的檢測結(jié)果的有效性。本發(fā)明第二方面提供了一種定量檢測待測物的熒光分析方法，包括步驟:(I)提供一種本發(fā)明第一方面所述的測試片；(2)將待測物樣品加入加樣區(qū)；(3)樣品中的待測物移動至結(jié)合區(qū)，與其中的結(jié)合劑結(jié)合，從而形成含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物；(4)步驟(3)得到的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物移動至測試區(qū)，與其中的檢測劑結(jié)合，從而形成含有吸光物質(zhì)和熒光物質(zhì)的復(fù)合物；(5)測量步驟(4)得到的含有吸光物質(zhì)和熒光物質(zhì)的復(fù)合物的熒光強度F，從而換算為待測物的數(shù)量。在另一優(yōu)選例中，步驟(3)中所述結(jié)合區(qū)包括第一結(jié)合區(qū)和第二結(jié)合區(qū)，其中，所述第一結(jié)合區(qū)位于加樣區(qū)近端，包含被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑；所述第二結(jié)合區(qū)位于加樣區(qū)的遠(yuǎn)端，包含被生物素標(biāo)記的待測物等同物；其中，所述被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑的數(shù)量大于待測物的數(shù)量，所述結(jié)合劑與待測物結(jié)合后，剩余的結(jié)合劑移動至第二結(jié)合區(qū)，與所述被生物素標(biāo)記的待測物等同物結(jié)合形成被生物素標(biāo)記的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物。在另一優(yōu)選例中，步驟(5)包括:將含有吸光物質(zhì)和熒光物質(zhì)的復(fù)合物的熒光強度F和標(biāo)準(zhǔn)曲線或者與未加樣的初始熒光強度進(jìn)行比較，從而確定待測物的數(shù)量。在另一優(yōu)選例中，所述的方法還包括用已知濃度的待測物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行測量，從而制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟。本發(fā)明第三方面提供了一種定量檢測待測物的熒光測量裝置，所述的裝置包括:(a) 一本發(fā)明第一方面提所述的測試片；(b) 一用于檢測熒光強度的檢測器；和(c)描述本發(fā)明第二方面提所述方法的使用說明。在另一優(yōu)選例中，所述裝置還包括光源和計算機。所述光源通過光導(dǎo)纖維照射到檢測線處，激發(fā)出的熒光通過光導(dǎo)纖維進(jìn)入檢測器，由計算機進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文(如實施例)中具體描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在
此不再一一累述。


圖1是測試片示意圖。圖2是檢測裝置示意圖。圖3是實施例1的AFP標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(C)與相應(yīng)熒光強度(F)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖4是實施例2的AFP標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(C)與相應(yīng)熒光強度(F)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。圖5是實施例3的CRP標(biāo)準(zhǔn)系列濃度(C)與相應(yīng)熒光強度(F)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式本發(fā)明人通過長期而深入的研究，發(fā)現(xiàn)了一種基于熒光淬滅原理的檢測方法，所述方法不僅可以通過目測測試區(qū)的顏色來判斷是否含有待測物，更優(yōu)秀的是可以通過測量測試區(qū)熒光強度的方式來定量檢測待測物，不僅快捷、簡便、成本低廉，而且具有靈敏度高，定量準(zhǔn)確的優(yōu)點。所述方法是基于本發(fā)明提供的一種測試片，通過一種含有光源和檢測器的裝置實現(xiàn)了對待測物的定量檢測。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人完成了本發(fā)明。測試片現(xiàn)在更詳細(xì)地描述用于制造本發(fā)明測試片的方法和材料。應(yīng)注意，測試片的具體構(gòu)造可以變化，這取決于意圖用測試片來進(jìn)行的具體測試。在實施例之外制造測試片的變動方法，也落于本發(fā)明范圍之中。如圖1所示，測試片I可包括背襯片2，其長度與測試片相同。加樣區(qū)3位于測試片的一端，樣品墊片31位于加樣區(qū)，可通過粘合劑粘貼于加樣區(qū)。吸收區(qū)7位于測試片的另一端，在加樣區(qū)的遠(yuǎn)端，吸水墊片71位于吸收區(qū)。結(jié)合區(qū)4位于加樣區(qū)和吸收區(qū)之間，在加樣區(qū)的近端和吸收區(qū)的遠(yuǎn)端，結(jié)合墊片41位于結(jié)合區(qū)。測試區(qū)5 (也稱檢測線)位于結(jié)合區(qū)和吸收區(qū)之間，通常測試區(qū)設(shè)置在膜片56上，通過所述膜片連接結(jié)合墊和吸水墊。優(yōu)選地，所述膜片上還設(shè)置有對照區(qū)6 (也稱質(zhì)控線)，且通常對照區(qū)位于測試區(qū)和吸收區(qū)之間，與測試區(qū)之間有適當(dāng)?shù)目臻g。測試片制造方法，優(yōu)選地，如圖1所示，分別將樣品墊片、結(jié)合墊片、膜片、吸水墊片通過粘合劑粘貼于背襯板上，即得所述測試片。背襯片可以用任何穩(wěn)定的、無孔的材料制成，其強度應(yīng)足以支承材料和粘于其的測試片。因為許多測定用水作為擴散介質(zhì)，因此背襯片較佳地是基本上不透水的。在一個優(yōu)選例中，背襯片是用聚合物膜制成的，更佳地是用聚氯乙烯膜制成的(如PVC膠板)。樣品墊片可用任何吸收性材料制成?？墒褂玫牟牧侠影?纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜。結(jié)合墊片或膜片可以用任何材料制成，只要該材料有足夠孔隙度從而允許在表面和內(nèi)部發(fā)生流體的毛細(xì)管作用。結(jié)合墊片或膜片應(yīng)有足夠的孔隙度，從而允許涂有抗體或抗原的顆粒移動。結(jié)合墊片或膜片還可被含待檢測分析物的樣品中所用的液體潤濕(例如，對于水性液體具有親水性，對于有機溶劑具有疏水性)。通過例如在美國專利N0.4，340，482或N0.4，618，533中所述的方法(這些方法描述了將疏水表面轉(zhuǎn)變成親水表面)，可以改變其疏水性從而使其具有親水性以便用于水性液體。可用于制造結(jié)合墊片或膜片的材料例子包括:聚脂膜、纖維素、硝酸纖維素、乙酸纖維素、玻璃纖維、尼龍、聚電解質(zhì)離子交換膜、丙烯共聚物/尼龍、和聚醚砜(polyethersulfone)。在一個優(yōu)選例中，結(jié)合墊片是用聚脂膜制成的，膜片是用硝酸纖維素制成的。吸收墊片可以用任何能吸收作為樣品和緩沖液的液體的材料制成。吸收墊片的吸收能力應(yīng)足夠大，以便吸收添加至測試片的液體。適用于吸收墊片的材料的例子包括纖維素和玻璃纖維。檢測方法本發(fā)明測試片可用于大量不同的側(cè)流分析方法，而這些分析方法涉及使用一種或多種可流動的結(jié)合劑和一種固定化的檢測劑。其中，所述結(jié)合劑中至少一種是被吸光物質(zhì)標(biāo)記，所述結(jié)合劑能與待測物或其等同物結(jié)合形成含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物；所述檢測劑是被熒光物質(zhì)標(biāo)記的，所述檢測劑用于捕獲從結(jié)合區(qū)移動至測試區(qū)的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物，從而形成含有吸光物質(zhì)和熒光物質(zhì)的復(fù)合物。具體地，當(dāng)所述吸光物質(zhì)影響(部分淬滅或全部淬滅)所述熒光物質(zhì)的熒光強度時，本發(fā)明的檢測方法即可通過檢測熒光物質(zhì)的熒光強度來測定待測物的數(shù)量。如本文所用，術(shù)語“待測物”、“其等同物”或“分析物”指待用測試片檢測以及可任選地被定量測定的、樣品中的任何組份，待測物或其等同物或分析物的例子包括:蛋白質(zhì)，如激素或其他分泌蛋白質(zhì)、酶和細(xì)胞表面蛋白；糖蛋白；肽；小分子；多糖；抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體及其片段)；核酸；藥物(包括地高辛等強心甙類藥物)；毒素；病毒或病毒顆粒；細(xì)胞壁組份；或其他具有表位的化合物。優(yōu)選地，所述的待測物包括腫瘤標(biāo)志物、心肌標(biāo)志物等特異性的蛋白，所述腫瘤標(biāo)志物選自下組:甲胎蛋白(AFP)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、癌胚抗原(CEA)、癌抗原125 (CA125)、糖抗原19-9 (CA19-9)、總前列腺特異性抗原(PSA)、游離前列腺特異性抗原(f-PSA)、神經(jīng)原特異性烯醇化酶(NSE)、糖鏈抗原(CA242)、癌抗原(CA15-3)、或人絨毛膜促性腺激素(3 -HCG)。結(jié)合劑本發(fā)明所用的結(jié)合劑可以是任何能夠結(jié)合于待測物或其等同物的物質(zhì)。具體地，為特異性結(jié)合待測物或其等同物的物質(zhì)。
有各種不同類型的分子可用作分析物結(jié)合劑，其中包括例如:寡核苷酸、抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結(jié)合位點)的異源混合物的裂解物。P.Holliger 等人,Trends in Biotechnology 13:7-9(1995) ;S.M.Chamow 等人,Trends inBiotechnology 14:52-60 (1996)。如果待檢測分析物是配體,那么可使用結(jié)合于該配體的受體，反之亦然。檢測劑本發(fā)明所用的檢測劑可以是任何能結(jié)合從結(jié)合區(qū)移動至測試區(qū)的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物的物質(zhì)，包括例如:抗體、工程化蛋白、肽、半抗原、或含有抗原(該抗原具有分析物結(jié)合位點)的異源混合物的裂解物。優(yōu)選地，可以通過抗原和抗體的結(jié)合或寡核苷酸與互補核酸單鏈特異性結(jié)合的方式將含有熒光標(biāo)記的物質(zhì)與含有吸光物質(zhì)標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合；還可以通過生物素(biotin)和鏈親和素(Streptavidin，SA)的結(jié)合方式，從而將含有熒光標(biāo)記的物質(zhì)與含有吸光物質(zhì)標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合。標(biāo)記物質(zhì)連于結(jié)合劑或檢測劑的可檢測標(biāo)記物包括大量不同物質(zhì)，只要標(biāo)記物能夠被檢測?？蓹z測標(biāo)記物的例子包括(但并不限于):顆粒、發(fā)光標(biāo)記物；比色標(biāo)記物、熒光標(biāo)記物；化學(xué)標(biāo)記物；酶；放射性標(biāo)記物；或射頻標(biāo)記物；金屬膠體；和化學(xué)發(fā)光標(biāo)記物。常用檢測方法的例子包括(但并不限于):光學(xué)方法，如測量光散射、單反射、光度計或光電倍增管；放射性(用蓋革計數(shù)器等進(jìn)行測量)；導(dǎo)電性或電介質(zhì)(電容)；電化學(xué)法檢測所釋放的電活性物質(zhì)，如銦、秘、鎵、締離子[如用Hayes等人(Analytical Chem.66:1860-1865 (1994)所述的方法]，或亞鐵氰化物[如用 Roberts 和 Durst (Analytical Chem.67:482-491 (1995)所提出的方法。其中通過在檢測區(qū)滴加洗滌劑，使包裹在脂質(zhì)體中的亞鐵氰化物被釋放出，然后用電化學(xué)法檢測釋放的亞鐵氰化物]。其他常規(guī)方法只要合適，也可使用。在一個優(yōu)選例中，可檢測標(biāo)記物是顆粒?？墒褂玫念w粒例子包括(但并不限于):膠體金顆粒；膠體硫顆粒；膠體硒顆粒；膠體硫酸鋇顆粒；膠體硫酸鐵顆粒；金屬碘酸鹽顆粒；鹵化銀顆粒；二氧化娃顆粒；膠體(水合)金屬氧化物顆粒；膠體金屬硫化物顆粒；膠體硒化鉛顆粒；膠體硒化鎘顆粒；膠體金屬磷酸鹽顆粒；膠體金屬鐵酸鹽顆粒；涂有有機或無機層的上述任一種膠體顆粒；蛋白質(zhì)或肽分子；脂質(zhì)體；或有機聚合物乳膠顆粒，例如聚苯乙烯乳膠珠。用于檢測劑的標(biāo)記物，本發(fā)明優(yōu)先選用熒光標(biāo)記物(簡稱熒光物質(zhì))，用于結(jié)合劑的標(biāo)記物，本發(fā)明優(yōu)先選用吸光物質(zhì)標(biāo)記物(簡稱吸光物質(zhì))。當(dāng)熒光標(biāo)記物和吸光標(biāo)記物通過特定的方式結(jié)合后，當(dāng)熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜與吸光物質(zhì)的吸收光譜部分或完全重疊時,吸光物質(zhì)會影響(部分淬滅或全部淬滅)突光物質(zhì)的突光，從而通過檢測突光物質(zhì)的熒光強度來測定待測物的數(shù)量。熒光物質(zhì)和吸光物質(zhì)的選擇用于本發(fā)明標(biāo)記的熒光物質(zhì)和吸光物質(zhì)應(yīng)配合使用，基本原則是熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜與吸光物質(zhì)的吸收光譜部分或完全重疊。最優(yōu)的是完全重疊，如此會有較高的檢測靈敏度。代表性的熒光物質(zhì)包括(但并不限于):熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4,5-二甲氧基突光素、羅丹明、藻紅蛋白(Phycoerythrin, PE)、量子點、稀土元素離子(如Eu3+)及其螯合物等組合，只要所選熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜與所選吸光物質(zhì)的吸收光譜
有重疊即可。代表性的吸光物質(zhì)包括(但并不限于):膠體金、納米金棒、納米銀棒等組合，只要所選吸光物質(zhì)的吸收光譜與所選熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜重疊即可。膠體金顆?？捎萌魏纬Ｒ?guī)方法制造,例如總結(jié)于G.Frens, 1973 Nature PhysicalScience, 241:20(1973)中的方法。其他方法描述于美國專利N0.5，578，577、5，141,850、4，775，636、4，853，335、4，859，612、5，079，172、5，202，267、5，514，602、5，616，467、5，681，775。如本文所用，術(shù)語“納米金棒”指具有一定縱橫比、且橫軸和縱軸處于5-200納米范圍的金顆粒。一種特別優(yōu)選的吸光物質(zhì)是膠體金，尤其是粒徑為20-40nm的膠體金。優(yōu)選地，本領(lǐng)域技術(shù)人員常用熒光標(biāo)記物質(zhì)包括PE，PE的吸收光譜在550 650nm之間，最大發(fā)射波長為575nm,而30nm膠體金的吸收光譜在300 800nm,較寬泛,最大吸收峰為525 530nm處，與PE的發(fā)射光譜有部分重疊，所以選擇30nm膠體金作為相應(yīng)的吸光物質(zhì)。熒光淬滅原理含有熒光標(biāo)記的物質(zhì)與含有吸光物質(zhì)標(biāo)記的物質(zhì)結(jié)合后，當(dāng)熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜與作為熒光淬滅劑的吸光物質(zhì)的吸收光譜全部或部分重疊時，因共振能量轉(zhuǎn)移，吸光物質(zhì)會對該熒光物質(zhì)的熒光產(chǎn)生淬滅作用。本發(fā)明中，引起熒光淬滅的原因包括兩個方面:一是復(fù)合物內(nèi)部吸光物質(zhì)對熒光物質(zhì)的淬滅；二是堆積在一起的復(fù)合物之間的相互淬滅，如:復(fù)合物甲的吸光物質(zhì)淬滅復(fù)合物乙的熒光，復(fù)合物乙的吸光物質(zhì)淬滅復(fù)合物丙的熒光，復(fù)合物丙的吸光物質(zhì)淬滅復(fù)合物甲的熒光，依此類推。工作原理現(xiàn)結(jié)合圖1和具體的實施方式說明本發(fā)明檢測方法的工作原理:方法一、(1.1)樣品加在玻璃纖維樣品墊片上，樣品中的待測物(如抗原)在毛細(xì)作用下向吸水墊片方向移動，途經(jīng)載有結(jié)合劑(如抗原的膠體金標(biāo)記抗體，簡稱為抗原的金標(biāo)抗體)的聚酯膜結(jié)合墊片后，將金標(biāo)抗體完全復(fù)溶，同時樣品中待測物和結(jié)合劑(如抗原與其金標(biāo)抗體)形成如金標(biāo)抗體-抗原的2元復(fù)合物。(1.2)上述2元復(fù)合物繼續(xù)前行至硝酸纖維素膜片的檢測線處，固定在此的熒光物質(zhì)標(biāo)記的針對抗原的檢測劑(如突光標(biāo)記的第2抗體)捕獲2元復(fù)合物,形成3元復(fù)合物，即“夾心復(fù)合物”，其中的金淬滅檢測線處的熒光物質(zhì)的熒光。(1.3)多余的游離金標(biāo)抗體繼續(xù)前移，被固定在質(zhì)控線處的對照劑(如抗金標(biāo)抗體的抗體)捕獲，呈現(xiàn)紅色，說明檢測有效。(1.4)測定檢測線處熒光物質(zhì)的熒光強度，熒光越強說明目標(biāo)抗原濃度越低，反之則越高；如樣本中無抗原時，不能形成“夾心復(fù)合物”，則檢測線處的熒光強度為原始熒光強度。
方法二、檢測線處也可固定其他能捕獲“夾心復(fù)合物”的熒光標(biāo)記物質(zhì)。(2.1)樣品加在玻璃纖維樣品墊片上，樣品中的待測物(如抗原)向吸水墊片方向移動，途經(jīng)載有兩種結(jié)合劑的(如金標(biāo)抗體和biotin標(biāo)記的抗體)的聚酯膜結(jié)合墊片后，將金標(biāo)抗體和biotin標(biāo)記的抗體完全復(fù)溶后，樣品中的待測物和所述兩種結(jié)合劑(如抗原與金標(biāo)抗體、biotin標(biāo)記的抗體)形成如金標(biāo)抗體-抗原-抗體-biotin的3元復(fù)合物。(2.2)上述復(fù)合物繼續(xù)前行至硝酸纖維素膜條的檢測線處，固定在此的熒光標(biāo)記的能與biotin結(jié)合的檢測劑(如熒光標(biāo)記的SA)捕獲3元復(fù)合物，形成4元復(fù)合物，其中的金淬滅檢測線處的熒光物質(zhì)的熒光。(2.3)多余的游離金標(biāo)抗體繼續(xù)前移，被固定在質(zhì)控線處的對照劑(如抗金標(biāo)抗體的抗體)捕獲，呈現(xiàn)紅色，說明檢測有效。(2.4)測定檢測線處熒光物質(zhì)的熒光強度，熒光越強說明目標(biāo)抗原濃度越低，反之則越高；如樣本中無抗原時，不能形成“夾心復(fù)合物”，則檢測線處的熒光強度為原始熒光強度。方法三、本發(fā)明還適用于競爭抑制法:(3.1)分別將結(jié)合劑(如金標(biāo)抗體)和待測物等同物(如biotin標(biāo)記抗原)分別滴加于圖1的聚脂膜處，結(jié)合劑靠近樣品墊，待測物等同物靠近檢測線，2者隔開適宜的空間距離。(3.2)樣品加在玻璃纖維樣品墊片上，其中的待測物(如抗原)向吸水墊片方向移動，途經(jīng)載有結(jié)合劑(如抗原的金標(biāo)抗體)的聚酯膜后，將結(jié)合劑完全復(fù)溶，樣品中的待測物和結(jié)合劑形成如金標(biāo)抗體-抗原的“第I 二元復(fù)合物”，剩余的結(jié)合劑又與聚脂膜上的待測物等同物形成如金標(biāo)抗體-抗原-biotin的“第2 二元復(fù)合物”。(3.3)上述2種復(fù)合物繼續(xù)前行至硝酸纖維素膜片的檢測線處，固定在此的檢測劑(如熒光標(biāo)記的SA)只捕獲“第2 二元復(fù)合物”，其中的金淬滅檢測線處熒光物質(zhì)的熒光。(3.4)測定檢測線處熒光物質(zhì)的熒光強度。樣品中目標(biāo)抗原越多，則生成的“第2二元復(fù)合物”越少，對檢測線處的熒光淬滅越弱，相應(yīng)地，熒光信號越強，反之，樣品中目標(biāo)抗原越少，檢測線處的熒光信號越弱。檢測裝置現(xiàn)結(jié)合圖2說明本發(fā)明的檢測裝置:如圖2所示，所述裝置可以包括:測試片、檢測器、光源、光導(dǎo)纖維和計算機。還可以包括一份檢測方法的使用說明。其中測試片的工作原理如上所述，熒光強度的檢測方法可以如下所述(但不僅限于此)，任何可用于檢測熒光強度的方法均可用于本發(fā)明的檢測
>J-U裝直。熒光強度的檢測光源通過光導(dǎo)纖維照射到檢測線處，激發(fā)出的熒光通過光導(dǎo)纖維進(jìn)入檢測器，所得到的數(shù)據(jù)由計算機進(jìn)行處理和分析。所述光導(dǎo)纖維可以是Y型的，分別連接于光源、檢測線和檢測器。本發(fā)明中，光源用于提供某一發(fā)射波長的光線，從而激發(fā)突光物質(zhì)發(fā)出突光?？蛇x用任何可以提供合適波長的光源，包括(但不限于):LED、氙燈、齒鎢燈、激光等。一種優(yōu)選的光源是激光光源，激光光源可用本領(lǐng)域常規(guī)的方法和設(shè)備(如激光器)產(chǎn)生。代表性的激光器包括(但并不限于):半導(dǎo)體激光器、氦氖激光器、氬離子激光器、還包括波長可選的激光器、多波長激光器和雙波長激光器等。激光器產(chǎn)生的激光波長與激光介質(zhì)有關(guān)，常見的激光波長見下表1:表I
權(quán)利要求
1.一種測試片，其特征在于，用于定量檢測樣品中的待測物，該測試片包括: 可加入樣品的加樣區(qū)； 位于加樣區(qū)近端的結(jié)合區(qū)，所述結(jié)合區(qū)包含一種或多種可流動的、可與待測物結(jié)合的結(jié)合劑，所述結(jié)合劑中至少一種被吸光物質(zhì)標(biāo)記，所述結(jié)合劑能與待測物或其等同物結(jié)合形成含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物； 位于結(jié)合區(qū)近端和加樣區(qū)遠(yuǎn)端的測試區(qū)，所述測試區(qū)包含固定化的檢測劑，所述檢測劑被熒光物質(zhì)標(biāo)記，所述檢測劑用于捕獲從結(jié)合區(qū)移動至測試區(qū)的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物；和 位于測試區(qū)近端和結(jié)合區(qū)遠(yuǎn)端的樣品吸收區(qū)，其中吸收區(qū)具有吸收能力，從而使得加至加樣區(qū)的樣品從加樣區(qū)擴散至末端樣品吸收區(qū)； 其中，當(dāng)所述檢測劑捕獲含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物時，所述吸光物質(zhì)影響所述熒光物質(zhì)的熒光強度。
2.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述結(jié)合區(qū)包括第一結(jié)合區(qū)和第二結(jié)合區(qū)，其中，所述第一結(jié)合區(qū)位于加樣區(qū)近端，包含被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑；所述第二結(jié)合區(qū)位于加樣區(qū)的遠(yuǎn)端，包含被生物素標(biāo)記的待測物等同物； 其中，所述被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑的數(shù)量大于待測物的數(shù)量，所述結(jié)合劑與待測物結(jié)合后，剩余的結(jié)合劑移動至第二結(jié)合區(qū)，與所述被生物素標(biāo)記的待測物等同物結(jié)合形成被生物素標(biāo)記的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物。
3.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述的待測物包括:蛋白、核酸或小分子化合物。
4.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述結(jié)合劑和待測物或其等同物、檢測劑和復(fù)合物的結(jié)合為特異性結(jié)合。
5.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述熒光物質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜與所述吸光物質(zhì)的吸收光譜全部或部分重疊。
6.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述熒光物質(zhì)選自下組:熒光素、羧基熒光素、2-甲氧基熒光素、4，5_ 二甲氧基熒光素、羅丹明、藻紅蛋白、量子點、或稀土元素離子或其螯合物。
7.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，所述的吸光物質(zhì)選自下組:膠體金、納米金棒、納米銀棒或其組合。
8.如權(quán)利要求1所述的測試片，其特征在于，在測試區(qū)和樣品吸收區(qū)之間還包含至少一個對照區(qū)，所述對照區(qū)含有固定化的對照劑，其中，所述對照劑用于特異性結(jié)合被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑。
9.一種定量檢測待測物的熒光分析方法，其特征在于，包括步驟: (1)提供一種如權(quán)利要求1所述的測試片； (2)將待測物樣品加入加樣區(qū)； (3)樣品中的待測物移動至結(jié)合區(qū)，與其中的結(jié)合劑結(jié)合，從而形成含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物； (4)步驟(3)得到的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物移動至測試區(qū)，與其中的檢測劑結(jié)合，從而形成含有吸光物質(zhì)和熒光物質(zhì)的復(fù)合物；(5)測量步驟(4)得到的含有吸光物質(zhì)和熒光物質(zhì)的復(fù)合物的熒光強度F，從而換算為待測物的數(shù)量。
10.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(3)中所述結(jié)合區(qū)包括第一結(jié)合區(qū)和第二結(jié)合區(qū)，其中，所述第一結(jié)合區(qū)位于加樣區(qū)近端，包含被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑；所述第二結(jié)合區(qū)位于加樣區(qū)的遠(yuǎn)端，包含被生物素標(biāo)記的待測物等同物； 其中，所述被吸光物質(zhì)標(biāo)記的結(jié)合劑的數(shù)量大于待測物的數(shù)量，所述結(jié)合劑與待測物結(jié)合后，剩余的結(jié)合劑移動至第二結(jié)合區(qū)，與所述被生物素標(biāo)記的待測物等同物結(jié)合形成被生物素標(biāo)記的含有吸光物質(zhì)的復(fù)合物。
11.如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，步驟(5)包括:將含有吸光物質(zhì)和熒光物質(zhì)的復(fù)合物的熒光強度F和標(biāo)準(zhǔn)曲線或者與未加樣的初始熒光強度R)進(jìn)行比較，從而確定待測物的數(shù)量。
12.一種定量檢測待測物的熒光測量裝置，其特征在于，所述的裝置包括: (a)一權(quán)利要求1所述的測試片； (b)一用于檢測熒光強度的檢測器；和 (c)描述權(quán)利要 求9所述方法的使用說明。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種熒光分析方法和裝置，具體地，公開了一種定量檢測待測物的檢測方法和一種基于所述檢測方法的檢測裝置。
文檔編號G01N21/64GK103149182SQ201110400498
公開日2013年6月12日 申請日期2011年12月6日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月6日
發(fā)明者王雅杰, 其他發(fā)明人請求不公開姓名 申請人:龐磊