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      利用dna序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體檢測(cè)l-組氨酸的方法

      文檔序號(hào):6024772閱讀:697來源:國(guó)知局
      專利名稱:利用dna序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體檢測(cè)l-組氨酸的方法
      利用DNA序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體檢測(cè)L-組氨酸的方法技術(shù)領(lǐng)域
      本發(fā)明屬于生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域,具體是基于DNA序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體的檢測(cè)L-組氨酸的方法。
      背景技術(shù)
      L-組氨酸,20種天然氨基酸中的一種,它作為一個(gè)神經(jīng)傳遞介質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì)在哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用,它也已經(jīng)被表明在生物的重要基底里支配金屬的傳輸和減小微小創(chuàng)傷的內(nèi)部流血;足夠高劑量的L-組氨酸的攝取能導(dǎo)致中毒癥狀,因此,生物體液里的L-組氨酸的檢測(cè)將是非常重要的。
      被經(jīng)常用來分析L-組氨酸水平的方法是毛細(xì)管電泳、熒光測(cè)定法和比色法。然而這些方法卻存在一些不足,包括不穩(wěn)定的化學(xué)和熒光特性、來自于污染的著色劑、熒光團(tuán)和冷卻器的潛在的錯(cuò)誤信號(hào)以及經(jīng)常對(duì)笨重的光學(xué)儀器設(shè)備的依賴。
      和質(zhì)譜分析相結(jié)合的高性能的液體色譜分析法和氣體色譜分析法也已經(jīng)被應(yīng)用在L-組氨酸的檢測(cè),這些方法經(jīng)常需要昂貴的機(jī)器設(shè)施和復(fù)雜的操作程序,同時(shí)需要生物樣品的乏味冗長(zhǎng)的前處理過程,因此檢測(cè)微量L-組氨酸的電化學(xué)方法被開發(fā),但是很少描述L-組氨酸的手性分析,到目前為止關(guān)于報(bào)道的手性分析技術(shù)都是建立在色譜法、毛細(xì)管區(qū)帶電泳、質(zhì)譜分析和電分析基礎(chǔ)上的,電分析方法具備相對(duì)高的效率和低費(fèi)用的特征,然而,現(xiàn)有的采用電化學(xué)法分析L-組氨酸的方法,存在窄的線性范圍和相對(duì)高的檢測(cè)限。
      脫氧核酶是具有催化性能的DNA序列,它通過試管內(nèi)育種分離出來。輔酶依賴型的脫氧核酶能在選擇的過程中通過變化的輔酶和變化的輔酶濃度產(chǎn)生。RNA的自斷裂活動(dòng)產(chǎn)生于核糖2’羥(基)氫氧基。當(dāng)某種陽(yáng)離子金屬出現(xiàn)或者在堿性條件下,這個(gè)羥(基) 氫氧基形成一個(gè)2’陽(yáng)離子,這個(gè)2’陽(yáng)離子在一個(gè)酯交換反應(yīng)中充當(dāng)一個(gè)親核試劑,切斷 RNA 鏈。Roth 和 Breaker (見參考文獻(xiàn)[l]Roth,A. , Breaker, R. R.,1998. Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. Α. 95,6027-6031.)報(bào)道了一個(gè)催化性的DNA的試管內(nèi)篩選,在RNA鏈斷裂反應(yīng)中用L-組氨酸作為一個(gè)主動(dòng)的輔酶,動(dòng)力分析表明,一個(gè)DNA-L-組氨酸復(fù)合物可能完成反應(yīng)類似于核糖核酸酶的催化機(jī)制的第一步,L-組氨酸的咪唑官能團(tuán)充當(dāng)一般的堿性催化劑。
      另外納米金晶體具有獨(dú)特的表面等離子共振性質(zhì),以及卓越的生物兼容性的特點(diǎn)。它在生物傳感領(lǐng)域有著巨大的潛在應(yīng)用前景。但是,以往傳統(tǒng)方法合成的納米金晶體都是以較低的指數(shù)面包圍,如(100),(111),(110)等。眾所周知,具有高能指數(shù)面的納米金晶體由于表面具有高密度的原子階梯而具有極高的化學(xué)活性和電催化活性,然而正是由于這些具有高表面能的晶面在晶體合成過程中迅速地消失,以致長(zhǎng)期以來,合成高指數(shù)面的納米金晶體具有很大的難度。發(fā)明內(nèi)容
      本發(fā)明的目的是克服傳統(tǒng)L-組氨酸檢驗(yàn)方法的不足,提供一種簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、靈敏度高,可以手性識(shí)別L-組氨酸的方法。在本發(fā)明中,采用簡(jiǎn)單方便的濕化學(xué)方法合成出具有M個(gè)高能指數(shù)面的納米金晶體(拉長(zhǎng)二十四面體),極大地提高了電化學(xué)法檢測(cè)L-組氨酸的靈敏度。本發(fā)明中首次提出采用電化學(xué)方法來快速檢測(cè)L-組氨酸,該方法建立在依賴于L-組氨酸的自斷裂脫氧核酶上,并且基于具有高能指數(shù)面的納米金晶體的信號(hào)放大作用。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法,基于L-組氨酸存在和脫氧核酶的自斷裂活動(dòng)來產(chǎn)生傳感信號(hào),并通過高能指數(shù)面的納米金晶體的修飾達(dá)到信號(hào)放大的目的。本發(fā)明可以達(dá)到很低的檢測(cè)限(0. IpM)和非常好的選擇性,同時(shí)可以手性識(shí)別L-組氨酸。
      本發(fā)明提供的L-組氨酸的檢測(cè)方法,具體包括如下步驟
      第一步晶種溶液的制備把NaBH4溶液倒入含有濃度為0. IM的CTAB和濃度為 0. 5mM的HAuCl4的溶液中劇烈攪拌,溶液的顏色由黃色變?yōu)樯钭厣?,表明金顆粒的形成,之后,晶種溶液靜置1小時(shí)以備后用;
      第二步生長(zhǎng)液的制備把CTAB粉末溶解在濃度為0. OlM的DDAB溶液中配制成雙表面活性劑溶液,并且使雙表面活性劑溶液中CTAB和DDAB的摩爾比為4 ;在該雙表面活性劑溶液中,依次加入濃度為ImM的HAuCl4溶液,濃度為0. OlM的AgNO3溶液,濃度為 0. 5MH2S04溶液和濃度為0. IM的丙烯酸溶液制備出生長(zhǎng)液,該生長(zhǎng)液的pH值為2. 7 ;如果 DDAB溶液的體積為V,則加入雙表面活性劑溶液中的各溶液體積分別為V、0. 02V、0. 008V 和 0. 016V ;
      第三步取第一步中制備得到的晶種溶液,將晶種溶液混入第二步中制備的生長(zhǎng)液中,30°C下保持10小時(shí),得到具有高能指數(shù)面的納米金晶體,即拉長(zhǎng)二十四面體;
      第四步,雙鏈DNA的制備在I-B緩沖溶液中配置混合溶液,混合溶液中含有 1 μ MDNAlU μ M DNA2和ImM TCEP,將混合溶液放置在90°C水浴下保持5分鐘,然后自然冷卻到常溫;使用前放入-20°C條件下保存;
      第五步,玻碳電極表面的預(yù)處理
      (1)玻碳電極的清洗;
      (2)將濃度為5mg πιΓ1的納米金晶體的乙醇溶液均勻滴在清洗后的玻碳電極上直至完全干燥,然后用乙醇反復(fù)清洗直至洗去納米金晶體上的表面活性劑,然后用二次去離子水沖洗干凈至干燥,得到納米金晶體修飾的玻碳電極;
      (3)再移取第四步中制備的雙鏈DNA混合溶液滴在由納米金晶體修飾的玻碳電極上,在室溫下保持100%濕度放置20小時(shí)后,分別用TriS-HCl緩沖液和二次去離子水沖洗, 用氮?dú)獯蹈?,得到雙鏈DNA修飾的玻碳電極;
      (4)再滴加濃度為ImM的巰基己醇到第(3)步中雙鏈DNA修飾的玻碳電極表面,室溫下保持半小時(shí),然后分別用Tris-HCl緩沖液和二次去離子水沖洗,即得到最終的修飾后的玻碳電極傳感器;
      第六步,L-組氨酸的電化學(xué)方波檢測(cè)對(duì)于L-組氨酸的檢測(cè),將經(jīng)過第五步修飾后的玻碳電極傳感器放入具有不同濃度的L-組氨酸的I-B緩沖溶液里進(jìn)行即時(shí)檢測(cè),檢測(cè)所選用的方波掃描范圍為0-0. 8V。
      本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于簡(jiǎn)單快速,靈敏度高,選擇性好,可以進(jìn)行手性識(shí)別,具體為
      (1)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法對(duì)于L-組氨酸的最低檢測(cè)濃度可以達(dá)到0. IpM,并且線性范圍大。在0. IpM-O. 1 μ M濃度范圍內(nèi),檢測(cè)后的方波伏安峰電流和濃度的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系;
      (2)檢測(cè)速度快,峰電流值可以在30s內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定;
      (3)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法具有很強(qiáng)的專一性,類似的氨基酸都不會(huì)對(duì)L-組氨酸的檢測(cè)產(chǎn)生干擾,并且該方法的具有手性識(shí)別特點(diǎn),D-組氨酸也不會(huì)對(duì)檢測(cè)產(chǎn)生任何干擾;
      (4)重復(fù)性好,數(shù)次檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差不高于3% ;
      (5)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法具有良好的實(shí)用性,加標(biāo)樣品的回收率符合痕量分析標(biāo)準(zhǔn)。


      圖1 本發(fā)明中檢測(cè)L-組氨酸的雙鏈DNA結(jié)構(gòu)示意圖2 本發(fā)明中利用DNA自斷裂和高能指數(shù)面納米金晶體檢測(cè)L-組氨酸的機(jī)理圖3 本發(fā)明中制備的納米金晶體的微觀結(jié)構(gòu)圖,其中(a)是低分辨率的納米金晶體SEM圖;(b)和(c)是放大的SEM圖(比例尺是60nm) ; (d)是TEM圖和沿
      方向的 SEAD圖;(e)是TEM圖和沿WlO]方向的SEAD圖;(f)是納米金晶體的結(jié)構(gòu)模型圖4清洗好的裸玻碳電極在0. 5M H2SO4溶液中的典型的循環(huán)伏安譜圖5A 采用本發(fā)明的玻碳電極傳感器檢測(cè)L-組氨酸的方波圖;B 在L-組氨酸濃度為0. IpM-O. ΙμΜ濃度范圍內(nèi),采用本發(fā)明的玻碳電極傳感器檢測(cè)后的方波伏安峰電流和濃度的對(duì)數(shù)的線性關(guān)系;C 雙鏈DNA修飾而未經(jīng)納米金晶體修飾的裸金電極檢測(cè)不同濃度的L-組氨酸的方波伏安曲線;D 雙鏈DNA修飾而未經(jīng)納米金晶體修飾的裸金電極檢測(cè)的L-組氨酸濃度和方波伏安峰電流的關(guān)系,內(nèi)插圖為方波伏安峰(SWV峰)電流與L-組氨酸在ι. οχ ο—9 ι. ox ιο_5μ的對(duì)數(shù)成線性關(guān)系;
      圖6Α本發(fā)明的玻碳電極傳感器在不同時(shí)間對(duì)InM的L-組氨酸的SWV圖;B 檢測(cè)濃度為InM的L-組氨酸的方波伏安峰電流隨時(shí)間的關(guān)系曲線;
      圖7Α:本發(fā)明的玻碳電極傳感器同(a)濃度為OM L-組氨酸(b)濃度均為1 μ M的 D-組氨酸、L-胱氨酸和L-纈氨酸的混合物(c)濃度為InM L-組氨酸反應(yīng)后的方波伏安曲線;B 應(yīng)用本發(fā)明提供的玻碳電極傳感器檢測(cè)不同的氨基酸后的方波峰電流相對(duì)于背景方波峰電流信號(hào)的信號(hào)變化柱狀圖8 本發(fā)明的檢測(cè)方法對(duì)于濃度為InM的L-組氨酸的重復(fù)性檢驗(yàn)柱狀圖。
      具體實(shí)施方式
      下面將結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
      本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的主要技術(shù)特征是L-組氨酸的傳感原理以及高能指數(shù)面的納米金晶體的應(yīng)用。其中L-組氨酸的傳感原理是利用雙鏈DNA在L-組氨酸存在的條件下可以自發(fā)斷裂的機(jī)理設(shè)計(jì)而成的。其具體原理如下
      如圖1所示,本發(fā)明中使用的L-組氨酸所需的雙鏈DNA包括一個(gè)二茂鐵修飾的催化DNA2鏈和一個(gè)與之雜交且互補(bǔ)的具有22個(gè)堿基的底物寡核苷酸DNA1,所述的 DNAl包含一個(gè)單個(gè)的、無柄的腺嘌呤,如圖1箭頭所示。所述的DNA2由M個(gè)脫氧核苷酸的功能域組成,在這M個(gè)脫氧核苷酸兩側(cè)(從5’到3’ )分別是由8個(gè)核苷酸組成的底物和識(shí)別區(qū)域,為了設(shè)計(jì)一個(gè)信號(hào)增大的自斷裂脫氧核酶?jìng)鞲衅?,一個(gè)氧化還原探針 (二茂鐵)被增加到DNA2鏈的5,方向的尾端。DNA 1 :3,-CGA CTC ACT ATrA GGA AGA GAT G-5' ;DNA 2:3’ -SH-(CH2)6-CAT CTC TTG ATC GGG GCT GTG CGG GTA GGA AGT-AAT AGTGAG-5,- (CH2) 6-ferrocene。
      如圖2,當(dāng)L-組氨酸未出現(xiàn)時(shí),雙鏈DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)是相當(dāng)牢固的,可能阻止二茂鐵接觸電極傳遞電子。通過Marcus電子轉(zhuǎn)移理論可知,二茂鐵的氧化還原反應(yīng)是非常受距離制約的,因此,在這個(gè)雙鏈DNA雙螺旋構(gòu)造情況下,幾乎沒有法拉第電流被觀察到。當(dāng) L-組氨酸出現(xiàn)時(shí),反式作用的催化鏈DNA2使DNAl鏈在DNAl鏈自身的無固著的磷酸二酯處斷裂成兩部分,因此在兩DNA鏈之間的雜化消失了,允許DNA片段分離,并釋放DNA2折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu),從而產(chǎn)生明顯的法拉第電流。產(chǎn)生法拉第電流的原因是二茂鐵端基足夠靠近電極。
      基于上述的原理,本發(fā)明中所提出的利用雙鏈DNA序列自斷裂和高能指數(shù)面納米金晶體檢測(cè)L-組氨酸的方法,包括如下步驟
      第一步晶種溶液的制備把0. 6mL的剛剛配制好的濃度為0. OlM的NaBH4溶液倒入IOmL含有濃度為0. IM的CTAB和濃度為0. 5mM的HAuCl4的溶液中劇烈攪拌。溶液的顏色由黃色變?yōu)樯钭厣砻鹘痤w粒的形成。之后,晶種溶液靜置1小時(shí)以備后用。
      第二步生長(zhǎng)液的制備把0. 0729g溴化十二烷基三甲基銨O^TAB)粉末溶解在 5mL濃度為0. OlM的雙十烷基二甲基溴化銨(DDAB)溶液中配制成雙表面活性劑溶液,并且使雙表面活性劑溶液中CTAB和DDAB的摩爾比為4。在該雙表面活性劑溶液中,依次加入 5mL濃度為ImM的HAuCl4溶液,0. ImL濃度為0. OlM的AgNO3溶液,40 μ L濃度為0. 5Μ H2SO4 溶液和80 μ L濃度為0. IM的丙烯酸溶液(AA)制備出生長(zhǎng)液,該生長(zhǎng)液的ρΗ值為2.7。
      第三步取第一步中制備得到的晶種溶液0.3mL,將晶種溶液混入第二步中制備的生長(zhǎng)液中,30°C下保持10小時(shí),即得到具有高能指數(shù)面的納米金晶體,即拉長(zhǎng)二十四面體。
      制備出的納米金晶體的TEM圖如圖3所示,其中圖3 (a)-(c)給出了通過本發(fā)明提供的制備方法獲得的納米金晶體的掃描電鏡圖。如圖所示,該拉長(zhǎng)二十四面體,長(zhǎng)度大約 104士8nm,寬度大約 83士5nm。在圖 3(d)中二面角 α =131.6°、β =149.4° , γ = 152.2°分別和{140},{210}、{100}三種晶面的理論值相等,另外在圖3 (e)中,同樣的方法可以得出有8個(gè)晶面平行于W10]方向應(yīng)為{301}晶面。由以上電鏡圖可以得出該二十四面體主要高能面為{140},{210}和{301},如圖3(f)所示。
      第四步,雙鏈DNA (dsDNA)的制備在I-B緩沖溶液中配置混合溶液,混合溶液中含有1 μ M DNAlU μ M DNA2和ImM磷酸三(β -氯乙基)酯TCEP,TCEP的作用是去除雙硫鍵,以保證適配子的巰基基團(tuán)與金晶體表面更好的結(jié)合。將混合溶液放置在90°C水浴下保持5分鐘,然后自然冷卻到常溫。這一水浴加熱和自然冷卻的過程有助于適配子結(jié)構(gòu)的靈活性。使用前放入-20°C條件下保存。所述的I-B緩沖溶液為含有20mM Tris-HCl, ρΗ = 7. 41,140mM NaCl,20mM MgCl 和 20mMKCl 的溶液。
      第五步,玻碳電極表面的預(yù)處理
      (1)玻碳電極的清洗,包括(a)將玻碳電極在紗布拋光紙上分別用粒徑為1. 0 μ m、0. 3 μ m和0. 05 μ m的氧化鋁拋光粉進(jìn)行打磨;(b)將玻碳電極分別在乙醇和二次去離子水中超聲兩分鐘;(c)進(jìn)行電化學(xué)清洗,具體為玻碳電極在0. 5M的H2SO4溶液中, 在-0. 2和+1. 6V之間進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,直到獲得典型的循環(huán)伏安譜圖如圖4所示。(2)將10 μ L(濃度為5mg πιΓ1)的納米金晶體的乙醇溶液均勻滴在清洗后的玻碳電極上直至完全干燥。然后用乙醇反復(fù)清洗直至洗去納米金晶體上的表面活性劑(CTAB和 DDAB),然后用二次去離子水沖洗干凈至干燥,得到納米金晶體修飾的玻碳電極。(3)再移取第四步中制備的雙鏈DNA混合溶液20 μ L滴在由納米金晶體修飾的玻碳電極上,在室溫下保持100%濕度放置20小時(shí)后分別用Tris-HCl緩沖液(0. IM三羥甲基氨基甲烷和0. IM鹽酸的均勻混合液)和二次去離子水沖洗,用氮?dú)獯蹈?,得到雙鏈DNA修飾的玻碳電極。(4)再滴加20 μ L濃度為ImM的巰基己醇(MCH)到第(3)步中雙鏈DNA修飾的玻碳電極表面,室溫下保持半小時(shí),目的是除去修飾到玻碳電極表面多余的雙鏈DNA。然后分別用Tris-HCl緩沖液和二次去離子水沖洗,即得到玻碳電極傳感器。第六步,L-組氨酸的電化學(xué)方波檢測(cè)對(duì)于L-組氨酸的檢測(cè),將經(jīng)過第五步修飾后的玻碳電極傳感器放入2ml具有不同濃度的L-組氨酸的I-B緩沖溶液里進(jìn)行即時(shí)檢測(cè), 檢測(cè)所選用的方波掃描范圍為0-0. 8V。電化學(xué)方波檢測(cè)選用三電極體系工作電極是采用本發(fā)明方法最終修飾后的玻碳電極傳感器的圓盤玻碳電極(電極直徑2mm),參比電極是 Ag/AgCl (飽和KCl)電極,對(duì)電極是鉬絲電極。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法對(duì)信號(hào)的放大作用通過用修飾了 DNA雙鏈而未經(jīng)納米金晶體修飾的裸金電極來對(duì)比驗(yàn)證。我們利用方波伏安法來進(jìn)行檢測(cè)L-組氨酸,以得到應(yīng)用本發(fā)明的玻碳電極傳感器對(duì)L-組氨酸檢測(cè)范圍以及最低檢測(cè)限。圖5A和圖5B出示了應(yīng)用本發(fā)明的玻碳電極傳感器檢測(cè)L-組氨酸的方波圖以及方波伏安峰電流和L-組氨酸濃度的關(guān)系曲線。從圖5A可以看出,方波伏安峰電流隨著L-組氨酸濃度的增加而增大。從圖 5B看出,在0. IpM 0. ΙμΜ濃度范圍內(nèi),方波伏安峰電流和濃度的對(duì)數(shù)成良好的線性關(guān)系, 檢測(cè)限為0. IpM0為了證明具有高能指數(shù)面的納米金晶體修飾對(duì)檢測(cè)靈敏度的影響,L-組氨酸的檢測(cè)也被應(yīng)用在dsDNA/裸金電極上,從圖5C和5D看出,未經(jīng)過高能指數(shù)面納米金修飾的裸金電極對(duì)L-組氨酸的響應(yīng)范圍縮減到InM 0. 1 μ M,檢測(cè)限僅僅為InM。從圖 5A 5D的對(duì)比能很清楚的看出通過具有高能指數(shù)面修飾的納米金晶體修飾后的玻碳電極對(duì)目標(biāo)物的傳感能力大大增強(qiáng)。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的時(shí)間響應(yīng)關(guān)系通過實(shí)驗(yàn)的方法得到了驗(yàn)證。本發(fā)明制備得到的玻碳電極傳感器在檢測(cè)L-組氨酸過程中很快達(dá)到平衡,在觀秒內(nèi)觀察到98%的信號(hào)改變,在不到半分鐘內(nèi)信號(hào)達(dá)到完全飽和,如圖6A和圖6B。在實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)所制備的玻碳電極傳感器被置入含有不同濃度的L-組氨酸的I-B緩沖溶液中,每個(gè)濃度的樣品測(cè)量在30 秒內(nèi)完成。經(jīng)分析可知,上述的快速反應(yīng)的速率常數(shù)為I^bs = OJmirT1 (23°C,pH 7. 5),反應(yīng)速度快是由于的脫氧核酶的高催化性能和DNA的構(gòu)造有利的DNA 二級(jí)結(jié)構(gòu)之間的快速平衡。一般說來,速率常數(shù)k。bs和溫度的關(guān)系由Arrhenius方程式得出,速率常數(shù)k。bs的增加同溫度成線性關(guān)系,并在37°C下達(dá)到最大值。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的專一性是通過檢測(cè)另外三種性質(zhì)相似的氨基酸D_組氨酸(D-histidine),L-胱氨酸(L-cystine)和L-纈氨酸(L-valine)來證明的,這三種氨基酸的濃度均為ΙμΜ。對(duì)于本發(fā)明中修飾后的玻碳電極傳感器的檢測(cè)結(jié)果,如圖7Α,其中曲線a為背景峰,L-組氨酸濃度為0M,當(dāng)檢測(cè)濃度均為1 μ M的D-組氨酸、L-胱氨酸和 L-纈氨酸的混合物時(shí),反應(yīng)后的方波伏安曲線相對(duì)于背景峰沒有出現(xiàn)明顯的信號(hào)變化(見曲線b)。當(dāng)加入濃度為InM的L-組氨酸時(shí),方波峰電流信號(hào)明顯增強(qiáng)(見曲線C)。結(jié)果表明,用修飾后的玻碳電極傳感器對(duì)L-組氨酸的檢測(cè)具有明顯的專一性。圖7B出示了修飾后的玻碳電極傳感器檢測(cè)上述不同的氨基酸后的方波伏安峰電流相對(duì)于背景方波峰電流信號(hào)的信號(hào)變化柱狀圖,從圖7B可以看出,同背景峰電流相比,濃度為1 μ M的D-組氨酸、 L-胱氨酸和L-纈氨酸的混合物產(chǎn)生的方波峰電流改變不到5%。然而,濃度為InM的L-組氨酸產(chǎn)生的方波峰電流相對(duì)于背景方波峰電流值增加了 27%,這表明用修飾后玻碳電極傳感器對(duì)L-組氨酸進(jìn)行檢測(cè)具有明顯的專一性和手性識(shí)別性。對(duì)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法的重復(fù)性進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。采用相同的條件分別制備了四個(gè)玻碳電極傳感器,在含濃度為InM的L-組氨酸的I-B緩沖液里分別進(jìn)行4次獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。圖 8出示了 4個(gè)相同的玻碳電極傳感器對(duì)濃度為InM的L-組氨酸的檢測(cè)結(jié)果。從該圖8中我們可以看出四個(gè)玻碳電極傳感器對(duì)L-組氨酸都產(chǎn)生了可重復(fù)的方波電流信號(hào),四個(gè)結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別是2. 08%,顯示了本發(fā)明提供的檢測(cè)方法具有很好的重復(fù)性能。為了檢驗(yàn)本發(fā)明提供的檢測(cè)方法對(duì)實(shí)際樣品是否具有實(shí)用性,我們測(cè)試了一個(gè)人體生理基質(zhì)和具有不同濃度的L-組氨酸的加標(biāo)樣品,當(dāng)使用本發(fā)明制備的玻碳電極傳感器時(shí),向所在溶液添加5ηΜ,50ηΜ, 0. 5 μ Μ,和5 μ M的L-組氨酸后的回收率分別是 97. 772%,99. 608%,99. 393%和99. 574%,說明該玻碳電極傳感器有希望應(yīng)用于復(fù)雜生物樣品的分析。
      權(quán)利要求
      1.利用DNA序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體檢測(cè)L-組氨酸的方法,其特征在于如下步驟第一步晶種溶液的制備把NaBH4溶液倒入含有濃度為0. IM的CTAB和濃度為0. 5mM 的HAuCl4的溶液中劇烈攪拌,溶液的顏色由黃色變?yōu)樯钭厣?,表明金顆粒的形成,之后,晶種溶液靜置1小時(shí)以備后用;第二步生長(zhǎng)液的制備把CTAB粉末溶解在濃度為0. OlM的DDAB溶液中配制成雙表面活性劑溶液,并且使雙表面活性劑溶液中CTAB和DDAB的摩爾比為4 ;在該雙表面活性劑溶液中,依次加入濃度為ImM的HAuCl4溶液,濃度為0. OlM的AgNO3溶液,濃度為0. 5M H2SO4 溶液和濃度為0. IM的丙烯酸溶液制備出生長(zhǎng)液,該生長(zhǎng)液的pH值為2. 7 ;如果DDAB溶液的體積為V,則加入雙表面活性劑溶液中的各溶液體積分別為V、0. 02V、0. 008V和0. 016V ;第三步取第一步中制備得到的晶種溶液,將晶種溶液混入第二步中制備的生長(zhǎng)液中, 30°C下保持10小時(shí),得到具有高能指數(shù)面的納米金晶體,即拉長(zhǎng)二十四面體;第四步,雙鏈DNA的制備在I-B緩沖溶液中配置混合溶液,混合溶液中含有 1 μ MDNAlU μ M DNA2和ImM TCEP,將混合溶液放置在90°C水浴下保持5分鐘,然后自然冷卻到常溫;使用前放入-20°C條件下保存;第五步,玻碳電極表面的預(yù)處理(1)玻碳電極的清洗;(2)將濃度為5mgπιΓ1的納米金晶體的乙醇溶液均勻滴在清洗后的玻碳電極上直至完全干燥,然后用乙醇反復(fù)清洗直至洗去納米金晶體上的表面活性劑,然后用二次去離子水沖洗干凈至干燥,得到納米金晶體修飾的玻碳電極;(3)再移取第四步中制備的雙鏈DNA混合溶液滴在由納米金晶體修飾的玻碳電極上, 在室溫下保持100%濕度放置20小時(shí)后,分別用Tris-HCl緩沖液和二次去離子水沖洗,用氮?dú)獯蹈?,得到雙鏈DNA修飾的玻碳電極;(4)再滴加濃度為ImM的巰基己醇到第(3)步中雙鏈DNA修飾的玻碳電極表面,室溫下保持半小時(shí),然后分別用Tris-HCl緩沖液和二次去離子水沖洗,即得到最終的修飾后的玻碳電極傳感器;第六步,L-組氨酸的電化學(xué)方波檢測(cè)對(duì)于L-組氨酸的檢測(cè),將經(jīng)過第五步修飾后的玻碳電極傳感器放入具有不同濃度的L-組氨酸的I-B緩沖溶液里進(jìn)行即時(shí)檢測(cè),檢測(cè)所選用的方波掃描范圍為0-0. 8V。
      2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用DNA序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體檢測(cè) L-組氨酸的方法,其特征在于所述的I-B緩沖溶液為含有20mM Tris-HCl, pH = 7. 41, 140mMNaCl,20mM MgCl 和 20mMKCl 的溶液。
      3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用DNA序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體檢測(cè)L-組氨酸的方法,其特征在于所述的玻碳電極的清洗步驟為(a)將玻碳電極在紗布拋光紙上分別用粒徑為1. 0 μ m、0. 3 μ m和0. 05 μ m的氧化鋁拋光粉進(jìn)行打磨;(b)將玻碳電極分別在乙醇和二次去離子水中超聲兩分鐘;(c)進(jìn)行電化學(xué)清洗,具體為玻碳電極在0. 5M的 H2SO4溶液中,在-0. 2和+1. 6V之間進(jìn)行循環(huán)伏安掃描,直到獲得典型的循環(huán)伏安譜圖。
      4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用DNA序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體檢測(cè)L-組氨酸的方法,其特征在于電化學(xué)方波檢測(cè)選用三電極體系工作電極是采用玻碳電極傳感器的圓盤玻碳電極,電極直徑2mm,參比電極是Ag/AgCl電極,對(duì)電極是鉬絲電極。
      5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用DNA序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體檢測(cè)L-組氨酸的方法,其特征在于第一步中NaBH4溶液的濃度為0. OlM0
      全文摘要
      本發(fā)明公開了一種利用DNA序列自斷裂和高能指數(shù)面的納米金晶體檢測(cè)L-組氨酸的方法,該方法利用制備的納米金晶體和雙鏈DNA對(duì)預(yù)處理的玻碳電極表面進(jìn)行修飾,得到玻碳電極傳感器,采用該玻碳電極傳感器對(duì)L-組氨酸進(jìn)行檢測(cè),該檢測(cè)方法的最低檢測(cè)限可以達(dá)到0.1pM,另外電流信號(hào)0.1pM~0.1μM的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系,為高靈敏度定量測(cè)量提供了依據(jù)。同時(shí),該種檢測(cè)方法具有檢測(cè)速度快,重復(fù)性好,特異性強(qiáng),不受類似氨基酸的影響,同時(shí)可以手性識(shí)別組氨酸的優(yōu)點(diǎn)。
      文檔編號(hào)G01N27/48GK102495125SQ201110404258
      公開日2012年6月13日 申請(qǐng)日期2011年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月7日
      發(fā)明者李麗東 申請(qǐng)人:北京航空航天大學(xué)
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