專利名稱：一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑殘留的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全-獸藥殘留領(lǐng)域，具體是一種通過(guò)加壓毛細(xì)管電色譜檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑殘留的方法。
背景技術(shù)：
氯霉素、甲砜霉素同屬酰胺醇類抗生素，具有廣譜抗菌能力，在水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)上常被用于防治魚、蝦類細(xì)菌性傳染??；甲硝唑則用于治療幾種滴蟲感染。氯霉素、甲砜霉素能抑制骨髓造血功能，引起再生障礙性貧血等毒副作用，甲硝唑可以致癌和致遺傳變異等毒副作用，許多國(guó)家禁止在動(dòng)物飼料和治療中使用，并規(guī)定動(dòng)物性食品中氯霉素不得檢出。食品中氯霉素類藥物的殘留檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法等。液相色譜法的靈敏度較低，且分析時(shí)間較長(zhǎng)，氣質(zhì)、液質(zhì)聯(lián)用儀雖然檢測(cè)靈敏度和分辨率很高，但一般實(shí)驗(yàn)室很難配置這樣的儀器。加壓毛細(xì)管電色譜(pCEC)是近幾年來(lái)興起的一種微分離技術(shù)，它結(jié)合了電泳的高效性和高效液相色譜的保留機(jī)制，通過(guò)在填有HPLC填料的毛細(xì)管色譜柱的兩端施加高壓，提高了樣品的分離能力和效率，使以前需很長(zhǎng)時(shí)間才能出現(xiàn)的峰現(xiàn)在只需很短時(shí)間就可出現(xiàn)，并且試劑和樣品的消耗量減少，近幾年開始也用于獸藥殘留的分離。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑殘留的方法，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)。本發(fā)明解決上述技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案為一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑殘留的方法，其特征在于包括以下步驟I)樣品制備將對(duì)蝦去頭后肌肉組織樣品剪碎后均質(zhì)，冷凍保存；2)樣品預(yù)處理將樣品經(jīng)乙酸乙酯離心提取，正己烷脫脂旋轉(zhuǎn)蒸干后，用乙腈溶解殘?jiān)?，再?jīng)O. 20 O. 24 μ m濾膜過(guò)濾后供毛細(xì)管電色譜測(cè)定用；3)配制氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液；4)采用加壓毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析以反相鍵和C18為填料的毛細(xì)管電色譜柱作為檢測(cè)柱；流動(dòng)相采用11 13mmol/L，pH = 4 6的磷酸鹽氫二胺緩沖液與乙腈的混合液，其體積比為90 70 10 30;所加電壓為-3 -5kv，柱壓為9.6 9. 8MP，柱溫為常溫，流動(dòng)相的流速40 60 μ L/min ;進(jìn)樣量0. 9 I. I μ L的工藝條件下，用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)275nm處進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；5)將樣品經(jīng)檢測(cè)分析后根據(jù)其保留時(shí)間進(jìn)行定量分析，利用外標(biāo)法根據(jù)其峰面積進(jìn)行定量分析。作為改進(jìn)，所述步驟2)中的乙酸乙酯離心提取的具體過(guò)程為準(zhǔn)確稱取2±0.01g均質(zhì)樣品置于50mL離心管中，加入乙酸乙酯8 12mL,用潤(rùn)旋混合器充分混勻4 6min,、3000 5000r/min離心8 12min,收集上清液,再向原離心管中加入8 12mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次上清液；加入14 16mL正己烷脫脂兩次后，溶液于35 45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈溶解后過(guò)膜上機(jī)使用。作為改進(jìn)，所述氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為分別稱取氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品10. 0mg±0. Olg，用50%甲醇水溶液溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。作為優(yōu)選，所述流動(dòng)相采用12mmol/L，pH = 5的磷酸鹽氫二胺緩沖液與乙腈的混合液，所述流動(dòng)相的配制過(guò)程為取乙腈、重蒸水、120mmol/L磷酸鹽氫二胺按體積比為20 : 70 : 10的比列配成流動(dòng)相，超聲波脫氣20 40min。再改進(jìn)，所述氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)前需用流動(dòng)相稀釋成O. I 5 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
再優(yōu)選，所述步驟4)的所述電壓為_4kv，柱壓為9. 7MP，柱溫為常溫，流動(dòng)相的流速50 μ L/min ;進(jìn)樣量:I. O μ L。最后。所述步驟4)的毛細(xì)管電色譜柱選用規(guī)格EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑100 μ m,有效柱長(zhǎng)20cm，填料粒徑3 μ m ODS柱。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于本發(fā)明通過(guò)加壓毛細(xì)管電色譜對(duì)對(duì)蝦中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑殘留的進(jìn)行檢測(cè)分析，可以有效解決基質(zhì)中大部分干擾物質(zhì)的影響，具有快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的特點(diǎn)，并且有機(jī)試劑消耗少，檢測(cè)成本低，不僅可用于對(duì)蝦的檢測(cè)，還可應(yīng)用于其他水產(chǎn)品，滿足日常檢測(cè)氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑藥物的需求。


圖I是加-4kV電壓時(shí)氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑藥物標(biāo)準(zhǔn)品的毛細(xì)管電色譜圖；圖2是不加電壓的uHPLC圖；圖3是市售魚肉樣品的檢測(cè)電色譜圖。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。一種通過(guò)加壓毛細(xì)管電色譜檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑殘留的方法，步驟為I、樣品制備將對(duì)蝦去頭后的肌肉組織樣品，用剪刀剪碎后均質(zhì)，冷凍保存；2、樣品預(yù)處理將樣品解凍，準(zhǔn)確稱取2±0. 01g(精確至O. Olg)均質(zhì)樣品置于50mL離心管中，力口入乙酸乙酯IOmL,用潤(rùn)旋混合器充分混勻5min,4000r/min離心IOmin,收集上清液,再向原離心管中加入IOmL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次上清液。加入15mL正己烷脫脂兩次后，溶液于40 V旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈溶解后過(guò)膜上機(jī)使用。3、配制氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液分別稱取氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品10. 0mg±0.01g，用50%甲醇水溶液溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，避光冷藏保存。臨用前用流動(dòng)相稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液。4、流動(dòng)相配制及色譜條件
取乙腈、重蒸水、120mmol/L磷酸氫二銨溶液按體積比為20 70 10的比列配成流動(dòng)相，超聲波脫氣30min后備用。所用色譜條件(I)色譜柱選用規(guī)格EP-100-20/45-3-C18，內(nèi)徑100 μ m，有效柱長(zhǎng)20cm，填料粒徑3 μ mODS 柱；(2)紫外檢測(cè)波長(zhǎng)275nm ；(3)流動(dòng)相乙腈磷酸氫二銨溶液(12mmol/L, pH 5) = 20 80 (V/V)，(4)流速50 μ L/min ;進(jìn)樣量1 μ L ；(5)柱壓電壓_4kV，柱壓為9· 7ΜΡ，柱溫為常溫。5、工作曲線和檢出限用流動(dòng)相稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液為O. I 5 μ g/mL混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按試驗(yàn)條件進(jìn)行檢測(cè)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。試驗(yàn)表明，氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑在O. I 5μ g/mL范圍內(nèi)線性良好，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限列于表I。表I標(biāo)準(zhǔn)工作曲線與檢出限
權(quán)利要求
1.一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑殘留的方法，其特征在于包括以下步驟 1)樣品制備將對(duì)蝦去頭后肌肉組織樣品剪碎后均質(zhì)，冷凍保存； 2)樣品預(yù)處理將樣品經(jīng)乙酸乙酯離心提取，正己烷脫脂旋轉(zhuǎn)蒸干后，用乙腈溶解殘?jiān)?，再?jīng)O. 20 O. 24 μ m濾膜過(guò)濾后供毛細(xì)管電色譜測(cè)定用； 3)配制氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液； 4)采用加壓毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析以反相鍵和C18為填料的毛細(xì)管電色譜柱作為檢測(cè)柱；流動(dòng)相采用11 13mmol/L, pH = 4 6的磷酸鹽氫二胺緩沖液與乙腈的混合液,其體積比為90 70 10 30 ;在所加電壓為-3 -5kv，柱壓為9.6 9. 8MP，柱溫為常溫，流動(dòng)相的流速40 60 μ L/min ;進(jìn)樣量0. 9 I. I μ L的工藝條件下，用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)275nm處進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線； 5)將樣品經(jīng)檢測(cè)分析后根據(jù)其保留時(shí)間進(jìn)行定量分析，利用外標(biāo)法根據(jù)其峰面積進(jìn)行定量分析。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟2)具體過(guò)程為準(zhǔn)確稱取2±0. Olg均質(zhì)樣品置于50mL離心管中，加入乙腈8 12mL,用潤(rùn)旋混合器充分混勻4 6min, 3000 5000r/min離心8 12min,收集上清液,再向原離心管中加入8 12mL乙酸乙酯重復(fù)提取一次，合并兩次上清液；加入14 16mL正己烷脫脂兩次后，溶液于35 45°C旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用乙腈溶解后過(guò)膜上機(jī)使用。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制為分別稱取氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)品10. 0mg±0. Olg,用50%甲醇水溶液溶解并定容于IOOml容量瓶中，配成質(zhì)量濃度為100mg/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述流動(dòng)相采用12mmol/L,pH = 5的磷酸鹽氫二胺緩沖液與乙腈的混合液，所述流動(dòng)相的配制過(guò)程為取乙腈、重蒸水、120mmol/L磷酸鹽氫二胺按體積比為20 70 10的比列配成流動(dòng)相，超聲波脫氣20 40min。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測(cè)前需用流動(dòng)相稀釋成O. I 5 μ g/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟4)的所述電壓為_4kv，柱壓為9.7MP，柱溫為常溫，流動(dòng)相的流速50 μ L/min ;進(jìn)樣量1.0yLo
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于所述步驟4)的毛細(xì)管電色譜柱選用規(guī)格EP-100-20/45-3-C18,內(nèi)徑 100 μ m,有效柱長(zhǎng) 20cm，填料粒徑 3 μ m ODS 柱。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種加壓毛細(xì)管電色譜儀檢測(cè)對(duì)蝦中氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑殘留的方法，步驟樣品制備；配制氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑標(biāo)準(zhǔn)溶液；采用加壓毛細(xì)管電色譜進(jìn)行分析以反相鍵和C18為填料的毛細(xì)管電色譜柱作為檢測(cè)柱；流動(dòng)相采用11～13mmol/L，pH＝4～6的磷酸鹽氫二胺緩沖液與乙腈的混合液，其體積比為90～70∶10～30；所加電壓為-3～-5kv，柱壓為9.6～9.8MP，柱溫為常溫，流動(dòng)相的流速40～60μL/min；進(jìn)樣量0.9～1.1μL的工藝條件下，用紫外檢測(cè)器在波長(zhǎng)275nm處進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；將樣品經(jīng)檢測(cè)分析后根據(jù)其保留時(shí)間進(jìn)行定量分析，利用外標(biāo)法根據(jù)其峰面積進(jìn)行定量分析。本發(fā)明高效、準(zhǔn)確，有機(jī)試劑消耗少，有較高的靈敏度，可以滿足日常檢測(cè)氯霉素、甲砜霉素、甲硝唑藥物的需求。
文檔編號(hào)G01N30/88GK102645501SQ20111041406
公開日2012年8月22日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者劉在美, 曹國(guó)洲, 朱曉艷, 楊文潮, 肖道清, 董潔瑩, 鄭琳, 陳少鴻, 陳建國(guó) 申請(qǐng)人:寧波檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院