專利名稱：一種檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種提取重金屬的方法，特別涉及一種檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法與應(yīng)用。該方法是一種簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
近年來，我國(guó)的經(jīng)濟(jì)有了飛速的發(fā)展，但與此同時(shí)所引發(fā)的環(huán)境污染也愈加明顯， 特別是工業(yè)和加工制造業(yè)帶來的大氣、水體、土壤的重金屬污染。水體、土壤及農(nóng)田的重金屬污染是造成蔬菜、水果及糧食等農(nóng)產(chǎn)品中重金屬含量超標(biāo)的最主要原因。
重金屬銅、鉛、鎘主要是通過食物和呼吸進(jìn)入人體。雖然農(nóng)產(chǎn)品中重金屬一般情況下不會(huì)造成人們急性中毒，但重金屬通過食物鏈在人體內(nèi)蓄積，進(jìn)而影響人體健康。面對(duì)越來越嚴(yán)峻的環(huán)境污染所引發(fā)的食品，特別是農(nóng)產(chǎn)品的安全問題，對(duì)人民群眾的健康產(chǎn)生了不利影響以及潛在的風(fēng)險(xiǎn)。建立一種快速、簡(jiǎn)捷、高效和安全的食品中重金屬的檢測(cè)技術(shù)迫在眉睫。
近年來，免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)已廣泛應(yīng)用于毒素、殺蟲劑、炸藥等領(lǐng)域的檢測(cè)。隨著免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)在重金屬檢測(cè)上的日臻成熟，ELISA試劑盒已成為了一種快速、簡(jiǎn)便和可靠的檢測(cè)手段，其應(yīng)用解決了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)需要大型分析儀器、儀器價(jià)格昂貴、操作繁瑣、 要求檢測(cè)人員具備一定的專業(yè)知識(shí)等弊端。它可以代替?zhèn)鹘y(tǒng)檢測(cè)技術(shù)適應(yīng)企業(yè)質(zhì)控和產(chǎn)品檢驗(yàn)、產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)抽查及產(chǎn)品進(jìn)出口的快速通關(guān)的要求。
本課題組已經(jīng)成功制得了重金屬鉛的酶聯(lián)免疫試劑盒，可以檢測(cè)環(huán)境水樣中的鉛離子。已將其申請(qǐng)專利，申請(qǐng)?zhí)枮椤?01010539824. 8”、申請(qǐng)名稱為“一種快速檢測(cè)重金屬鉛離子的免疫學(xué)方法與試劑盒”。鎘離子和鉛離子的膠體金試劑條已制備成功，可以成功檢測(cè)液態(tài)的重金屬離子。已有的研究成果表明，ELISA重金屬檢測(cè)方法只能檢測(cè)液態(tài)離子態(tài)的重金屬，無法檢測(cè)結(jié)合態(tài)的重金屬。因此，要將ELISA重金屬檢測(cè)方法高效、快速地應(yīng)用于實(shí)際工作中，還需解決重要但繁瑣的樣品前處理技術(shù)的問題。目前，農(nóng)產(chǎn)品及食品中重金屬的前處理技術(shù)有濕法消化法、干法灰化法和微波消解法，均是破壞有機(jī)質(zhì)，將樣品轉(zhuǎn)變?yōu)橐簯B(tài)澄清溶液進(jìn)行測(cè)定。這些前處理技術(shù)雖然能準(zhǔn)確提取樣品中的重金屬，但費(fèi)時(shí)、費(fèi)力且產(chǎn)生大量有害氣體，獲得的消解液具有強(qiáng)酸性，而ELISA中的酶免反應(yīng)需要在一個(gè)溫和的環(huán)境(中性至偏弱堿性)下進(jìn)行，所以傳統(tǒng)的樣品前處理方法得到的消解液無法直接應(yīng)用于 ELISA檢測(cè)重金屬。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法。
本發(fā)明的另一目的在于提供所述檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)一種檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，包括以下步驟
(I)樣品的前處理將碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品洗凈、勻漿，加入稀酸浸提；接著去除不溶性物質(zhì)，得到含有重金屬離子的待測(cè)樣品溶液；
(2)將待測(cè)樣品溶液直接用于酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)(ELISA)，得到待測(cè)樣品中重金屬含量。
步驟(I)中所述的碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品為蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品、水果類農(nóng)產(chǎn)品或糧食類農(nóng)產(chǎn)品；
所述的蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)選為菜心、胡蘿卜及南瓜；
所述的水果類農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)選為蘋果、葡萄及香蕉；
所述的糧食類農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)選為大米、小麥及糙米；
步驟⑴中所述的稀酸指的是濃度小于6mol/L的酸；優(yōu)選濃度為I 4mol/L的酸溶液；更優(yōu)選為2 4mol/L ；
所述的酸溶液優(yōu)選為HCl溶液、HNO3溶液或H2SO4溶液；
步驟⑴中所述的浸提的條件優(yōu)選為4 70°C浸提10 20min ；
所述的去除不溶性物質(zhì)的方式優(yōu)選為離心；
所述的離心的條件優(yōu)選為4000 8000rpm離心15min ;更優(yōu)選為10000 13000rpm 離心 IOmin ；
步驟(I)中所述的重金屬離子優(yōu)選為銅離子、鉛離子或鎘離子；
步驟⑵中所述的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)優(yōu)選為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法；
所述的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的過程如下
①包被用碳酸鹽緩沖液溶解重金屬-螯合劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物，將其包被于酶標(biāo)板微孔；
②洗板甩干板孔中液體，然后向孔中加入PBS-T洗滌液，放置，再輕輕晃動(dòng)，棄去洗液，拍干，重復(fù)洗板三次；
③封閉用含有脫脂奶粉的PBST緩沖液封閉；如前法洗板三次；
④加樣在ELISA酶標(biāo)板孔中依次加入重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)品以及前述的含有重金屬離子的待測(cè)樣品溶液，再加入重金屬離子抗體工作液，用蓋板膜封板，孵育；取出酶標(biāo)板，如如法洗板二次；
⑤加酶標(biāo)記二抗加入HRP-羊抗鼠IgG抗體工作液，孵育；取出酶標(biāo)板，洗板五次；
⑥加顯色液加入TMB顯色液，輕輕振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)；
⑦終止反應(yīng)加入H2SO4終止反應(yīng)；于酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定每孔吸光度值；
⑧結(jié)果判定所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(BO)再乘以100%，即百分吸光度值；
百分吸光度值(％) = B/B0X100% ；
式中B_標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值；
B0-0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值；
以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以重金屬標(biāo)準(zhǔn)品濃度(ng/ml)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中重金屬實(shí)際濃度。
步驟①中所述的碳酸鹽緩沖液的濃度為0. 05M，pH值為9. 6 ；
步驟①中所述的重金屬-螯合劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物優(yōu)選為Cu2+-DTPA-OVA、 Pb2+-DTPA-OVA 或 Cd2+-DTPA-OVA ；
所述的重金屬-螯合劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物的用量?jī)?yōu)選為96孔板中每孔使用16ng ；
步驟①中所述的包被的條件優(yōu)選為于4°C包被16h ；
步驟②中所述的PBST是含有體積百分比0. 05% Tween-20的PBS溶液；PBS的濃度為 0.015M，pH 值為 7. 4 ；
步驟②中所述的放置的時(shí)間優(yōu)選為2 4min ；
步驟③中所述的含有脫脂奶粉的PBST緩沖液中脫脂奶粉的濃度為0. 05g/ml ； PBST是含有體積百分比0. 05% Tween-20的PBS溶液；PBS的濃度為0. 015M, pH值為7. 4 ；
步驟③中所述的封閉的條件優(yōu)選為37°C反應(yīng)Ih ；
步驟④中所述的孵育的條件優(yōu)選為37°C孵育Ih ；
步驟⑤中所述的孵育的條件優(yōu)選為37°C孵育30min。
前述檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法在碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品的重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用。
本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有以下的優(yōu)點(diǎn)及效果
(I)本發(fā)明所述的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法中的前處理步驟可以用于蔬菜類、水果類、糧食類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬離子銅、鉛、鎘的浸提，不僅加快了重金屬從樣品中浸提出來的時(shí)間，同時(shí)也減少了傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)帶來的環(huán)境污染。該步驟的反應(yīng)條件溫和。對(duì)于菜心、胡蘿卜和蘋果來說，該步驟完全可以取代傳統(tǒng)的樣品前處理方法進(jìn)行重金屬的浸提。
(2)本發(fā)明所提供的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)快速、高效及便捷的檢測(cè)。


圖I是本發(fā)明與GF-AAS聯(lián)用前處理步驟兩種方法分別測(cè)定碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬銅的比較結(jié)果圖。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
實(shí)施例I
(I)樣品的制備
先用自來水將樣品(蔬菜、水果)沖洗干凈，再用超純水漂洗3次，擦干水分。用食品勻漿機(jī)進(jìn)行勻漿，儲(chǔ)于250ml的燒杯中，_4°C下冷凍保存?zhèn)溆谩?br> 糧食樣品則直接干磨至粉末狀，儲(chǔ)于密封盒內(nèi)常溫下保存?zhèn)溆谩?br> (2)樣品的前處理(稀酸浸提樣品)
①蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品
A、稱取步驟(I)中制備的菜心2. 0g，將其置于IOml離心管中，加入2. OM的HCl 溶液2. Oml,常溫下反應(yīng)20min,于4000rpm下離心15min,取上清液置于2ml的離心管中， 13000rpm下離心IOmin,取上清液并調(diào)節(jié)pH值至6. 0 8. 0,定容至4ml, GF-AAS (石墨爐原子分光光度計(jì))測(cè)定其重金屬銅、鉛、鎘的含量，結(jié)果與國(guó)標(biāo)法樣品前處理方法(前處理方法為微波消解法,可參考 GB/T5009. 13-1996,GB/T 5009. 15-2003 及 GB/T5009. 12-2010) 的測(cè)定結(jié)果的比值依次為86. 95%,72. 39%,89. 78%。
石墨爐原子分光光度計(jì)使用C型熱解石墨管，光溫度控制加熱方式，偏振塞曼法對(duì)背景信號(hào)校正。儀器的主要參數(shù)和工作條件分別見表I和2。
表I儀器工作參數(shù)
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，其特征在于包括以下步驟(1)樣品的前處理將碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品洗凈、勻漿，加入稀酸浸提；接著去除不溶性物質(zhì)，得到含有重金屬離子的待測(cè)樣品溶液；(2)將待測(cè)樣品溶液直接用于酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)，得到待測(cè)樣品中重金屬含量；所述的碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品為蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品、水果類農(nóng)產(chǎn)品或糧食類農(nóng)產(chǎn)品；所述的稀酸指的是濃度小于6mol/L的酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，其特征在于所述的蔬菜類農(nóng)產(chǎn)品為菜心、胡蘿卜及南瓜；所述的水果類農(nóng)產(chǎn)品為蘋果、葡萄及香蕉；所述的糧食類農(nóng)產(chǎn)品為大米、小麥及糙米。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，其特征在于所述的稀酸指的是濃度為I 4mol/L的酸溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，其特征在于所述的酸溶液為HCl溶液、HNO3溶液或H2SO4溶液。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，其特征在于所述的浸提的條件為4 70°C浸提10 20min ；所述的去除不溶性物質(zhì)的方式為離心；所述的重金屬離子為銅離子、鉛離子或鎘離子。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，其特征在于所述的離心的條件為4000 8000rpm離心15min。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，其特征在于所述的酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)為間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，其特征在于所述的間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)方法的過程如下①包被用碳酸鹽緩沖液溶解重金屬-螯合劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物，將其包被于酶標(biāo)板微孔；②洗板甩干板孔中液體，然后向孔中加入PBS-T洗滌液，放置，再輕輕晃動(dòng)，棄去洗液，拍干，重復(fù)洗板三次；③封閉用含有脫脂奶粉的PBST緩沖液封閉；如前法洗板三次；④加樣在ELISA酶標(biāo)板孔中依次加入重金屬離子標(biāo)準(zhǔn)品以及前述的含有重金屬離子的待測(cè)樣品溶液，再加入重金屬離子抗體工作液，用蓋板膜封板，孵育；取出酶標(biāo)板，如前法洗板二次；⑤加酶標(biāo)記二抗加入HRP-羊抗鼠IgG抗體工作液，孵育；取出酶標(biāo)板，洗板五次；⑥加顯色液加入TMB顯色液，輕輕振蕩混勻，室溫避光反應(yīng)；⑦終止反應(yīng)加入H2SO4終止反應(yīng)；于酶標(biāo)儀450nm處測(cè)定每孔吸光度值；⑧結(jié)果判定所獲得的每個(gè)濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣本吸光度值的平均值除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值再乘以100%，即百分吸光度值；百分吸光度值(％ ) = B/B0X100% ；式中B-標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值；B0-0ng/ml標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值；以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以重金屬標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中重金屬實(shí)際濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法，其特征在于步驟①中所述的碳酸鹽緩沖液的濃度為0. 05M，pH值為9. 6 ；步驟①中所述的重金屬-螯合劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物為Cu2+-DTPA-OVA、Pb2+-DTPA-OVA或 Cd2+-DTPA-OVA ；所述的重金屬-螯合劑-蛋白質(zhì)復(fù)合物的用量為96孔板中每孔使用16ng ；步驟①中所述的包被的條件為于4°C包被16h ；步驟②中所述的PBST是含有體積百分比0. 05% Tween-20的PBS溶液；PBS的濃度為 0. 015M, pH 值為 7. 4 ；步驟②中所述的放置的時(shí)間為2 4min ；步驟③中所述的含有脫脂奶粉的PBST緩沖液中脫脂奶粉的濃度為0. 05g/ml ；PBST是含有體積百分比0. 05% Tween-20的PBS溶液；PBS的濃度為0. 015M, pH值為7. 4 ；步驟③中所述的封閉的條件為37V反應(yīng)Ih ；步驟④中所述的孵育的條件為37°C孵育Ih ；步驟⑤中所述的孵育的條件為37°C孵育30min。
10.權(quán)利要求I 9所述檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法在碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品重金屬檢測(cè)中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬的方法與應(yīng)用。本發(fā)明所述的方法具體如下將碳水化合物類農(nóng)產(chǎn)品勻漿，加入稀酸浸提；接著去除不溶性物質(zhì)，離心取上清液得到含有重金屬離子的溶液；將待測(cè)樣品溶液直接用于酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)，得到待測(cè)樣品中重金屬含量。本發(fā)明所述的方法可以用于蔬菜、水果及糧食類農(nóng)產(chǎn)品中重金屬離子銅、鉛、鎘的浸提，不僅加快了重金屬從樣品中浸提出來的提取時(shí)間，同時(shí)也減少了傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)帶來的環(huán)境污染。該方法的反應(yīng)條件溫和，實(shí)現(xiàn)農(nóng)產(chǎn)品的現(xiàn)場(chǎng)快速、高效及便捷的檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102539742SQ20111041683
公開日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月13日
發(fā)明者唐勇, 李支微, 江天久, 江濤, 鄒軍輝 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)