專利名稱：：相對(duì)定量分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種分析方法，具體而言，本發(fā)明涉及一種相對(duì)定量分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的方法。
背景技術(shù)：
：隨著2000年6月國(guó)際人類基因組計(jì)劃的完成，人類開(kāi)始從基因組時(shí)代步入后基因組時(shí)代，在后基因組時(shí)代，生命科學(xué)的主要研究對(duì)象是功能基因組學(xué)，基因的功能是靠其功能的執(zhí)行者-蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)施的，因而對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)量、定位、修飾狀態(tài)以及蛋白質(zhì)之間相互作用的研究成為后基因組時(shí)代的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。在生命體內(nèi)，蛋白質(zhì)在發(fā)揮功能之前需要經(jīng)過(guò)基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯、翻譯后修飾過(guò)程，并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞或組織內(nèi)特定的部位發(fā)揮功能。大多數(shù)蛋白質(zhì)在發(fā)生翻譯后修飾之前是沒(méi)有活性的，也就是說(shuō)，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾對(duì)于執(zhí)行蛋白質(zhì)特定的功能是極其重要的，它使特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜、功能更加完備、調(diào)控機(jī)制也更加精細(xì)。目前在真核細(xì)胞中存在20多種翻譯后修飾的形式，比較常見(jiàn)的有磷酸化修飾、糖基化修飾、乙?；揎?、甲基化修飾等。磷酸化修飾是一種廣泛存在于生命體內(nèi)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，細(xì)胞內(nèi)許多具有關(guān)鍵功能的蛋白質(zhì)都會(huì)發(fā)生磷酸化修飾，它參與和調(diào)控生物體內(nèi)的許多生命活動(dòng)。在真核細(xì)胞內(nèi)，磷酸化修飾主要發(fā)生在絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸等氨基酸殘基上，人類蛋白質(zhì)組中含有10萬(wàn)多個(gè)潛在的磷酸化位點(diǎn)，并且以不同磷酸化形式的混合物存在，對(duì)細(xì)胞內(nèi)的各種活性調(diào)控均發(fā)揮著重要的作用。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)的飛速發(fā)展，對(duì)蛋白質(zhì)磷酸化的研究越來(lái)越受到廣泛的重視。由于磷酸化蛋白質(zhì)是各種磷酸化形式的復(fù)合物，而且是動(dòng)態(tài)變化的，對(duì)磷酸化蛋白質(zhì)組的定量研究突顯出尤為重要的意義。目前，采用相對(duì)定量蛋白質(zhì)磷酸化修飾的方法來(lái)表征蛋白質(zhì)磷酸化水平的變化，一直以來(lái)，蛋白質(zhì)組學(xué)面臨的一個(gè)重要任務(wù)就是不同樣本中蛋白質(zhì)的相對(duì)定量問(wèn)題。具體而言，相對(duì)定量蛋白質(zhì)磷酸化修飾方法是一種比較不同條件下蛋白質(zhì)各個(gè)修飾位點(diǎn)上磷酸化水平的相對(duì)差異的方法。定量分析的前提是檢測(cè)蛋白質(zhì)的磷酸化，所依賴的常規(guī)技術(shù)是32P放射性同位素標(biāo)記法和磷酸化抗體的免疫印跡技術(shù)。檢測(cè)磷酸化蛋白最經(jīng)典的生化方法是32P放射性標(biāo)記法，可以對(duì)活體細(xì)胞或者純化好的蛋白質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記。以標(biāo)記活細(xì)胞為例，具體過(guò)程為:培養(yǎng)待標(biāo)記的細(xì)胞至適當(dāng)?shù)纳L(zhǎng)期，在生長(zhǎng)旺盛的細(xì)胞中磷酸鹽的轉(zhuǎn)運(yùn)達(dá)到最高峰，此時(shí)用不含磷酸鹽標(biāo)記的培養(yǎng)液(如DMEM)替換原來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)液，并加入32P標(biāo)記的磷酸鹽共培養(yǎng)，使細(xì)胞ATP庫(kù)與32P平衡，蛋白激酶利用被放射性標(biāo)記的ATP使底物磷酸化，而后裂解細(xì)胞提取蛋白質(zhì)，隨后進(jìn)行凝膠電泳分離蛋白質(zhì)混合物，使用32P的放射自顯影信號(hào)檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)。磷酸化抗體的免疫印跡技術(shù)是使用抗磷酸化蛋白的抗體特異性得識(shí)別電泳凝膠上的蛋白條帶，并通過(guò)顯色反應(yīng)來(lái)檢測(cè)與抗體結(jié)合的磷酸化蛋白。目前，抗酪氨酸磷酸化與抗絲氨酸/蘇氨酸磷酸化的抗體(廣譜性抗體)是應(yīng)用較廣泛的抗體，理論上它們能夠識(shí)別和結(jié)合多種蛋白質(zhì)上帶磷酸根的特定氨基酸殘基。對(duì)于組成非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)組樣品(例如全細(xì)胞的蛋白提取液)，通常先使用針對(duì)目標(biāo)蛋白質(zhì)的抗體首先對(duì)該蛋白進(jìn)行免疫沉淀，而后使用抗磷酸化蛋白的抗體檢測(cè)目標(biāo)蛋白上的磷酸化信號(hào)。某些情況下，也可使用針對(duì)特定蛋白質(zhì)磷酸化基團(tuán)制作的抗體來(lái)檢測(cè)該蛋白的磷酸化信號(hào)。磷酸化抗體產(chǎn)生的信號(hào)的強(qiáng)弱反映出目標(biāo)蛋白質(zhì)的磷酸化水平的高低。但32P放射性同位素標(biāo)記法和磷酸化抗體的免疫印跡技術(shù)多數(shù)情況下只能檢測(cè)蛋白質(zhì)整體的磷酸化水平，無(wú)法分辨修飾的位點(diǎn)，也就難以對(duì)每個(gè)位點(diǎn)的修飾水平加以定量。磷酸化抗體的免疫印跡技術(shù)的缺點(diǎn)如下:首先，檢測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化的廣譜性抗體的選擇性很低，無(wú)法區(qū)分是何種蛋白質(zhì)帶有修飾，因此只能用于檢測(cè)純化或富集后的單一蛋白質(zhì)的磷酸化，難以直接分析組成復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物；其次，廣譜性的抗體檢測(cè)的是蛋白質(zhì)整體的磷酸化水平，難以辨別不同位點(diǎn)的修飾差異，再次，這類廣譜性的抗體親和力也較弱，導(dǎo)致磷酸化比例低的蛋白無(wú)法被檢測(cè)到。因此，免疫印跡只可用于半定量分析，定量的準(zhǔn)確性和動(dòng)態(tài)范圍都很有限。32P放射性同位素標(biāo)記法的大部分缺點(diǎn)與免疫印跡是重合的，例如選擇性低，無(wú)法檢測(cè)蛋白質(zhì)上不同位點(diǎn)的磷酸化水平，定量的準(zhǔn)確性和動(dòng)態(tài)范圍都有限等。另外，放射自顯影的實(shí)驗(yàn)需要使用專門的防輻射設(shè)備，使得實(shí)驗(yàn)成本大幅度增加，操作的復(fù)雜性增高。其次，對(duì)某些磷酸轉(zhuǎn)換速率較低的磷酸化蛋白質(zhì)，只能滲入少量的放射性磷酸鹽，有可能檢測(cè)不到。最后，不同蛋白質(zhì)上的氨基酸其磷酸化和去磷酸化的代謝速率有差異，所以摻入32P磷酸鹽的速率也是不一樣的，從而給定量比較引入誤差。目前用于鑒定蛋白質(zhì)磷酸化的最有效的技術(shù)是質(zhì)譜方法，該方法通常采用依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜分析(data-dependentMS/MS)對(duì)蛋白質(zhì)的酶解片段進(jìn)行序列解析并鑒定帶有修飾的氨基酸殘基。將該方法與穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)(isotope-labeling)相結(jié)合即可對(duì)不同條件下的蛋白質(zhì)組的定量變化進(jìn)行精細(xì)的分析(MichelaTomaiuoloa,GennaroVecchione.Stable-1sotopedilutionLC-ES1-MS/MStechniquesforthequantitativeoftotalhomocysteineinhumanplasma.JournalofChromatographyB2009，3292-3299.)。目前，在以液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)系統(tǒng)為基礎(chǔ)的技術(shù)流程中，最常用的定量技術(shù)是采用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的方法使兩個(gè)樣本中的同一蛋白質(zhì)分別帶上不同的質(zhì)量標(biāo)簽，利用該質(zhì)量標(biāo)簽在質(zhì)譜分析中產(chǎn)生的不同信號(hào)的強(qiáng)度差異，可以研究多個(gè)樣本中的特定蛋白質(zhì)的相對(duì)定量變化。但是這種同位素標(biāo)記的定量的質(zhì)譜方法需要消耗較大量的標(biāo)記試劑，造成實(shí)驗(yàn)成本和操作的復(fù)雜程度均明顯上升。
發(fā)明內(nèi)容現(xiàn)有技術(shù)中，使用同位素標(biāo)記的定量方法需要消耗較大量的標(biāo)記試劑，造成實(shí)驗(yàn)成本和操作的復(fù)雜程度均明顯上升，為了解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種無(wú)同位素標(biāo)記相對(duì)定量分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的方法，該方法包括:將蛋白質(zhì)酶解成肽段，利用不依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)確定具有磷酸化位點(diǎn)的肽段，以及利用無(wú)標(biāo)記定量方法對(duì)具有磷酸化位點(diǎn)的肽段進(jìn)行相對(duì)定量分析。由于直接從蛋白質(zhì)的酶解肽段中鑒定磷酸化肽段并確定其位點(diǎn)具有很高的難度，這是因?yàn)?第一，磷酸化蛋白質(zhì)含量一般很低，化學(xué)計(jì)量值低，磷酸化的肽段很容易淹沒(méi)在大量非磷酸化的肽段中；其次，磷酸化的肽段本身所具有的負(fù)電性使其在正離子模式的質(zhì)譜分析中信號(hào)受到抑制；再次，磷酸化基團(tuán)在串級(jí)質(zhì)譜分析中容易從肽鏈上斷裂，這使得發(fā)現(xiàn)磷酸化位點(diǎn)遇到很高的挑戰(zhàn)。為此，本發(fā)明對(duì)蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的磷酸化肽段首先進(jìn)行高效的富集，去除那些非磷酸化的肽段。因此，在上述無(wú)同位素標(biāo)記相對(duì)定量分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平方法中，在將蛋白質(zhì)酶解成肽段的步驟和利用data-1ndependentMS/MS方法確定具有磷酸化位點(diǎn)的肽段的步驟之間還包括富集磷酸化肽段的步驟。本發(fā)明采用以二氧化鈦或金屬鐵/金屬鋯氧化物為基質(zhì)制作的親和純化柱對(duì)磷酸化肽段進(jìn)行富集。首先將待分析的蛋白質(zhì)樣品酶解，使之轉(zhuǎn)化為肽段的混合物。該肽段樣品直接上樣到親和柱上，其中含有的磷酸化肽段會(huì)被基質(zhì)特異性地吸附，而大部分的非磷酸化肽段則不被保留而流出。為了徹底去除非特異性肽段的吸附，還需要用含有2，5_二羥基苯甲酸或谷氨酸的溶液多次潤(rùn)洗柱子，最后使用氨水溶液將結(jié)合在基質(zhì)上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，收集洗脫液并濃縮。由于本發(fā)明中使用親和富集的方法富集磷酸化肽段，去除了非磷酸化肽段的干擾，因此能顯著提高相對(duì)定量分析方法的靈敏度和準(zhǔn)確度。相對(duì)于依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜分析(data-dependentMS/MS)技術(shù),不依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜技術(shù)不依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜(data-1ndependentMS/MS)是一種靈敏度更高，對(duì)蛋白質(zhì)組鑒定的通量和覆蓋率更高的分析方法，該分析方法在低碰撞能和高碰撞能之間進(jìn)行交替掃描，不需要如常規(guī)方法一般選擇特定的肽段母離子，而是將所有母離子都打碎，在數(shù)據(jù)檢索中找到母離子和相應(yīng)碎片離子的對(duì)應(yīng)關(guān)系。本發(fā)明將富集的磷酸化肽段樣品進(jìn)行納升流高效液相色譜-串級(jí)質(zhì)譜(nanoLC-MS/MS)分析，采用data-1ndependentMS/MS技術(shù)得到各個(gè)肽段的母離子和碎片離子的兩張譜圖。通過(guò)分析譜圖中的母離子和相應(yīng)碎片離子的精確質(zhì)量數(shù)之間的差別，可以得知肽段上攜帶的磷酸根的數(shù)目，而譜圖中的碎片離子能夠直接指示磷酸化的位點(diǎn)。圖1為使用不依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜方法技術(shù)得到的某種磷酸化肽段的串級(jí)質(zhì)譜圖，其中丟失磷酸根(-H3PO4)產(chǎn)生的若干碎片離子指示出具體的修飾位點(diǎn)。由此解得的肽段序列為ELQVASDNFpSNK，pS表示該絲氨酸殘基S攜帶一個(gè)磷酸化基團(tuán)。Data-1ndependentMS/MS技術(shù)能夠準(zhǔn)確鑒定肽段的氨基酸序列，并定位具體的修飾位點(diǎn)。這一步驟是進(jìn)行下述磷酸化相對(duì)定量分析步驟的先決條件。本發(fā)明利用操作簡(jiǎn)單、成本低廉的無(wú)標(biāo)記定量方法對(duì)具有磷酸化位點(diǎn)的肽段進(jìn)行相對(duì)定量分析。無(wú)標(biāo)記定量方法(Label-freequantitation)利用被鑒定的磷酸化肽段的離子提取色譜圖作為其定量的具體質(zhì)譜信號(hào)，相同序列的肽段所產(chǎn)生的質(zhì)譜信號(hào)與它的實(shí)際濃度呈比例關(guān)系，因此本發(fā)明利用不同樣品中的同一磷酸化肽段的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度作為其相對(duì)定量的依據(jù)。相對(duì)定量分析即為比較同一肽段母離子在不同樣品中得到的離子提取色譜圖中的色譜峰面積，從而知曉其相對(duì)含量的變化。需要指出的是，相對(duì)定量不需要測(cè)定目的肽段在每個(gè)樣品中的實(shí)際濃度，而只需測(cè)量其濃度相對(duì)于某個(gè)基準(zhǔn)樣品上升或下降的趨勢(shì)。為了減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中引入的系統(tǒng)誤差，本方案在蛋白的酶解樣品中加入適量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)(通常為磷酸化水平較高的α/β-酪蛋白的酶解產(chǎn)物)，而后可利用該內(nèi)標(biāo)產(chǎn)生的質(zhì)譜信號(hào)來(lái)校正待分析的各種磷酸化肽段的信號(hào)。為評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性，每一個(gè)樣品都要把整個(gè)制樣過(guò)程重復(fù)三遍，計(jì)算出待研究的磷酸化肽段相對(duì)含量的標(biāo)準(zhǔn)偏差，經(jīng)過(guò)統(tǒng)計(jì)分析(student’st-test)判斷其差異是否具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，本發(fā)明也使用已知相對(duì)比例的樣品進(jìn)行質(zhì)量控制的檢測(cè)，評(píng)價(jià)定量的準(zhǔn)確性。綜上，本發(fā)明提供了一種將磷酸化肽段的親和富集方法、不依賴于肽段母離子選擇的MS/MS技術(shù)與無(wú)需同位素標(biāo)記的定量方法組合起來(lái)的用于蛋白質(zhì)磷酸化的相對(duì)定量分析的方法。相對(duì)于現(xiàn)有的依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜分析與穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方法，該方法不需要同位素標(biāo)記試劑，因此具有降低實(shí)驗(yàn)成本和操作復(fù)雜程度的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明提出的新技術(shù)流程能夠?qū)Φ鞍踪|(zhì)上各個(gè)位點(diǎn)的磷酸化水平進(jìn)行精確的相對(duì)定量分析，為深入研究以磷酸化修飾為基礎(chǔ)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制提供了關(guān)鍵的技術(shù)。該新型的定量方法很大程度得解決了常規(guī)方法的低選擇性、操作復(fù)雜、耗樣量大等缺陷，而且可以對(duì)復(fù)雜混合物中的不同蛋白質(zhì)上的不同修飾位點(diǎn)同時(shí)進(jìn)行定量分析，顯著提高了磷酸化分析的通量。預(yù)計(jì)該技術(shù)方法能夠明顯推進(jìn)蛋白質(zhì)磷酸化的生物學(xué)研究。圖1為使用不依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜方法技術(shù)得到的磷酸化肽段ELQVASDNFpSNK的的串級(jí)質(zhì)譜圖。圖2中的上圖顯示的是突變體激酶中的磷酸化肽段S290的提取離子色譜峰，下圖顯示的是野生型激酶中的磷酸化肽段S290的提取離子色譜峰。具體實(shí)施例方式下面的實(shí)施例可以使本領(lǐng)域技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。實(shí)驗(yàn)樣品:某種蛋白激酶的突變體(mut)和野生型(Wt)實(shí)驗(yàn)方法:1、用膜蛋白酶酶解這兩個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品mut和wt,將蛋白轉(zhuǎn)化為多妝混合物。2、在兩個(gè)蛋白的酶解樣品中加入適量的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)酪蛋白的酶解產(chǎn)物)一起進(jìn)行磷酸化肽段的富集。3、分別用溶液Α(80%乙腈、0.4%三氟乙酸)和溶液B(25%乳酸、60%乙腈、0.3%三氟乙酸)平衡二氧化鈦親和柱，然后將混合好的酶解樣品與溶液B—起上樣到親和柱上，在離心的過(guò)程中，使磷酸化肽段結(jié)合到二氧化鈦介質(zhì)上，非磷酸化肽段流出來(lái)。4、用含有2，5_二羥基苯甲酸或谷氨酸的溶液多次潤(rùn)洗柱子，去除非特異性結(jié)合。最后使用氨水溶液將結(jié)合在基質(zhì)上的磷酸化肽段洗脫下來(lái)，收集洗脫液并濃縮。5、使用nanoLC-MS/MS分別分析兩個(gè)樣品富集得到的磷酸化肽段，使用data-1ndependentMS/MS方法采集肽段的碎片離子信息。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析:1、使用質(zhì)譜軟件檢索實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并結(jié)合串級(jí)質(zhì)譜圖確定mut和wt兩個(gè)蛋白分別的磷酸化修飾位點(diǎn)。2、選取要進(jìn)行相對(duì)定量的磷酸化肽段如S290ELQVASDNFpSNK，在總離子色譜圖中提取出它的色譜峰，計(jì)算峰面積，色譜峰面積反應(yīng)目的肽段的相對(duì)含量，并用內(nèi)標(biāo)肽段的強(qiáng)度進(jìn)行矯正，得到的相對(duì)強(qiáng)度即為目的肽段的相對(duì)定量結(jié)果。3.將該目的肽段在突變體(mut)中的相對(duì)含量與在野生型(wt)中的相對(duì)含量進(jìn)行比較，就可以確定當(dāng)特定位點(diǎn)突變以后對(duì)該激酶的磷酸化水平的影響。如圖2中所示出的，上圖顯示的是突變體激酶中S290這條磷酸化肽段的提取離子色譜峰，色譜峰面積反應(yīng)該磷酸化肽段的含量，下圖顯示的是野生型激酶中S290這條磷酸化肽段的提取離子色譜峰，將兩樣品中的色譜峰面積分別用內(nèi)標(biāo)信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行矯正然后比較就能得到關(guān)于磷酸化相對(duì)變化的結(jié)果。數(shù)據(jù)表明，相對(duì)于野生型激酶，定點(diǎn)突變導(dǎo)致S290這個(gè)位點(diǎn)的磷酸化水平下降了88%。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，可以理解在不脫離本發(fā)明的原理和精神的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由所附權(quán)利要求及其等同物限定。權(quán)利要求1.一種無(wú)同位素標(biāo)記相對(duì)定量分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的方法，包括:將蛋白質(zhì)酶解成肽段，利用不依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜方法確定具有磷酸化位點(diǎn)的肽段，以及利用無(wú)標(biāo)記定量方法對(duì)具有磷酸化位點(diǎn)的肽段進(jìn)行相對(duì)定量分析。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在將蛋白質(zhì)酶解成肽段的步驟和利用不依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜方法確定具有磷酸化位點(diǎn)的肽段的步驟之間還包括富集磷酸化肽段的步驟。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中所述富集磷酸化肽段的步驟包括:利用親和純化柱吸附肽段中的磷酸化肽段；從親和純化柱洗脫磷酸化肽段；以及收集洗脫的磷酸化肽段。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中所述親和純化柱的基質(zhì)為二氧化鈦或金屬鐵/金屬鋯氧化物。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其中在從親和純化柱洗脫磷酸化肽段之前還包括使用含有2，5-二羥基苯甲酸或谷氨酸的溶液潤(rùn)洗親和純化柱的步驟。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中利用無(wú)標(biāo)記定量方法對(duì)具有磷酸化位點(diǎn)的肽段進(jìn)行相對(duì)定量分析的步驟中還包括加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中所述內(nèi)標(biāo)物質(zhì)是α/β-酪蛋白的酶解產(chǎn)物。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中還包括將所述無(wú)同位素標(biāo)記相對(duì)定量分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的方法重復(fù)三次，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的步驟。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中還包括評(píng)價(jià)所述無(wú)同位素標(biāo)記相對(duì)定量分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的方法的定量準(zhǔn)確性的步驟。全文摘要本發(fā)明提供了一種無(wú)同位素標(biāo)記相對(duì)定量分析蛋白質(zhì)磷酸化修飾水平的方法，包括將蛋白質(zhì)酶解成肽段，利用不依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜方法方法確定具有磷酸化位點(diǎn)的肽段，以及利用無(wú)標(biāo)記定量方法對(duì)具有磷酸化位點(diǎn)的肽段進(jìn)行相對(duì)定量分析。相對(duì)于現(xiàn)有的依賴母離子的串級(jí)質(zhì)譜分析與穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合的方法，該方法不需要同位素標(biāo)記試劑，因此具有降低實(shí)驗(yàn)成本操作復(fù)雜程度的優(yōu)勢(shì)。文檔編號(hào)G01N1/40GK103163010SQ20111041803公開(kāi)日2013年6月19日申請(qǐng)日期2011年12月14日優(yōu)先權(quán)日2011年12月14日發(fā)明者水雯菁,楊誠(chéng),劉丹,魏曉超,徐金華申請(qǐng)人:天津市國(guó)際生物醫(yī)藥聯(lián)合研究院,南開(kāi)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院