專利名稱：一種強肝藥物的檢測方法
技術領域：
本發(fā)明屬于藥物分析檢測領域，涉及一種強肝藥物的檢測方法，特別是涉及采用高效液相色譜(HPLC)同時檢測所述強肝藥物的多種組分的檢測方法。
背景技術：
復方中藥是中醫(yī)臨床用藥的主要形式，是中醫(yī)藥學的特色與精髓。中藥是一個由多成分、多因素構成的復雜體系，其化學成分的多樣性與復雜性是其療效的物質(zhì)基礎，建立符合中醫(yī)藥特點的現(xiàn)代質(zhì)量控制體系，攻克中藥質(zhì)量分析與評價的難題，改進中藥現(xiàn)有質(zhì)量控制方法已成為人們積極研究的課題。建立對中藥的質(zhì)量控制體系必須立足于中藥的特色。復方中藥的整體作用特點決定了中藥不同于西藥。中藥的質(zhì)量控制方法必須能對起效的全部成分(有機成分、無機成分和絡合物成分)進行控制。只有這樣，所建立的質(zhì)量控制體系才能真正達到控制中藥質(zhì)量、保證中藥用藥安全有效的目的。中藥質(zhì)量控制正從簡單的單個成分含量測定轉向以先進技術為手段，多組分、多指標含量的測定。目前多數(shù)中藥標準還是采用光譜或色譜手段鑒別和測定某一種或幾種有效成分或指標成分，以及藥典規(guī)定的常規(guī)檢查項目。對于化學藥品而言，其藥效成分為結構清晰的單一化合物，構效關系明確，其含量和純度直接表達其有效性及安全性。然而，中醫(yī)用藥的特點是復方配伍，任何單一的有效或活性成分的含量高低均不能表達其整體的療效。強肝膠囊收載于《國家藥品標準新藥轉正標準》第三十五冊，由茵陳、板藍根、當歸、白芍、丹參、郁金、黃芪、黨參、澤瀉、黃精、地黃、山藥、山楂、秦艽、甘草、六神曲16味中藥組成，具有清熱利濕、補脾養(yǎng)血、益氣解郁的功效。用于治療慢性肝炎、早期肝硬化、脂肪肝、中毒性肝炎、肝纖維化等。強肝膠囊為石家莊東方藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的中藥大品種，經(jīng)研究證明，強肝膠囊有較強的抗肝纖維化作用，具有保護肝細胞，促進肝細胞再生，恢復肝功能和抑制纖維化作用。臨床上用于治療肝纖維化、早期肝硬化、病毒性肝炎、中毒性肝病、脂肪肝等，其治療效果已經(jīng)得到臨床的驗證。如何保證藥物的質(zhì)量以及強肝膠囊中有效成分的含量，是決定強肝膠囊療效的基礎?，F(xiàn)行的強肝膠囊質(zhì)量標準規(guī)定了茵陳、白芍的薄層色譜鑒別方法和芍藥苷高效液相色譜含量測定方法。作為中藥大復方，僅從外觀性狀、簡單的鑒別和單一成分含量測定等角度對強肝膠囊進行質(zhì)量控制，顯然不能全面準確說明其內(nèi)在的質(zhì)量，不能保證其療效。要控制強肝膠囊的功效，必須根據(jù)中藥多組分、多靶點、多途徑作用的特點，對其物質(zhì)整體予以控制，從整體上有效地表征中藥的質(zhì)量，建立安全、有效、穩(wěn)定的質(zhì)量標準體系。有關強肝膠囊質(zhì)量控制的文獻報道較少。目前多數(shù)檢測方法都僅局限于測定強肝膠囊大復方中一、二種指標成分，但如何能夠從宏觀的角度對強肝膠囊制劑質(zhì)量的進行宏觀質(zhì)量控制方法未見報道。同時，由于強肝膠囊的原料包含16味中藥且中藥成分之間存在復雜的相互作用，導致建立全面、有效地反映強肝膠囊內(nèi)在質(zhì)量和療效的有效成分檢測方法存在較大難度，因此，目前本領域存在對能夠全面表征強肝膠囊這種藥物的檢測方法的需求。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種檢測強肝藥物，如強肝膠囊內(nèi)容物的方法，該方法能夠全面檢測強肝藥物的藥物活性組分及其含量，從而表征和控制其內(nèi)在質(zhì)量。本發(fā)明的目的是通過以下技術方案來實現(xiàn)的一方面，本發(fā)明提供了一種強肝藥物的檢測方法，所述強肝藥物由茵陳、板藍根、 當歸、白芍、丹參、郁金、黃芪、黨參、澤瀉、黃精、地黃、山藥、山楂、秦艽、甘草、六神曲組成 (例如強肝膠囊，收載于《國家藥品標準新藥轉正標準》第三十五冊)，所述檢測方法包括采用高效液相色譜法同時檢測所述強肝藥物中的芍藥苷、龍膽苦苷和丹酚酸B，其中，所述高效液相色譜法的條件包括色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料；流動相流動相A為乙腈，流動相B為0. 05%體積分數(shù)磷酸水溶液，進行梯度洗脫；所述梯度洗脫程序如下，其中流動相比例均為體積百分比0 40min，流動相A為10 ，流動相B為90% 65% ；40 50min，流動相A為 100%，流動相B為65% 0% ；50 51min，流動相A為100% 10%，流動相B為0% 90% ；51 55min，流動相A為10% 10%，流動相B為90% 90%。優(yōu)選地，所述高效液相色譜法的條件還包括流速1. OmL/min ；柱溫30°C；檢測波長210nm 400nm ；理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算，應不低于6000。其中，所述檢測方法包括通過以下步驟制備對照品溶液取芍藥苷、龍膽苦苷和丹酚酸B對照品，加入甲醇溶解制成每Iml含芍藥苷0. 06mg、龍膽苦苷0. 03mg和丹酚酸 BO. 05mg的溶液，作為混合對照品溶液。并且，所述檢測方法還包括通過以下步驟制備供試品溶液取所述強肝藥物成分約0. 3g,置于錐形瓶或25ml容量瓶中，準確加入70%體積分數(shù)甲醇水溶液25mL，稱重，超聲處理或加熱回流30min，放至室溫，稱重，再用70 %體積分數(shù)甲醇水溶液補足重量，搖勻，微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得。優(yōu)選地，所述高效液相色譜法包括以下步驟1)制備混合對照品溶液取芍藥苷對照品、龍膽苦苷和丹酚酸B對照品適量，加入甲醇溶解并稀釋成每Iml含芍藥苷0. 06mg、龍膽苦苷0. 03mg和丹酚酸BO. 05mg的混合溶液，作為混合對照品溶液；2)制備供試品溶液取所述強肝藥物約0. 3g，精密稱重，置于錐形瓶或25ml容量瓶中，準確加入70%體積分數(shù)甲醇水溶液25mL，稱重，超聲處理或加熱回流30min，放至室CN 102539599 A溫，稱重，用70 %體積分數(shù)甲醇水溶液補足重量，搖勻，微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得；3)測定精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10 μ 1注入高效液相色譜儀， 根據(jù)以下色譜條件進行測定色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填料；流動相流動相A為乙腈，流動相B為0. 05 %體積分數(shù)磷酸水溶液，進行梯度洗脫；流速1. OmL/min ；柱溫30°C；紫外檢測波長230nm ；記錄峰面積，采用外標法計算芍藥苷、龍膽苦苷和丹酚酸B。所述梯度洗脫程序如下，其中流動相比例均為體積百分比O 40min，流動相A為10 ，流動相B為90% 65% ；40 50min，流動相A為 100%，流動相B為65% 0% ；50 51min，流動相A為100% 10%，流動相B為0% 90% ；51 55min，流動相A為10% 10%，流動相B為90% 90%。采用上述方法可以對待測強肝膠囊樣品中的多指標成分進行測定，待測產(chǎn)品的龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B含量范圍應為下述范圍龍膽苦苷0. 30 0. 70%、芍藥苷0. 15 0.32%、丹酚酸 B 0.20 0.80%。以下是本發(fā)明的詳細描述。色譜條件比較了甲醇-水和乙腈-水體系，結果表明，乙腈-水體系洗脫能力較強，分離效率較高，分離速度較快，故選擇乙腈-水體系進行分離。同時，所測指標成分中含有酚酸類水溶性成分，酸化的流動相可以抑制酚酸類成分解離，減少色譜峰拖尾。因此，最終選擇乙腈-0. 05%體積分數(shù)磷酸水溶液為流動相。由于各指標成分的極性差異較大，必須采用梯度洗脫的方法進行分離分析。試驗中，考察了不同洗脫梯度，最后確定強肝膠囊的梯度洗脫條件0 40min，流動相A為10 ；35 %，流動相B為90 % 65 % ;40 50min，流動相A為
100%，流動相B為65% 0%;50 51min，流動相A為100% 10%，流動相B為 0% 90% ；51 55min，流動相A為10% 10%，流動相B為90% 90%。供試品溶液采用二極管陣列檢測器(DAD)在210 400nm波長范圍內(nèi)進行全波長掃描，并對各波長下的色譜圖進行分析比較。同時采用紫外分光光度計分別對龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B 3個對照品進行掃描，結果龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B的最大吸收波長分別為271. 5nm、230. 5nm和沘8. Onm處。采用DAD檢測器對樣品進行200 400nm的全波長掃描，對各波長下的色譜圖進行分析比較。綜合考慮，230nm下，各成分特征峰明顯，且峰型較好，適宜多指標含量測定。故確定230nm為檢測波長。混合對照品溶液的制備分別精密稱定龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B適量，用甲醇溶解并稀釋至刻度，即為混合對照品溶液。供試品溶液制備
通過多次的試驗考察確定了本質(zhì)量控制方法中供試品溶液的制備方法，試驗比較了用50%體積分數(shù)乙醇水溶液，70%體積分數(shù)乙醇水溶液，50%體積分數(shù)甲醇水溶液，70% 體積分數(shù)甲醇水溶液，甲醇做提取溶劑對含量測定的影響，確定用70%甲醇水溶液作溶劑效果佳，同時對超聲和回流不同提取方法和不同提取時間做了比較。結果表明使用70%體積分數(shù)甲醇水溶液超聲或加熱回流30分鐘，所得色譜峰較多，峰面積較大。由于本品藥味多，提取工藝為水煎，考慮到本品大分子物質(zhì)較多，色譜柱負荷較大，因此本實驗還對樣品除雜處理方法進行了考察，考察用正丁醇、乙酸乙酯萃取及溶液PH值對各指標成分的提取效率影響，結果不理想。最終確定為取強肝膠囊內(nèi)容物適量，精密稱重，置錐形瓶中，加入 70 %體積分數(shù)甲醇水溶液，稱重，超聲處理或加熱回流，取出，放至室溫，補足重量，搖勻，微孔濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液，即得。本發(fā)明進行了專屬性考察。稱取按強肝膠囊處方和提取工藝制備缺少秦艽、白芍、 丹參藥材的陰性對照品約0. 3g，按供試品溶液制備方法制備，然后在確定的色譜條件下，量取混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液注入高效液相色譜儀，記錄HPLC圖，見附圖1、2、3。對3個色譜圖進行分析對比，供試品色譜圖中，在龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B 對照品色譜峰相應的保留時間的位置上，有相應的成分色譜峰出現(xiàn)，而在陰性對照色譜圖中，無相應成分色譜峰出現(xiàn)，提示該方法對龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B的含量測定無干擾， 證明本發(fā)明的多指標測定方法具有專屬性。采用所述的強肝膠囊多指標成分測定方法，如測定的待測產(chǎn)品中龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B的含量在下述范圍龍膽苦苷0. 30 0. 70 %、芍藥苷0. 15 0. 32%、丹酚酸 B 0.20 0.80%，則為合格產(chǎn)品。與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明提供的強肝藥物檢測方法具有以下積極效果首先，本發(fā)明所涉及的強肝膠囊內(nèi)容物為16味中藥組成，各個藥材所含化學成分復雜，對含量檢測時各個成分相互造成干擾，在采用HPLC進行檢測時，導致其他成分對各指標成分干擾，使含量結果重復性差，所以必須嚴格控制流動相的色譜條件，才能使各指標成分得到良好的特征峰。實驗證明，只有采用本發(fā)明經(jīng)過大量實驗所得到的切實可行的、特定的色譜條件，才能得到該藥物的有效成分龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B的特征峰，從而實現(xiàn)了特征峰的有效分離。其次，本發(fā)明的方法可以同時對強肝藥物例如強肝膠囊的主要有效成分龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B進行含量檢測，從而實現(xiàn)對強肝藥物的最大可能化學成分進行檢測， 有利于對其質(zhì)量的全方面監(jiān)控，以使強肝藥物的質(zhì)量控制方法更加完善。并且，本發(fā)明具有方法簡便、穩(wěn)定、精密度高、重現(xiàn)性好、易于掌握的特點。在同一測試條件下，同時實現(xiàn)了強肝藥物例如強肝膠囊中龍膽苦苷、芍藥苷、丹酚酸B的含量測定。


以下，結合附圖來詳細說明本發(fā)明的實施方案，其中圖1為混合對照品的HPLC圖，其中1為龍膽苦苷，2為芍藥苷，3為丹酚酸B ；圖2為強肝膠囊內(nèi)容物的HPLC圖，其中1為龍膽苦苷，2為芍藥苷，3為丹酚酸B ；圖3為陰性對照品HPLC圖4至6分別為實施例5中試驗的梯度洗脫條件1至3的HPLC圖；圖7為實施例6中采用國家藥品標準WS3-133(Z-13;3)-2002 (Z)中色譜條件的流動相檢測強肝膠囊得到的HPLC圖。
具體實施例方式以下參照具體的實施例來說明本發(fā)明。本領域技術人員能夠理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明，其不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。以下各實施例中所使用的對照品來源如下龍膽苦苷，購自中國藥品生物制品檢定所，批號110770-200712，供含量測定用，含量以99%計；芍藥苷，購自中國藥品生物制品檢定所，批號0736-9710 ；丹酚酸B，購自天津一方科技有限公司。以下各實施例中所使用的供試品強肝膠囊為本發(fā)明人與石家莊東方藥業(yè)有限公司按照國家藥品標準(新藥轉正標準)第35冊WS3-133(Z-13;3)-2002(Z)制備，制備過程中充分注重了處方中各藥材的產(chǎn)地屬性、采收季節(jié)特征、工藝控制特征。制得的產(chǎn)品批號見下表1 表1實施例中采用的強肝膠囊的批號
權利要求
1.一種強肝藥物的檢測方法，所述強肝藥物由茵陳、板藍根、當歸、白芍、丹參、郁金、黃芪、黨參、澤瀉、黃精、地黃、山藥、山楂、秦艽、甘草、六神曲組成，所述檢測方法包括采用高效液相色譜法同時檢測所述強肝藥物中的芍藥苷、龍膽苦苷和丹酚酸B，其中，所述高效液相色譜法的條件包括色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料；流動相流動相A為乙腈，流動相B為0. 05%體積分數(shù)磷酸水溶液，進行梯度洗脫； 所述梯度洗脫程序如下，其中流動相比例均為體積百分比 0 40min，流動相A為10 ，流動相B為90% 65% ； 40 50min，流動相A為 100%，流動相B為65% 0% ； 50 51min，流動相A為100% 10%，流動相B為0% 90% ； 51 55min，流動相A為10% 10%，流動相B為90% 90%。
2.根據(jù)權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述高效液相色譜法的條件還包括 流速:1. OmL/min ；柱溫:30°C ；檢測波長210nm 400nm ；理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算，應不低于6000。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，所述檢測方法還包括通過以下步驟制備對照品溶液取芍藥苷對照品、龍膽苦苷和丹酚酸B，加入甲醇溶解制成每Iml含芍藥苷0. 06mg、龍膽苦苷0. 03mg和丹酚酸BO. 05mg的溶液，作為混合對照品溶液。
4.根據(jù)權利要求1至3中任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述建立方法還包括通過以下步驟制備供試品溶液取所述強肝藥物成分約0. 3g，置于錐形瓶或25ml容量瓶中， 準確加入70%體積分數(shù)甲醇水溶液25mL，稱重，超聲處理或加熱回流30min，放至室溫，稱重，再用70%體積分數(shù)甲醇水溶液補足重量，搖勻，微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得。
5.根據(jù)權利要求1至4中任一項所述的檢測方法，其特征在于，所述高效液相色譜法包括以下步驟1)制備混合對照品溶液取芍藥苷對照品、龍膽苦苷和丹酚酸B，加入甲醇溶解制成每 Iml含芍藥苷0. 06mg、龍膽苦苷0. 03mg和丹酚酸BO. 05mg的溶液，作為混合對照品溶液；2)制備供試品溶液取所述強肝藥物約0.3g，置于錐形瓶或25ml容量瓶中，準確加入 70%體積分數(shù)甲醇水溶液25mL，稱重，超聲處理或加熱回流30min，放至室溫，稱重，用70% 體積分數(shù)甲醇水溶液補足重量，搖勻，微孔濾膜濾過，棄去初濾液，取續(xù)濾液即得；3)測定精密吸取混合對照品溶液與供試品溶液各10μ1注入高效液相色譜儀，根據(jù)以下色譜條件進行測定色譜柱以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料；流動相流動相A為乙腈，流動相B為0. 05%磷酸水溶液，進行梯度洗脫； 流速:1. OmL/min ； 柱溫:30°C ； 紫外檢測波長230nm ；記錄峰面積，采用外標法計算芍藥苷、龍膽苦苷和丹酚酸B。
6.根據(jù)權利要求5所述的檢測方法，其特征在于，所述梯度洗脫程序如下，其中流動相比例均為體積百分比0 40min，流動相A為10 ，流動相B為90% 65% ； 40 50min，流動相A為 100%，流動相B為65% 0% ； 50 51min，流動相A為100% 10%，流動相B為0% 90% ； 51 55min，流動相A為10% 10%，流動相B為90% 90%。
全文摘要
本發(fā)明提供一種強肝藥物的檢測方法，所述強肝藥物由茵陳、板藍根、當歸、白芍、丹參、郁金、黃芪、黨參、澤瀉、黃精、地黃、山藥、山楂、秦艽、甘草、六神曲組成，所述檢測方法包括采用高效液相色譜法檢測所述強肝藥物中的芍藥苷、龍膽苦苷和丹酚酸B，條件包括色譜柱為以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充材料；流動相包括流動相A為乙腈，流動相B為酸性水溶液，進行梯度洗脫；流速1.0mL/min；柱溫30℃；檢測波長210nm～400nm；理論塔板數(shù)按芍藥苷峰計算，應不低于6000。采用本發(fā)明的檢測方法，可以同時檢測強肝藥物中芍藥苷、龍膽苦苷和丹酚酸B這3種有效成分的含量，從而能夠全面表征強肝藥物活性組分，具有精密度、穩(wěn)定性、重復性高的特點。
文檔編號G01N30/88GK102539599SQ20111042078
公開日2012年7月4日 申請日期2011年12月15日 優(yōu)先權日2011年12月15日
發(fā)明者何立新, 劉向, 劉毅, 劉素香, 張鐵軍, 韋輝, 韓豐年 申請人:石家莊東方藥業(yè)有限公司