專利名稱：一個(gè)基于納米技術(shù)的psa高敏感檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種免疫酶聯(lián)吸附技術(shù)的檢測(cè)方法，具體的說(shuō)，涉及一種大幅度提高免疫酶聯(lián)吸附技術(shù)檢測(cè)方法靈敏度的金納米顆粒雙標(biāo)探針-PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))擴(kuò)增檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
免疫反應(yīng)是免疫體系中各成員(抗原、免疫分子、免疫細(xì)胞、免疫組織)之間相互依賴，相互影響和相互作用的一種免疫學(xué)現(xiàn)象?；诳乖涂贵w特異性反應(yīng)建立起來(lái)的免疫分析方法是一種利用抗原、抗體之間高特異性的相互作用(即免疫反應(yīng))實(shí)現(xiàn)對(duì)血樣或尿樣中的抗原、抗體、激素、受體和小分子藥物進(jìn)行鑒定的一種分析方法。因此，免疫分析比一般化學(xué)分析的特異性和靈敏度要高，被廣泛的應(yīng)用于生命科學(xué)，分析科學(xué)及醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域。
酶免疫分析是將酶反應(yīng)的高效性與免疫反應(yīng)的特異性有機(jī)結(jié)合的標(biāo)記免疫學(xué)技術(shù)。1966年，Engvall和Perlmarm建立了酶免疫測(cè)定法，主要是利用免疫復(fù)合體上的酶活性將特定的底物催化，使該物質(zhì)的特征吸收峰發(fā)生變化，用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定，從而測(cè)得待測(cè)物的量。具有靈敏度較高，操作較簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，是目前使用廣泛的免疫分析方法。
酶免疫分析法包括酶聯(lián)免疫吸附分析法、酶免疫試驗(yàn)法、競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合酶免疫分析法等，其中ELISA(酶聯(lián)免疫吸附法)是酶免疫法中應(yīng)用最為廣泛的一種。
ELISA的工作原理基于抗原或抗體的固定以及抗原或抗體的酶標(biāo)記。利用蛋白與固相載體表面活性基團(tuán)之間相互作用，將抗原或抗體吸附于固相載體表面，結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學(xué)活性；同時(shí)，抗原或抗體可通過(guò)共價(jià)鍵與酶連接形成酶結(jié)合物，此種酶標(biāo)記的抗原或抗體既保留其免疫學(xué)活性，又保留酶的活性。在測(cè)定時(shí)，待測(cè)樣品與固相載體表面的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，經(jīng)過(guò)洗滌后，加入酶標(biāo)記的抗原或抗體，通過(guò)免疫反應(yīng)而結(jié)合在復(fù)合物上，使酶的量與待測(cè)樣品的量呈一定的比例，即酶的多少反映待測(cè)樣品的多少。再加入酶的反應(yīng)底物后，底物被酶催化成為特征吸收峰與底物不同的產(chǎn)物，通過(guò)使用分光光度法，即可對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量檢測(cè)。
但是，傳統(tǒng)的ELISA檢測(cè)，其結(jié)果非常容易受到一些因素的影響。比如顯色時(shí)間和溫度的控制會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；緩沖液的選擇也非常重要，因?yàn)橛械木彌_液體系能夠減少底色；目前的ELISA檢測(cè)靈敏度在ng級(jí)，難以滿足對(duì)于一些微量重要物質(zhì)的檢測(cè)要求。
納米技術(shù)目前被廣泛應(yīng)用于化學(xué)，物理和生命科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域，推動(dòng)生物分析的快速發(fā)展，其高靈敏度對(duì)疾病的早期診斷，治療效果追蹤，血液和食品的微量檢測(cè)篩選以及跟蹤疾病的復(fù)發(fā)情況等都是必不可少的。
其中，金納米顆粒是金鹽被還原成原子金后形成的金顆粒懸液，由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，因此也稱膠體金。金顆粒大小多在Ι-lOOnm，所以又被稱為納米金。 金納米顆粒溶液的顏色隨其直徑大小和所處的化學(xué)環(huán)境的不同而呈現(xiàn)紅色至紫色不同的顏色。一般來(lái)說(shuō)，直徑越大，顏色越深，所有的金納米顆粒在510-550nm的可見(jiàn)光范圍內(nèi)都有特征吸收峰。金納米顆粒2-5nm呈桔黃色，10-20nm呈酒紅色，30-64nm呈深紅色。小分子的金納米顆?；旧铣蕡A球形，30-80nm為偏心圓形。
由于金納米顆粒的高電子密度、納米級(jí)尺度、較高的吸光度，以及其良好的生物相容性優(yōu)點(diǎn)，使其成為免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)中重要的標(biāo)記物，目前，已經(jīng)是現(xiàn)代免疫學(xué)四大免疫標(biāo)記技術(shù)之一。
將核酸連接在金納米顆粒上，使其檢測(cè)延伸到了核酸領(lǐng)域，通過(guò)核酸上的巰基修飾與金形成共價(jià)連接，再通過(guò)鹽離子減弱核酸分子間的靜電排斥作用，在金納米顆粒表面得到高密度核酸分子，從而實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。
PCR技術(shù)是80年代中期發(fā)展起來(lái)的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、快速、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好、易自動(dòng)化等突出優(yōu)點(diǎn)；能在一個(gè)試管內(nèi)將所要研究的目的基因或某一核酸片段于數(shù)小時(shí)內(nèi)擴(kuò)增至十萬(wàn)乃至百萬(wàn)倍。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)目前傳統(tǒng)的ELISA檢測(cè)方法的靈敏度需要進(jìn)一步提高的問(wèn)題，提供一種大幅度提高ELISA檢測(cè)靈敏度的技術(shù)。
本發(fā)明的技術(shù)解決方案是將納米技術(shù)與ELISA相結(jié)合，該技術(shù)包括兩種探針一種是磁珠探針，連接有能夠與PSA (Prostatespecific antigen)特異性識(shí)別的PSA抗體，通過(guò)共價(jià)鍵連接到磁珠表面。第二種是金納米顆粒雙標(biāo)探針，連接有PSA特異性抗體和寡核苷酸序列。這兩種探針可與PSA形成三明治結(jié)構(gòu)。金納米顆粒上攜帶的數(shù)以百計(jì)的寡核苷酸鏈，作為PSA的生物編碼。待形成三明治結(jié)構(gòu)后，利用磁場(chǎng)對(duì)三明治結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離和收集。釋放核酸，并對(duì)被釋放的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)PCR擴(kuò)增以及核酸測(cè)序?qū)SA進(jìn)行定性定量檢測(cè)。本方法可以檢測(cè)到60ag/ml的底物，相對(duì)于臨床上的同類檢測(cè)，檢測(cè)靈敏度高了六個(gè)數(shù)量級(jí)。
具體地說(shuō)，免疫酶聯(lián)吸附的雙標(biāo)金納米顆粒探針-PCR擴(kuò)增檢測(cè)法，其特點(diǎn)包括如下步驟
1.金納米顆粒雙標(biāo)探針的制備制備13nm的膠體金溶液；將抗體修飾到金納米顆粒上；設(shè)計(jì)作為生物條碼的核酸序列；將其連接到已經(jīng)修飾有抗體的金納米顆粒上。
2.在液相中利用雙抗夾心法捕捉待測(cè)蛋白質(zhì)將抗體與磁珠進(jìn)行交聯(lián)，制備磁珠探針；向磁珠探針中加入含有PSA的待測(cè)抗原液；將金納米顆粒雙標(biāo)探針加入磁珠探針中進(jìn)行孵育，形成三明治結(jié)構(gòu)。
3. DTT對(duì)金納米顆粒雙標(biāo)探針上的核酸進(jìn)行釋放利用磁力架對(duì)磁珠探針-PSA-金納米顆粒雙標(biāo)探針形成的三明治結(jié)構(gòu)進(jìn)行分離；加入DTT溶液對(duì)金納米顆粒上的核酸進(jìn)行釋放。
4.核酸擴(kuò)增核酸擴(kuò)增方法采用PCR。
5.信號(hào)處理核酸擴(kuò)增信號(hào)可以用普通的瓊脂糖凝膠電泳的方法進(jìn)行檢測(cè)，并用圖像分析軟件獲取信號(hào)的灰度值，進(jìn)行定量分析。
本方法具有如下的優(yōu)點(diǎn)和效果
1.本方法可以對(duì)血清中的蛋白進(jìn)行高靈敏度的可視化檢測(cè)，與原始的ELISA檢測(cè)相比，檢測(cè)靈敏度提高了六個(gè)數(shù)量級(jí)。
2.本方法的樣品標(biāo)記即金納米顆粒雙標(biāo)探針的方法，具有操作簡(jiǎn)便、試劑有效期長(zhǎng)、成本低廉、反應(yīng)靈敏等優(yōu)點(diǎn)。
3.本方法的信號(hào)顯示方法是擴(kuò)增后的核酸，結(jié)果易于保存、對(duì)比、以及標(biāo)準(zhǔn)化；同時(shí)，與酶聯(lián)免疫方法相比，該方法具有環(huán)境條件要求低的優(yōu)點(diǎn)。
4.本方法對(duì)擴(kuò)增核酸信號(hào)進(jìn)行灰度值掃描，具有制備方法簡(jiǎn)單、性能穩(wěn)定、分析結(jié)果數(shù)字化，易于分析的優(yōu)點(diǎn)。


圖1為放大30萬(wàn)倍的13nm金顆粒電鏡圖。
圖2為各種經(jīng)修飾的金納米顆粒探針的紫外可見(jiàn)吸收峰峰值圖，紫外吸收峰分別 DNA-AuNP 522nm、AuNP 519nm、Protein-AuNP 538nm、Protein-AuNP-DNA 526nm。
圖3為磁珠交聯(lián)前和交聯(lián)后的蛋白溶液紫外可見(jiàn)吸收峰變化圖。
圖4為不同濃度梯度PSA的三明治檢測(cè)實(shí)驗(yàn)釋放核酸PCR擴(kuò)增結(jié)果示意圖。其中 1為BSA封閉陰性對(duì)照；2為BSA和tRNA共同封閉陰性對(duì)照；3_8為實(shí)驗(yàn)組，其中PSA的濃度分別是 3 為 62. 5ag/ml，4 為 1. 25fg/ml，5 為 25fg/ml，6 為 0. 5pg/ml，7 為 10pg/ml，8 為 200pg/ml ；9為陽(yáng)性對(duì)照，10無(wú)模板對(duì)照，11無(wú)引物對(duì)照。
圖5為三次PCR擴(kuò)增結(jié)果灰度掃描均值線性回歸圖。
具體實(shí)施方式
實(shí)施實(shí)例1
用免疫酶聯(lián)吸附的金納米顆粒雙標(biāo)探針-PCR擴(kuò)增檢測(cè)法檢測(cè)PSA抗原的過(guò)程
1.自制13nm的膠體金溶液。
2.磁珠探針的制備取2X108個(gè)磁珠，按說(shuō)明書上提到的緩沖液進(jìn)行操作，經(jīng)PBS 洗滌后，向其中加入6 μ g PSA的多克隆抗體，在37°C下孵育4小時(shí)，并且保證充分混勻。最后經(jīng)過(guò)封閉液封閉。磁珠探針保存于4°C備用。
3.磁珠探針捕獲PSA抗原將不同濃度的PSA溶液加入到磁珠探針中，PSA濃度分別為 62. 5ag/ml、l. 25fg/ml、25fg/ml、0. 5pg/ml、10pg/ml、200pg/ml，4°C，避光，孵育過(guò)夜。
4.膠體金探針的制備向膠體金中加入PSA抗體，室溫孵育半小時(shí)后加入核酸，向溶液中加入10. 8 μ L 0. 5Μ的磷酸緩沖液和一定量2Μ NaCl溶液使其Na濃度遞增，當(dāng)Na+ 濃度升至0. IMjh后停止反應(yīng)，加入BSA封閉。制得的膠體金雙標(biāo)探針保存于4°C備用。
5.三明治結(jié)果形成將膠體金雙標(biāo)探針加入磁珠中4°C，避光，孵育過(guò)夜。
6.核酸釋放加入0. 5M DTT釋放液，室溫孵育過(guò)夜，回收上清液。
7.核酸擴(kuò)增用回收的上清液直接進(jìn)行核酸擴(kuò)增，其引物采用自己設(shè)計(jì)合成的按設(shè)計(jì)條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增-MV，5分鐘；940C，30秒；44°C，30秒；72°C，15秒；72 °C，5分鐘； 20循環(huán)。循環(huán)完成后，即對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。用紫外成像儀照膠記錄，通過(guò)條帶比較進(jìn)行初步定性和定量分析。
8.信號(hào)處理采用圖像分析軟件Image J對(duì)獲取條帶進(jìn)行灰度值掃描及定量分析，計(jì)算出三次灰度值平均值見(jiàn)表1?；叶戎蹬c對(duì)應(yīng)的PSA濃度值進(jìn)行線性分析，線性系數(shù) r = 0. 9818。
權(quán)利要求
1.一種基于納米技術(shù)的微量蛋白質(zhì)檢測(cè)方法，其特征在于將磁珠探針技術(shù)、金納米顆粒雙標(biāo)探針技術(shù)、免疫酶聯(lián)吸附技術(shù)和核酸擴(kuò)增技術(shù)四者結(jié)合起來(lái)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于方法為免疫酶聯(lián)的金納米顆粒雙標(biāo)探針PCR檢測(cè)法。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的檢測(cè)方法，其特征在于包括以下步驟(1)在液相中利用雙抗夾心法捕捉待測(cè)蛋白質(zhì)；(2)金納米顆粒雙標(biāo)探針的制備；(3)DTT對(duì)金納米顆粒雙標(biāo)探針上的核酸進(jìn)行釋放；(4)核酸擴(kuò)增；(5)信號(hào)處理。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(1)在液相中利用雙抗夾心法捕捉待測(cè)蛋白質(zhì)為磁珠探針在液相中利用免疫酶聯(lián)吸附方法捕捉PSA等蛋白質(zhì)并與帶有抗體和核酸修飾的金納米顆粒雙標(biāo)探針作用，形成夾心結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟( 金納米顆粒雙標(biāo)探針的制備為將PSA特異性抗體和具有特定序列的核酸同時(shí)修飾在金納米顆粒表面。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(3)DTT對(duì)金納米顆粒雙標(biāo)探針上的核酸進(jìn)行釋放為將DTT溶于一定pH的PB溶液中，使其終濃度達(dá)到0. 5M，對(duì)金納米顆粒雙標(biāo)探針上的核酸進(jìn)行釋放。
7.根據(jù)權(quán)利要求書3所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(4)核酸擴(kuò)增為對(duì)洗脫下來(lái)的核酸進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使其實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大。
8.根據(jù)權(quán)利要求書3所述的檢測(cè)方法，其特征在于步驟(5)信號(hào)處理為采用圖像分析軟件獲取信號(hào)的灰度值，進(jìn)行定量分析。
全文摘要
一個(gè)基于納米技術(shù)的PSA高敏感檢測(cè)方法，是將磁珠探針技術(shù)、金納米顆粒雙標(biāo)探針技術(shù)、免疫酶聯(lián)吸附技術(shù)和核酸擴(kuò)增技術(shù)四者結(jié)合起來(lái)的一種新型生物高靈敏度檢測(cè)方法。該方法將針對(duì)待測(cè)蛋白質(zhì)(如PSA)的一種抗體與磁珠交聯(lián)，捕捉樣品中的待測(cè)蛋白質(zhì)后，加入用另一種抗體和核酸標(biāo)記的金納米顆粒雙標(biāo)探針。進(jìn)行磁性分離純化后，對(duì)核酸進(jìn)行釋放擴(kuò)增，由瓊脂糖凝膠電泳得到可視化結(jié)果，進(jìn)行灰度值掃描。與傳統(tǒng)的ELISA相比，其檢測(cè)靈敏度高了六個(gè)數(shù)量級(jí)，對(duì)于癌癥的早期診斷以及微量重要物質(zhì)，包括核酸和蛋白質(zhì)的檢測(cè)，均具有重要意義。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102520189SQ20111042085
公開(kāi)日2012年6月27日 申請(qǐng)日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者孫莉, 張玉祥 申請(qǐng)人:首都醫(yī)科大學(xué)