專利名稱：一種聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型建立方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種聯(lián) 合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型建立方法。
背景技術(shù)：
鎘污染已在世界范圍內(nèi)普遍存在，進(jìn)而導(dǎo)致在人類的主要食物中富集有一定量的鎘，給人體健康帶來了潛在的威脅。食物的安全檢測是預(yù)防人體鎘中毒的重要保障。目前，主要通過測定食物中鎘的積累量來間接的評(píng)價(jià)其對(duì)人體的生物學(xué)效應(yīng)，這難免存在很大的不準(zhǔn)確性；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也是評(píng)價(jià)食物安全性的一種方法，但由于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)存在周期長、操作復(fù)雜、易受實(shí)驗(yàn)因素(如其他飼料成分、實(shí)驗(yàn)條件、動(dòng)物生理狀況等)影響等，因此，毒性評(píng)價(jià)時(shí)往往存在偏差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，既將Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，從而建立起聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型的建立方法。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了一種聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型建立方法，包括以下步驟(I)食物樣品消化和測定液獲取a.食物樣品收集后，磨碎，采用胃液和腸液依次消化；b.將消化混合液離心，收取上清液，高壓滅菌；(2)單獨(dú)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞a. Caco-2細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞系)培養(yǎng)于六孔板插入槽的聚碳酸酯膜上；b. 293T細(xì)胞(人胚腎T細(xì)胞系)培養(yǎng)于另一塊六孔板的底部；(3) Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有293T細(xì)胞的六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h ；(4)鎘生物有效性和毒性評(píng)價(jià)將食物樣品測定液置于聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)在293T細(xì)胞層上加入等滲的孵育液，繼續(xù)培養(yǎng)24h ;慢性毒性試驗(yàn)時(shí)，可最長聯(lián)合培養(yǎng)IOd(5)指標(biāo)檢測a.用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)技術(shù)測定細(xì)胞吸收的鎘量；b.通過觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、MTT比色、LDH活性、細(xì)胞凋亡以測定鎘對(duì)細(xì)胞的毒性。步驟(I)食物樣品消化和測定液獲取方法具體包括以下步驟收集待檢測的食物樣品，磨碎，依次通過pH2. 0的胃蛋白酶消化液，37°C恒溫水浴箱里消化Ih ；pH7. 0的胰酶-膽汁榨取物消化液，37°C恒溫水浴箱里消化2h ;離心，收取上清液作為測定液；將測定液高壓滅菌。
步驟(2)Caco_2細(xì)胞和293T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)方法具體為具體為Caco_2細(xì)胞和293T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)于25cm2培養(yǎng)瓶中，并定期換液、傳代和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，保證細(xì)胞培養(yǎng)過程中不受污染，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；達(dá)到試驗(yàn)需要的數(shù)量后，將Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)入六孔培養(yǎng)板的插入槽上培養(yǎng)；293T細(xì)胞轉(zhuǎn)入另一個(gè)六孔培養(yǎng)板的底部培養(yǎng)。步驟(3)Caco_2細(xì)胞和293T細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)方法具體為通過測定Caco_2細(xì)胞層甘露醇透過率和細(xì)胞跨膜電阻值，以評(píng)價(jià)Caco-2細(xì)胞層的完整性，甘露醇透過率低于0. 5% .^1 cm_2，細(xì)胞跨膜電阻值穩(wěn)定高于250 Q cm2 ;通過相差顯微鏡下觀察293T細(xì)胞層形態(tài)良好，結(jié)構(gòu)完整、緊密；將培養(yǎng)有Caco -2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有293T細(xì)胞的培養(yǎng)板中，并在插入槽上部和培養(yǎng)板底部加入培養(yǎng)液，37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中聯(lián)合培養(yǎng)24h。步驟(5)指標(biāo)檢測具體為吸取底部孵育液，收取Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞，100°C烘干，加入5mL濃硝酸和5滴30%的雙氧水，于80°C加熱，殘余物用I. 4M的硝酸液溶解，獲得消化液。用ICP-MS技術(shù)測定孵育液和消化液中鎘含量，以Caco-2細(xì)胞內(nèi)鎘、293T細(xì)胞內(nèi)鎘、底部孵育液鎘之和作為評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體的生物有效性。通過觀察Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、MTT比色、試劑盒測定LDH活性、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，以評(píng)價(jià)鎘對(duì)細(xì)胞的毒性。本發(fā)明將人結(jié)腸癌細(xì)胞系(Caco-2)細(xì)胞和人體腎胚T細(xì)胞系(293T)進(jìn)行聯(lián)合培養(yǎng)，建立聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型，通過測定細(xì)胞吸收鎘評(píng)價(jià)鎘蓄積對(duì)人體的生物有效性、通過觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)、MTT比色、LDH活性、細(xì)胞凋亡評(píng)價(jià)鎘蓄積對(duì)人體的毒性，并藉此建立一套用于食物重金屬污染物對(duì)人體生物有效性和毒性的聯(lián)合評(píng)價(jià)方法體系。即通過分析食物中重金屬在腸道的吸收率，并進(jìn)入相關(guān)器官的過程，研究機(jī)體整體生物學(xué)狀況和功能調(diào)節(jié)，從細(xì)胞水平進(jìn)行毒性效應(yīng)研究，為人體膳食安全預(yù)警提供依據(jù)。本發(fā)明方法的建立可快速、準(zhǔn)確、簡便的評(píng)價(jià)食物鎘積累對(duì)人體的生物有效性和毒性。與傳統(tǒng)的以食物中鎘蓄積量作為指標(biāo)評(píng)價(jià)其對(duì)人體的毒性相比，該發(fā)明具有更加準(zhǔn)確和高度模擬性的特點(diǎn)；與動(dòng)物鎘毒性試驗(yàn)相比，該發(fā)明具有操作簡單、試驗(yàn)條件易控制、污染小、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，并具有生物有效性和毒性聯(lián)合評(píng)價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。適合谷物、蔬菜和動(dòng)物性食物鎘蓄積的安全性評(píng)價(jià)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I :水稻鎘蓄積對(duì)人體的生物有效性和毒性(I)收集水稻籽粒，磨碎，依次通過PH2.0的胃蛋白酶消化液，37°C恒溫水浴箱里消化Ih ；pH7. 0的胰酶-膽汁榨取物消化液，37°C恒溫水浴箱里消化2h ;離心，收取上清液，將上清液高壓滅菌；(2)將上清液與培養(yǎng)液(不含鎘)均勻混合，制成混合液，吸取2. 5mL混合液加入已經(jīng)建立的聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)，吸取等滲的培養(yǎng)液2. 5mL加入293T細(xì)胞層上，繼續(xù)在37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ;若食物鎘蓄積量低，可進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)，最長繼續(xù)培養(yǎng)IOd ；(3)吸取底部孵育液收取Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞，100°C烘干，加入5mL濃硝酸和5滴30%的雙氧水，于80°C加熱，殘余物用I. 4M的硝酸液溶解，獲得消化液，用ICP-MS技術(shù)測定孵育液和消化液中鎘含量。
(Caco-2細(xì)胞內(nèi)鎘+293T細(xì)胞內(nèi)鎘+底部孵育液鎘)
鎘生物有效性(％) =X 100%
水稻籽粒鎘蓄積總量通過觀察Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞 的形態(tài)學(xué)、MTT比色和試劑盒檢測LDH活性、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，以評(píng)價(jià)鎘對(duì)細(xì)胞的毒性。實(shí)施例2 :動(dòng)物肝臟鎘蓄積對(duì)人體的生物有效性和毒性(I)將動(dòng)物肝臟煮熟，磨碎，依次通過pH2. O的胃蛋白酶消化液，37°C恒溫水浴箱里消化Ih ；pH7. O的胰酶-膽汁榨取物消化液，37°C恒溫水浴箱里消化2h ;離心，收取上清液，將上清液高壓滅菌；(2)將上清液與培養(yǎng)液(不含鎘)均勻混合，制成混合液，吸取2. 5mL混合液加入已經(jīng)建立的聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)，吸取等滲的培養(yǎng)液2. 5mL加入293T細(xì)胞層上，繼續(xù)在37°C二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h ;若食物鎘蓄積量低，可進(jìn)行慢性毒性試驗(yàn)，最長繼續(xù)培養(yǎng)IOd ；(3)吸取底部孵育液。收取Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞，100°C烘干，加入5mL濃硝酸和5滴30%的雙氧水，于80°C加熱，殘余物用I. 4M的硝酸液溶解，獲得消化液，用ICP-MS
技術(shù)測定孵育液和消化液中鎘含量。
(Caco-2細(xì)胞內(nèi)鎘+293T細(xì)胞內(nèi)鎘+底部孵育液鎘)
鎘生物有效性(％) =_ X 100%
肝臟中鎘蓄積總量通過觀察Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、MTT比色和試劑盒檢測LDH活性、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡，以評(píng)價(jià)鎘對(duì)細(xì)胞的毒性。
權(quán)利要求
1.ー種聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于包括以下步驟 (1)食物樣品消化和測定液的獲取 a.食物樣品收集后，磨碎，采用胃液和腸液依次消化； b.將消化混合液離心，收取上清液，高壓滅菌； (2)單獨(dú)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞 a.Caco-2細(xì)胞(人結(jié)腸癌細(xì)胞系)培養(yǎng)于六孔板插入槽的聚碳酸酯膜上； b.293T細(xì)胞(人胚腎T細(xì)胞系)培養(yǎng)于另一塊六孔板的底部； (3)Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng) 將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有293T細(xì)胞的六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h ； (4)鎘生物有效性和毒性評(píng)價(jià) 將食物樣品測定液置于聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)在293T細(xì)胞層上加入等滲的孵育液，繼續(xù)培養(yǎng)24h ;慢性毒性試驗(yàn)時(shí)，可最長聯(lián)合培養(yǎng)IOd ； (5)指標(biāo)檢測 a.用電感耦合等離子體質(zhì)譜(ICP-MS)技術(shù)測定細(xì)胞吸收的鎘量； b.通過觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、MTT比色、LDH活性、細(xì)胞凋亡以測定鎘對(duì)細(xì)胞的毒性。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于步驟(I)食物樣品消化和測定液獲取方法具體包括以下步驟收集待檢測的食物樣品，磨碎，依次通過PH2. O的胃蛋白酶消化液，37°C恒溫水浴箱里消化Ih ；pH7. O的胰酶-膽汁搾取物消化液，37°C恒溫水浴箱里消化2h ;離心，收取上清液作為測定液；將測定液高壓滅菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于步驟(2) Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)方法具體為具體為Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)于25cm2培養(yǎng)瓶中，并定期換液、傳代和細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察，保證細(xì)胞培養(yǎng)過程中不受污染，形態(tài)結(jié)構(gòu)正常；達(dá)到試驗(yàn)需要的數(shù)量后，將Caco-2細(xì)胞轉(zhuǎn)入六孔培養(yǎng)板的插入槽上培養(yǎng)；293T細(xì)胞轉(zhuǎn)入另ー個(gè)六孔培養(yǎng)板的底部培養(yǎng)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于步驟(3) Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞聯(lián)合培養(yǎng)方法具體為通過測定Caco-2細(xì)胞層甘露醇透過率和細(xì)胞跨膜電阻值，以評(píng)價(jià)Caco-2細(xì)胞層的完整性，甘露醇透過率低于O. 5% · IT1 · cm_2，細(xì)胞跨膜電阻值穩(wěn)定高于250 Ω. cm2 ;通過相差顯微鏡下觀察293T細(xì)胞層形態(tài)良好，結(jié)構(gòu)完整、緊密；將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有293T細(xì)胞的培養(yǎng)板中，并在插入槽上部和培養(yǎng)板底部加入培養(yǎng)液，37°Cニ氧化碳培養(yǎng)箱中聯(lián)合培養(yǎng) 24h。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型建立方法，其特征在于步驟(5)指標(biāo)檢測具體為吸取底部孵育液，收取Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞，100°C烘干，加入5mL濃硝酸和5滴30%的雙氧水，于80°C加熱，殘余物用I. 4M的硝酸液溶解，獲得消化液；用ICP-MS技術(shù)測定孵育液和消化液中鎘含量，以Caco-2細(xì)胞內(nèi)鎘、293T細(xì)胞內(nèi)鎘、底部孵育液鎘之和作為評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體的生物有效性。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種聯(lián)合評(píng)價(jià)食物鎘蓄積對(duì)人體生物有效性和毒性的模型建立方法，包括以下步驟(1)食物樣品消化和測定液的獲取a.食物樣品收集后，磨碎，采用胃液和腸液依次消化；b.將消化混合液離心，收取上清液，高壓滅菌；(2)單獨(dú)培養(yǎng)Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞；(3)Caco-2細(xì)胞和293T細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)將培養(yǎng)有Caco-2細(xì)胞的插入槽移入培養(yǎng)有293T細(xì)胞的六孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24h；(4)鎘生物有效性和毒性評(píng)價(jià)將食物樣品測定液置于聯(lián)合培養(yǎng)模型的Caco-2細(xì)胞層上，同時(shí)在293T細(xì)胞層上加入等滲的孵育液，繼續(xù)培養(yǎng)24h；慢性毒性試驗(yàn)時(shí)，可最長聯(lián)合培養(yǎng)10d；(5)指標(biāo)檢測。本發(fā)明具有操作簡單、試驗(yàn)條件易控制、污染小、經(jīng)濟(jì)、結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，并具有生物有效性和毒性聯(lián)合評(píng)價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。適合谷物、蔬菜和動(dòng)物性食物鎘蓄積的安全性評(píng)價(jià)。
文檔編號(hào)G01N33/02GK102680654SQ20111042798
公開日2012年9月19日 申請(qǐng)日期2011年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月19日
發(fā)明者何萬領(lǐng), 張才, 張紀(jì)亮, 李健, 李元曉, 李旺, 李曉麗, 楊盼盼 申請(qǐng)人:河南科技大學(xué)