專利名稱：富硒谷物中硒形態(tài)的測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種富硒谷物硒形態(tài)的測定方法，特別是涉及一種富硒谷物進行前處理后進行硒形態(tài)的測定方法。
背景技術(shù)：
硒是人體必需的微量元素之一，是谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的組成成分， 具有抗氧化、抗癌、防衰老、提高人體免疫力、保護心腦血管等作用(Rotruck J T，Pope A L, Ganther H E, et al Selenium :biochemical role as a component of glutathione peroxidase. Science, 1973，179，588-590.)。我國有 2/3 的地區(qū)缺硒，其中有 1/3 的地區(qū)為嚴重缺硒地區(qū)。人和動物體缺硒會導致克山病，大骨節(jié)病，動物的白肌病等，除此以外一些癌癥，地方性甲狀腺障礙等疾病也與低硒環(huán)境密切相關(guān)(Ip C. Lessons from basic research in selenium and cancer prevention. Journal Nutrition,1998,128, 1845-1854.)。人們?nèi)粘ｏ嬍持械奈o機硒和有機硒，其中無機硒毒性較大，中毒量與需要量的界限非常接近，而且吸收和利用率差，生物有效性低，因而被嚴格限制其使用量。 有機硒更利于人體吸收利用，生物活性強，毒性低(盧嵐，魯兵，王春娥.保健食品中有機硒和無機硒的分析探討.中國衛(wèi)生檢驗雜志.2010，2(K4) :767-769.),是更高效、安全的人體補硒形式。硒的生物學功能的發(fā)揮主要依賴于其存在形態(tài)，特別是有機硒(硒代氨基酸) 的形態(tài)。因此，準確的檢測分析硒代氨基酸的形態(tài)具有重大的意義，不僅能指導消費者科學補硒，還能進一步了解硒的生物化學特性和硒在自然界遷移變化的規(guī)律。目前，我國測定有機硒含量的方法主要為差減法(秦昉.植物中有機硒含量的測定.無錫輕工業(yè)大學學報.1998，17 (4) :74-77.),差減法的原理是先利用不同的試劑將待測樣品中的有機硒和無機硒分離，因無機硒主要以硒酸根(Se042_)和亞硒酸根(Se032_) 陰離子形式存在，易溶于水。有機硒主要是與蛋白質(zhì)、纖維素和碳水化合物中的C、N等結(jié)合，以大分子的有機物形態(tài)存在，所以可利用環(huán)己烷或甲苯等有機溶劑萃取出有機硒，再通過測定總硒和無機硒的含量，差減得到有機硒的含量。此方法操作步驟繁瑣，重復性差，只能得到有機硒的總量，對于具體的有機硒形態(tài)并不清楚，且所用的環(huán)己烷、甲苯等有機溶劑存在一定的毒性。硒形態(tài)研究屬于前沿研究，目前國內(nèi)、外并無硒形態(tài)研究方法的標準。本發(fā)明利用溫和的提取方式，提取含硒化合物，利用酶水解含硒化合物后再利用液相色譜進行有效分離，最后利用高靈敏度的原子熒光(AM)進行不同形態(tài)硒的測定，最后得到有機硒的含量。此方法的優(yōu)點是能測定富硒植物中不同形態(tài)的硒含量和有機硒含量，能進一步了解植物富集吸收硒的轉(zhuǎn)化規(guī)律，此方法簡單易操作，重復性好，精確度高，所用試劑無毒、 無污染。國外對硒形態(tài)測定的前處理方法也有報道，Selenium species in leaves of chicory,dandelion,lamb' s lettuce and parsley(Darja Mazej,Vekoslava Stibilj,et al. Food Chemistry, 2008,107 :75-83.)公開了一種單獨利用蛋白酶水解樣品然后進行硒形態(tài)測試的方法，該方法蛋白酶用量與樣品的比例為1 2 1 5，成本很高。
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所以，開發(fā)一種針對以硒代氨基酸為主要分析目標、低成本高效率的樣品前處理及測試方法十分有必要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有硒形態(tài)測定技術(shù)特別是提取技術(shù)中存在的不足，提供一種操作簡便，提取效率高，重復性好，成本低的富硒谷物中硒形態(tài)的測定方法。為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的這些問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下一種富硒谷物中硒形態(tài)的測定方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)富硒谷物的預處理使用提取緩沖液Tris-HCl對粉碎處理后的富硒谷物樣品進行提取，提取處理后先加入有效量的淀粉酶進行水解，然后依次加入有效量的蛋白酶K、 蛋白酶XIV進行水解提取得到待測樣品溶液；(2)采用氫化物發(fā)生——原子熒光光譜法與高效液相色譜法聯(lián)用分別對標準硒形態(tài)溶液和待測樣品溶液進行測定；用峰高或峰面積進行定量，用數(shù)據(jù)處理中的外標法，繪制標準工作曲線后保存，然后將樣品峰積分處理，利用外標法校正，按照公式(1)可計算得到待測樣品溶液中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)的含量；X = CXV/m (1)其中X為樣品中待測物質(zhì)的含量，單位為微克每千克(yg/kg) ；C為待測液中該物質(zhì)的濃度，單位為微克每升(yg/L) ；V為測定液體總體積，單位為毫升(mL) ；F為稀釋倍數(shù)；m為稱樣質(zhì)量(體積)，單位為克(g/mL)。優(yōu)選的，所述方法中提取緩沖液Tris-HCl的濃度為lOOmmol/L，pH7. 5，谷物樣品與提取液的比例(m V)為1 25 1 100。優(yōu)選的，所述方法中提取方法采用超聲提取，提取時間為10 30min。優(yōu)選的，所述方法中淀粉酶與谷物樣品的重量比例為1 10 1 40。優(yōu)選的，所述方法中蛋白酶K與固體谷物樣品的比例(m m)為1 20 1 100 ； 水解溫度控制在40 55°C。優(yōu)選的，所述方法中蛋白酶XIV與谷物樣品的比例(m m)為1 20 1 100 ；
水解溫度控制在30 45°C。優(yōu)選的，所述方法中水解處理后樣品溶液在0 10°C下，離心處理后上清液過 0. 2 0. 5 μ m的濾膜，制得待測上清液。優(yōu)選的，所述方法中高效液相色譜法和氫化物發(fā)生——原子熒光光譜法聯(lián)用時液相色譜及原子熒光條件為流動相(40mmol/L(NH4) 2HP04,pH 6. 0)；流速 lmL/min ；進樣體積 100 μ L ；蠕動泵轉(zhuǎn)速65rpm ；燈電流/輔陰極100mA，45mA ；光電倍增管負高壓300V ；載氣流速300mL/min ； 屏蔽氣流速700mL/min。優(yōu)選的，所述方法中高效液相色譜法和氫化物發(fā)生——原子熒光光譜法聯(lián)用時氫化物發(fā)生條件是還原劑成分0.35 % NaOH+1. 2 % NaBH4,流速:6mL/min ；氧化劑成分0. 35 % Na0H+0. 8% H2O2，流速6mL/min ；載流10% HCl，流速6mL/min。
優(yōu)選的，所述方法開機后對液相色譜及原子熒光進行設(shè)置，待儀器穩(wěn)定后，先做標準曲線，然后測定處理好的樣品溶液，在上述條件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留時間依次為2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待測樣品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在士5%之內(nèi)即認為為該待測定物質(zhì)。本發(fā)明涉及一種富硒谷物中硒形態(tài)的測定方法，是利用超聲提取后，再結(jié)合溫和的酶水解，使富硒植物中的含硒化合物充分水解并利用儀器進行硒形態(tài)的測定。所述的以硒代氨基酸為主要硒形態(tài)指標的測定方法方法，步驟描述如下(1)先稱取粉碎過篩的富硒谷物于塑料離心管中，加入提取緩沖液 Tris-HCl (100mmol/L，pH7. 5)，混勻。兩者的比例(m V)為 1 25 1 100 ；(2)將混合液放入超聲清洗器超聲提取10 30min ；(3)再先加入淀粉酶水解Ih后，再加入蛋白酶K，50°C，一并恒溫振蕩(轉(zhuǎn)速150 200rpm，使塑料離心管中的液體能充分振蕩)提取4 12h。淀粉酶與秤取的富硒谷物的比例(m m)為1 10 1 40，蛋白酶K與秤取的樣品的比例(m m)為1 20 1 200 ；(4)再加入蛋白酶XIV，37°C，恒溫振蕩(轉(zhuǎn)速150 200rpm，使塑料離心管中的液體能充分振蕩)提取4 12h，蛋白酶XIV與秤取的樣品的比例為1 20 1 200 ；(5) 1 4步中獲得的溶液在4°C下，每分鐘轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)，離心30min，取上清液過 0. 22 μ m的濾膜，得到待測溶液。(6)設(shè)定液相色譜及原子熒光條件流動相(40mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0)；流速 lmL/min ；進樣體積 100 μ L ；蠕動泵轉(zhuǎn)速65rpm ；燈電流/輔陰極100mA，45mA ；光電倍增管負高壓300V ；載氣流速300mL/ min ； 屏蔽氣流速700mL/min。氫化物發(fā)生條件還原劑成分0.35 % NaOH+1. 2 % NaBH4,流速:6mL/min ；氧化劑成分0. 35 % NaOH+O. 8% H202，流速6mL/min ；載流10% HCl，流速6mL/min。(7)開機后按上述條件對液相色譜及原子熒光進行設(shè)置，待儀器穩(wěn)定后，先做標準曲線，然后測定處理好的樣品溶液，在上述條件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留時間依次為2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待測樣品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在士5%之內(nèi)即認為為該待測定物質(zhì)。(8)用峰高或峰面積進行定量，用數(shù)據(jù)處理中的外標法，繪制標準工作曲線后保存，然后將樣品峰積分處理，利用外標校正，即可得到待測溶液中硒代胱氨酸6e-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys) Je (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的濃度。(9)按照公式⑴可計算得到待測樣品中硒代胱氨酸6e-Cys2)、硒甲基半胱氨酸 (SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的濃度。X = CXV/m..................(1)
式中X-樣品中待測物質(zhì)的含量，單位為微克每千克(μ g/kg)；C-待測液中該物質(zhì)的濃度，單位為微克每升(μ g/L)；V-測定液體總體積，單位為毫升(mL)；F-稀釋倍數(shù)；m-稱樣質(zhì)量(體積)，單位為克(g/mL)。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明具有以下有益效果1、選擇溫和的提取試劑pH近中性的Tris-HCl，使含硒化合物在提取過程中形態(tài)
保持穩(wěn)定。2、提取過程中采用超聲提取，使含硒化合物更多的溶入提取液中，提高了提取效率。3、超聲提取在加酶之前，一是不破壞酶的結(jié)構(gòu)，影響酶的活性，二是使含硒化合物更多的溶入提取液后，更利于酶的水解。4、先加入淀粉酶能促進蛋白酶水解含硒化合物。5、使用兩種蛋白酶水解，含硒化合物水解更徹底，與一種蛋白酶水解相比，提取效率提高且均可達85%以上，所需使用的蛋白酶的量更少，節(jié)約了成本。6、本發(fā)明方法簡單易操作，重復性好，所用試劑無毒、無污染。


下面結(jié)合附圖及實施例對本發(fā)明作進一步描述圖1為硒形態(tài)標準分離譜圖；譜圖中揭示了硒代胱氨酸(％-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、％ (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的依次出峰順序、保留時間及濃度梯度。圖2為本發(fā)明實施例1富硒玉米的測定結(jié)果圖；由圖2可知，采用本發(fā)明的提取條件及利用高靈敏度的形態(tài)分析儀器可測定富硒玉米中僅存在硒蛋氨酸，根據(jù)峰面積計算可得到硒蛋氨酸的含量及占總硒的比例。圖3為本發(fā)明實施例2富硒大米的測定結(jié)果圖；由圖3可知，采用本發(fā)明的提取條件及利用高靈敏度的形態(tài)分析儀器可測定富硒大米中僅存在硒蛋氨酸。圖4為本發(fā)明實施例3富硒小麥的測定結(jié)果圖；由圖4可知，采用本發(fā)明的提取條件及利用高靈敏度的形態(tài)分析儀器可測定富硒小麥中僅存在硒甲基半胱氨酸和硒代蛋氨酸兩種硒氨基酸形態(tài)。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不能用來限制本發(fā)明的范圍。實施例中采用的實施條件可以根據(jù)具體廠家的條件作進一步調(diào)整，未說明的實施條件通常為常規(guī)實驗中的條件。人體補充硒的主要來源是食物，谷物是人體補充硒的主要來源之一，富硒谷物因生產(chǎn)的方式不同，其中硒的含量及存在形式也存在很大的差別，因此對富硒谷物中硒及硒的存在形式，特別是硒代氨基酸的測定有利于消費者選擇安全、有效的富硒食品進行補硒， 本發(fā)明實施例選擇了富硒玉米、富硒大米及富硒小麥進行前處理及硒形態(tài)的測定。
實施例1富硒玉米中硒形態(tài)測定對富硒玉米中的硒形態(tài)測定前處理方法步驟進行了優(yōu)化，優(yōu)化過程及結(jié)果如下稱取0. 2g富硒玉米樣品于15mL塑料離心管中，加入5mL提取緩沖液Tris-HCl， 超聲提取20min，加入淀粉酶10mg，再加入0. 5mg蛋白酶K，50°C，恒溫振蕩培養(yǎng)他后加入 0. 5mg蛋白酶XIV，370C，恒溫振蕩培養(yǎng)他，接著4°C下，每分鐘轉(zhuǎn)速10000轉(zhuǎn)，離心30min，上清液過0. 22 μ m的濾膜后，制備得到上機待測液。將液相色譜條件設(shè)置為流動相(40mmol/L(NH4)2HP04，pH 6. 0)；流速lmL/min ； 進樣體積100 μ L ；蠕動泵轉(zhuǎn)速65rpm ；燈電流/輔陰極100mA，45mA ；光電倍增管負高壓 300V ；載氣流速300mL/min ；屏蔽氣流速700mL/min。氫化物發(fā)生條件設(shè)置為還原劑成分0. 35% NaOH+1. 2% NaBH4，流速:6mL/min ；氧化劑成分0. 35% NaOH+O. 8% H202，流速 6mL/min ；載流10% HCl，流速6mL/min。開機后按上述條件對液相色譜及原子熒光進行設(shè)置，待儀器穩(wěn)定后，先做標準曲線，然后測定處理好的樣品溶液，在上述條件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留時間依次為2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待測樣品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在士5%之內(nèi)即認為為該待測定物質(zhì)。用峰高或峰面積進行定量，用數(shù)據(jù)處理中的外標法，繪制標準工作曲線后保存，然后將樣品峰積分處理，利用外標校正，即可得到待測溶液中硒代胱氨酸6e-Cys2)、硒甲基半胱氨酸GeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的濃度。并根據(jù)公式計算樣品硒形態(tài)數(shù)據(jù)。表1優(yōu)化條件篩選及效果
權(quán)利要求
1.一種富硒谷物中硒形態(tài)的測定方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)富硒谷物的預處理使用提取緩沖液Tris-HCl對粉碎處理后的富硒谷物樣品進行提取，提取處理后先加入有效量的淀粉酶進行水解，然后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV進行水解提取得到待測樣品溶液；(2)采用氫化物發(fā)生——原子熒光光譜法與高效液相色譜法聯(lián)用分別對標準硒形態(tài)溶液和待測樣品溶液進行測定；用峰高或峰面積進行定量，用數(shù)據(jù)處理中的外標法，繪制標準工作曲線后保存，然后將樣品峰積分處理，利用外標法校正，按照公式(1)可計算得到待測樣品溶液中硒代胱氨酸(k_Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys), Se (IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)的含量；X=CXV/m (1)其中X為樣品中待測物質(zhì)的含量，單位為微克每千克(μ g/kg);C為待測液中該物質(zhì)的濃度，單位為微克每升(μ g/L);V為測定液體總體積，單位為毫升(mL); F為稀釋倍數(shù)； m為稱樣質(zhì)量(體積)，單位為克(g/mL)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取緩沖液Tris-HCl的濃度為100 mmol/L，pH7. 5，谷物樣品與提取液的比例(m:V)為1:25 1:100。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取方法采用超聲提取，提取時間為1(T30 min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中淀粉酶與谷物樣品的重量比例為1 :10 1 :40ο
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶K與固體谷物樣品的比例(m:m)為1 :20 1 :100 ；水解溫度控制在40 55°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶XIV與谷物樣品的比例 (m:m)為1 :20 1 :100 ；水解溫度控制在30 45°C。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中水解處理后樣品溶液在0 10°C下，離心處理后上清液過0. 2 0. 5 μ m的濾膜，制得待測上清液。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色譜法和氫化物發(fā)生——原子熒光光譜法聯(lián)用時液相色譜及原子熒光條件為流動相(40 mmoVL(NH4)2HPO4, pH 6. 0)；流速 1 mL/min ；進樣體積 100 μ L ；蠕動泵轉(zhuǎn)速65 rpm ；燈電流/輔陰極100mA，45mA ；光電倍增管負高壓300V ；載氣流速300mL/min ； 屏蔽氣流速700mL/min。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色譜法和氫化物發(fā)生——原子熒光光譜法聯(lián)用時氫化物發(fā)生條件是還原劑成分0. 35%Na0H+l. 2%NaBH4，流速6 mL/min ；氧化劑成分 0. 35%Na0H+0. 8%H202，流速6 mL/min ；載流10% HCl，流速6 mL/min。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于所述方法開機后對液相色譜及原子熒光進行設(shè)置，待儀器穩(wěn)定后，先做標準曲線，然后測定處理好的樣品溶液，在上述條件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCyS)、k(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留時間依次為2.6 min, 3. 2 min, 4.0 min, 5.0 min，待測樣品中的硒代胱氨酸(Se_Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色譜峰保留時間與標準溶液相比變化范圍在士5%之內(nèi)即認為為該待測定物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種富硒谷物中硒形態(tài)的測定方法，其特征在于所述方法包括以下步驟(1)富硒谷物的預處理使用提取緩沖液Tris-HCl對粉碎處理后的富硒谷物樣品進行提取，提取處理后先加入有效量的淀粉酶進行水解，然后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV進行水解提取得到待測樣品溶液；(2)采用氫化物發(fā)生——原子熒光光譜法與高效液相色譜法聯(lián)用分別對標準硒形態(tài)溶液和待測樣品溶液進行測定。該方法簡單易操作，重復性好，所用試劑無毒、無污染。
文檔編號G01N30/02GK102520089SQ201110428250
公開日2012年6月27日 申請日期2011年12月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月20日
發(fā)明者朱元元 申請人:蘇州硒谷科技有限公司