專(zhuān)利名稱(chēng)：激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種高分子纖維可視化的制備方法，特別是涉及一種激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，用于直接觀察細(xì)胞和高分子纖維相互作用，屬于激光共聚焦顯微鏡成像領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
激光共聚焦顯微鏡是在熒光顯微鏡成像基礎(chǔ)上加裝了激光掃描裝置，利用計(jì)算機(jī)進(jìn)行圖像處理，在光學(xué)成像的基礎(chǔ)上將分辨率提高了 30-40%，擴(kuò)大了傳統(tǒng)熒光顯微鏡的運(yùn)用范圍，成為形態(tài)學(xué)，分子生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)，藥理學(xué)，遺傳學(xué)等領(lǐng)域中新一代強(qiáng)有力的研究工具。目前為止，在組織工程領(lǐng)域，激光共聚焦顯微鏡主要用于觀察:(1)各種細(xì)胞活細(xì)胞群體的數(shù)量、分布和形態(tài)；(2)細(xì)胞及組織的內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)的熒光圖像或亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的的熒光圖像；(3)細(xì)胞內(nèi)部活細(xì)胞間的信號(hào)傳遞，如亞細(xì)胞水平上觀察諸如Ca2+、pH值，膜電位等生理信號(hào)；。(4)斷層掃描與三維重建等模擬成像能力。組織工程領(lǐng)域中，往往需要將細(xì)胞種植在生物材料基質(zhì)(如高分子纖維)上，通過(guò)熒光染色后，再傳統(tǒng)的進(jìn)行激光共聚焦掃描顯微鏡觀察的觀察。在觀察中，只有細(xì)胞能通過(guò)熒光染料顯現(xiàn)出，而生物材料基質(zhì)無(wú)法顯示，細(xì)胞在高分子纖維上生長(zhǎng)，只是單純的將細(xì)胞染色，直接觀察細(xì)胞在高分子纖維上的數(shù)量、分布及形態(tài)。這種忽視了生物材料基質(zhì)(如高分子纖維)在激光共聚焦掃描顯微鏡中顯現(xiàn)的觀察方法，使的其得到的熒光圖片缺乏高分子纖維的承托，圖像缺乏空間感。現(xiàn)在的研究中，沒(méi)有刻意將生物材料基質(zhì)在激光共聚焦顯微鏡中可視化便于觀察的報(bào)道。以高分子纖維作為生物材料基質(zhì)為例，通常會(huì)采用下面兩種方法表示:(1)高分子纖維用激光共聚焦顯微鏡的光學(xué)明場(chǎng)顯示。由于高分子纖維不喊任何熒光物質(zhì)，在常規(guī)的激光共聚焦顯微鏡設(shè)定激光的激發(fā)下均無(wú)熒光圖像的采集，只能用明場(chǎng)表不(Mo等,2004)。明場(chǎng)圖片以白色為底色，突光圖片以黑色為底色，_二者重置后，圖像更模糊，所以少有報(bào)道將兩種圖片重疊；同時(shí)，激光共聚焦顯微鏡的明場(chǎng)成像特點(diǎn)要求材料的透光性必須較好，透光性越好，成像效果越清晰，透光性越差，成像效果越模糊，直至最終完全沒(méi)有成像效果。這導(dǎo)致了較厚的高分子纖維和其他生物材料基質(zhì)無(wú)法觀察。(2)小分子物質(zhì)自組裝，導(dǎo)致高分子纖維間接成像。存在一大類(lèi)高分子纖維間接成像的報(bào)道，將一些小分子物質(zhì)，如有利于細(xì)胞粘附的精氨酸(R)-甘氨酸(G)-天冬氨酸(D)(RGD)序列，通過(guò)自組裝的形式粘附在高分子纖維表面加強(qiáng)生物相容性。為了觀察RGD序列是否粘附，常常用熒光物質(zhì)標(biāo)記上述小分子。當(dāng)RGD序列大量粘附于高分子纖維表面，高分子纖維在激光共聚焦顯微鏡下觀察為明顯的熒光成像(Grafahrend等，2010)。雖然本方法可以間接直接使高分子纖維成像。但其初衷并非是將高分子纖維可視化便于激光共聚焦顯微鏡觀察，而是用于判斷小分子自組裝能力；同時(shí)，高分子纖維是通過(guò)小分子與細(xì)胞間接地相互作用，并非高分子纖維直接與細(xì)胞直接作用，不利于直接判定高分子纖維對(duì)細(xì)胞的數(shù)量、分布和形態(tài)等的影響。無(wú)論是哪種方法都不能真正地清晰地在激光共聚焦顯微鏡下直接觀察生物材料基質(zhì)與細(xì)胞。所以，為了增強(qiáng)激光共聚焦顯微鏡圖片的空間感，解決上述問(wèn)題，需要一種能普遍地將生物材料基質(zhì)(如高分子纖維)在激光共聚焦顯微鏡下可視化的制備方法，用于觀察細(xì)胞的同時(shí)，直接觀察生物材料基質(zhì)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在激光共聚焦顯微鏡下高分子纖維的可視化的方法，可直接用激光共聚焦顯微鏡觀察生物材料，及同時(shí)觀察細(xì)胞在生物材料上生長(zhǎng)情況。本方法的目的在于實(shí)現(xiàn)4種可能:(I)將高分子纖維染上顏色，可以再在激光共聚焦顯微鏡下直接觀察高分子纖維的形貌成為可能；(2)在同一時(shí)間，在材料高分子纖維可視化的同時(shí)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡直接觀察固定后的細(xì)胞在高分子纖維上的數(shù)量、分布和形態(tài)成為可能；(3)在同一時(shí)間，在材料高分子纖維可視化的同時(shí)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡直接觀察活細(xì)胞在高分子纖維上的數(shù)量、分布和形態(tài)成為可能；(4)利用激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙，在同一位置，在材料高分子纖維可視化的同時(shí)，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡，連續(xù)地直接觀察活細(xì)胞在高分子纖維上的數(shù)量、分布和形態(tài)成為可能。為達(dá)到以上目的，本發(fā)明采用了如下的方法:一種激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于包括如下步驟:(I)高分子材料溶解在有機(jī)溶劑中，加熱并冷凝回流至共聚物完全溶解，形成溶液I;(2)溶液I中加入熒光染料A，攪拌溶解至完全溶解，形成溶液II ；(3)溶液II裝入到噴霧裝置中的玻璃注射器中，進(jìn)行靜電紡絲的制備，得到包裹了熒光染料A的高分子纖維；(4)所制備的高分子纖維浸泡在水中，常溫下恒溫?fù)u床搖晃3 7天，以洗去高分子纖維表面殘余的熒光染料A ;(5)將處理后的高分子纖維進(jìn)行紫外滅菌處理I 2小時(shí)；(6)將滅菌處理的高分子纖維接種上細(xì)胞，37°C，5.0%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中
培養(yǎng)；(7)將細(xì)胞用熒光染料標(biāo)記后，用激光共聚焦顯微鏡觀察，可以選擇如下方法中的一種:a)將細(xì)胞用多聚甲醛或甲醛固定后，用熒光染料B將細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡直接觀察到高分子纖維及其表面生長(zhǎng)的細(xì)胞；b)將細(xì)胞直接用熒光染料C進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡直接觀察到高分子纖維及其表面生長(zhǎng)的活細(xì)胞；c)將細(xì)胞直接用熒光染料D進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記，在激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙中繼續(xù)培養(yǎng)，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡時(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察高分子纖維及其表面生長(zhǎng)的細(xì)胞。步驟(I)所述有機(jī)溶劑為氯仿，二氯甲烷，N，N_ 二甲基甲酰胺，乙酸乙酯中的一種或其組合。溶液I中所述高分子材料的濃度為I 15% (g/100ml);溶液II中所述高分子材料的濃度為I 15% (g/100ml)，熒光染料A的濃度為0.05 0.5% (g/100ml)。所述靜電紡絲的制備具體操作如下:注射速率為0.1 0.6ml/小時(shí)，針尖正極與基片負(fù)極間產(chǎn)生5000 12000伏的高壓，針尖到接收裝置之間的距離為10 30mm，用玻璃片收集經(jīng)過(guò)靜電紡絲噴出高分子纖維,收集時(shí)間為15 120分鐘。所述熒光染料A為羅丹明B，異或硫氰羅丹明B，或其他對(duì)細(xì)胞沒(méi)有刺激作用的熒光染料，優(yōu)先選擇異硫氰羅丹明B。所述熒光染料B為標(biāo)記多聚甲醛或甲醛固定后細(xì)胞的熒光染料，為鈣黃綠素，或鬼筆環(huán)肽，優(yōu)先選擇鬼筆環(huán)肽。所述熒光染料C為標(biāo)記活細(xì)胞的熒光染料，為鈣黃綠素乙酰甲酯，或二乙酸熒光素，優(yōu)先選擇二乙酸熒光素。所述熒光染料D為長(zhǎng)時(shí)間標(biāo)記活細(xì)胞的熒光染料，為鈣黃綠素乙酰甲酯，或二乙酸熒光素，優(yōu)先選擇鈣黃綠素乙酰甲酯。所述高分子材料為聚乳酸，聚3-羥基丁酸酯，聚乳酸-乙醇酸，聚己內(nèi)酯，聚(乳酸-乙烯酸)中的一種或其組合。所述高分子纖維的平均直徑為0.9 4.0 μ m。本發(fā)明涉及一種在激光共聚焦顯微鏡下高分子纖維的可視化的制備方法，可直接用激光共聚焦顯微鏡觀察高分子纖維及表面種植的細(xì)胞的生長(zhǎng)情況情況。高分子纖維包裹了熒光染料，可以通過(guò)激光共聚焦顯微鏡成像，與單純的細(xì)胞激光共聚焦圖片對(duì)比，有高分子纖維的承托，圖像更有空間感、畫(huà)面得更加真實(shí)。運(yùn)用此方法，可以在同一時(shí)間，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡直接觀察活細(xì)胞在高分子纖維上的數(shù)量、分布和形態(tài)；也可以利用激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙，在同一位置，連續(xù)地直接觀察活細(xì)胞在高分子纖維上的數(shù)量、分布和形態(tài)成為可能。


圖1為包裹了異硫氰羅丹明B的納米纖維膜表面種植細(xì)胞的激光共聚焦顯微鏡圖。A為明場(chǎng)；B為細(xì)胞；C為納米纖維膜；D為圖A、B和C的重疊圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:稱(chēng)聚乳酸0.2g，將其置入20ml 二氯甲烷溶劑中，加熱并冷凝回流溶解I小時(shí)，直至共聚物完全溶解，溶液呈無(wú)色透明狀。在上述溶液中加入IOmg的紅色染料異硫氰羅丹明B，攪拌溶解至紅色透明液體。裝入到噴霧裝置中的玻璃注射器中，使得其注射速率為0.3ml/小時(shí)，針尖正極與基片負(fù)極間產(chǎn)生10000伏的高壓，針尖到接收裝置之間的距離為30mm，用玻璃片收集經(jīng)過(guò)靜電紡絲噴出的包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸纖維，收集時(shí)間為15分鐘。將上述包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸納米纖維浸泡在200ml純水中，常溫下恒溫?fù)u床搖晃3天，以洗去納米纖維表面殘余的異硫氰羅丹明B。將處理后的聚乳酸納米纖維進(jìn)行紫外滅菌2小時(shí)。將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上
5.0X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0 % 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)。用熒光染料熒光素雙醋酸酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到紅色的聚乳酸納米纖維對(duì)綠色熒光的活細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果表明，觀察到的紅色的聚乳酸納米纖維之間距離較疏松，培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)的樣品中均只有少量的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞粘附在紅色的聚乳酸納米纖維表面。紅色的聚乳酸納米纖維的平均直徑見(jiàn)表I。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表2。另將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上
5.0X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24小時(shí)。用熒光染料鈣黃綠素乙酰甲酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，在激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。繼續(xù)在調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡及時(shí)動(dòng)態(tài)觀察綠色熒光的活細(xì)胞在紅色的聚乳酸納米纖維的增殖和移動(dòng)。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表3。實(shí)施例2:稱(chēng)聚乳酸lg，將其置入18ml 二氯甲烷和2ml N, N- 二甲基甲酰胺的混合溶劑中，加熱并冷凝回流溶解I小時(shí)，直至共聚物完全溶解，溶液呈無(wú)色透明狀。在上述溶液中加入20mg的紅色染料異硫氰羅丹明B，攪拌溶解至紅色透明液體。裝入到噴霧裝置中的玻璃注射器中，使得其注射速率為0.3ml/小時(shí)，針尖正極與基片負(fù)極間產(chǎn)生5000伏的高壓，針尖到接收裝置之間的距離為20mm，用玻璃片收集經(jīng)過(guò)靜電紡絲噴出的包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸纖維，收集時(shí)間為120分鐘。將上述包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸納米纖維浸泡在400ml純水中，常溫下恒溫?fù)u床搖晃4天，以洗去納米纖維表面殘余的異硫氰羅丹明B。將處理后的聚乳酸納米纖維進(jìn)行紫外滅菌2小時(shí)。將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上
5.0X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0 % 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)。用熒光染料熒光素雙醋酸酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到紅色的聚乳酸納米纖維對(duì)綠色熒光的活細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果表明，觀察到的紅色的聚乳酸納米纖維之間距離較疏松，培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)的樣品中均只有少量的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞粘附在紅色的聚乳酸納米纖維表面。紅色的聚乳酸納米纖維的平均直徑見(jiàn)表I。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表2。另將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上
5.0X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24小時(shí)。用熒光染料鈣黃綠素乙酰甲酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，在激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。繼續(xù)在調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡及時(shí)動(dòng)態(tài)觀察綠色熒光的活細(xì)胞在紅色的聚乳酸納米纖維的增殖和移動(dòng)。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表3。實(shí)施例3:稱(chēng)Ig聚乳酸和Ig聚己內(nèi)酯，將其置入20ml 二氯甲烷溶劑中，加熱并冷凝回流溶解I小時(shí)，直至共聚物完全溶解，溶液呈無(wú)色透明狀。在上述溶液中加入IOOmg的紅色染料異硫氰羅丹明B，攪拌溶解至紅色透明液體。裝入到噴霧裝置中的玻璃注射器中，使得其注射速率為0.1ml/小時(shí)，針尖正極與基片負(fù)極間產(chǎn)生5000伏的高壓，針尖到接收裝置之間的距離為15mm，用玻璃片收集經(jīng)過(guò)靜電紡絲噴出的包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸纖維，收集時(shí)間為30分鐘。將上述包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸納米纖維浸泡在200ml純水中，常溫下恒溫?fù)u床搖晃3天，以洗去納米纖維表面殘余的異硫氰羅丹明B。將處理后的聚乳酸納米纖維進(jìn)行紫外滅菌2小時(shí)。將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上
5.0X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0 % 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)。用熒光染料熒光素雙醋酸酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到紅色的聚乳酸納米纖維對(duì)綠色熒光的活細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果表明，觀察到的紅色的聚乳酸納米纖維之間距離較疏松，培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)的樣品中均只有少量的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞粘附在紅色的聚乳酸納米纖維表面。紅色的聚乳酸納米纖維的平均直徑見(jiàn)表I。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表2。另將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上
5.0X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24小時(shí)。用熒光染料鈣黃綠素乙酰甲酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，在激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。繼續(xù)在調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡及時(shí)動(dòng)態(tài)觀察綠色熒光的活細(xì)胞在紅色的聚乳酸納米纖維的增殖和移動(dòng)。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表3。實(shí)施例4:稱(chēng)Ig聚乳酸和Ig聚己內(nèi)酯，將其置入20ml氯仿溶劑中，加熱并冷凝回流溶解I小時(shí)，直至共聚物完全溶解，溶液呈無(wú)色透明狀。在上述溶液中加入20mg的紅色染料異硫氰羅丹明B，攪拌溶解至紅色透明液體。裝入到噴霧裝置中的玻璃注射器中，使得其注射速率為0.6ml/小時(shí)，針尖正極與基片負(fù)極間產(chǎn)生12000伏的高壓，針尖到接收裝置之間的距離為15mm，用玻璃片收集經(jīng)過(guò)靜電紡絲噴出的包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸纖維，收集時(shí)間為45分鐘。將上述包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸納米纖維浸泡在200ml純水中，常溫下恒溫?fù)u床搖晃3天，以洗去納米纖維表面殘余的異硫氰羅丹明B。將處理后的聚乳酸納米纖維進(jìn)行紫外滅菌2小時(shí)。將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上
5.0X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0 % 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)。用熒光染料熒光素雙醋酸酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到紅色的聚乳酸納米纖維對(duì)綠色熒光的活細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果表明，觀察到的紅色的聚乳酸納米纖維之間距離較疏松，培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)的樣品中均只有少量的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞粘附在紅色的聚乳酸納米纖維表面。紅色的聚乳酸納米纖維的平均直徑見(jiàn)表I。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表2。另將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上
5.0X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24小時(shí)。用熒光染料鈣黃綠素乙酰甲酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，在激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。繼續(xù)在調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡及時(shí)動(dòng)態(tài)觀察綠色熒光的活細(xì)胞在紅色的聚乳酸納米纖維的增殖和移動(dòng)。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表3。實(shí)施例5:稱(chēng)Ig聚乳酸和0.5g聚3-羥基丁酸酯，將其置入20ml氯仿溶劑中，加熱并冷凝回流溶解I小時(shí)，直至共聚物完全溶解，溶液呈無(wú)色透明狀。在上述溶液中加入20mg的紅色染料異硫氰羅丹明B，攪拌溶解至紅色透明液體。裝入到噴霧裝置中的玻璃注射器中，使得其注射速率為0.6ml/小時(shí)，針尖正極與基片負(fù)極間產(chǎn)生12000伏的高壓，針尖到接收裝置之間的距離為10mm，用玻璃片收集經(jīng)過(guò)靜電紡絲噴出的包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸纖維，收集時(shí)間為30分鐘。將上述包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸納米纖維浸泡在200ml純水中，常溫下恒溫?fù)u床搖晃3天，以洗去納米纖維表面殘余的異硫氰羅丹明B。將處理后的聚乳酸納米纖維進(jìn)行紫外滅菌2小時(shí)。將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上5.0X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0 % 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)。用熒光染料熒光素雙醋酸酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到紅色的聚乳酸納米纖維對(duì)綠色熒光的活細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果表明，觀察到的紅色的聚乳酸納米纖維之間距離較疏松，培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)的樣品中均只有少量的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞粘附在紅色的聚乳酸納米纖維表面。紅色的聚乳酸納米纖維的平均直徑見(jiàn)表I。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表2。另將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上5.0X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24小時(shí)。用熒光染料鈣黃綠素乙酰甲酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，在激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙中繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。繼續(xù)在調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡及時(shí)動(dòng)態(tài)觀察綠色熒光的活細(xì)胞在紅色的聚乳酸納米纖維的增殖和移動(dòng)。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表3。實(shí)施例6:稱(chēng)聚乳酸2g，將其置入20ml氯仿溶劑中，加熱并冷凝回流溶解I小時(shí)，直至共聚物完全溶解，溶液呈無(wú)色透明狀。在上述溶液中加入20mg的紅色染料異硫氰羅丹明B，攪拌溶解至紅色透明液體。裝入到噴霧裝置中的玻璃注射器中，使得其注射速率為0.6ml/小時(shí)，針尖正極與基片負(fù)極間產(chǎn)生12000伏的高壓，針尖到接收裝置之間的距離為10mm，用玻璃片收集經(jīng)過(guò)靜電紡絲噴出的包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸納米纖維，收集時(shí)間為15分鐘。將上述包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸納米纖維浸泡在400ml純水中，常溫下恒溫?fù)u床搖晃3天，以洗去納米纖維表面殘余的異硫氰羅丹明B。將處理后的聚乳酸納米纖維進(jìn)行紫外滅菌2小時(shí)。將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上5.0X IO5個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0 % 二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)。用熒光染料熒光素雙醋酸酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到紅色的聚乳酸納米纖維對(duì)綠色熒光的活細(xì)胞的粘附能力。結(jié)果表明，觀察到的紅色的聚乳酸納米纖維之間距離較疏松，培養(yǎng)6小時(shí)和24小時(shí)的樣品中均只有少量的發(fā)綠色熒光的細(xì)胞粘附在紅色的聚乳酸納米纖維表面。紅色的聚乳酸納米纖維的平均直徑見(jiàn)表I。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表2。另將滅菌處理的聚乳酸納米纖維膜片剪切成一定大小的纖維膜片，分別接種上
5.0X IO4個(gè)細(xì)胞/cm2。37°C，5.0%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24小時(shí)。用熒光染
料鈣黃綠素乙酰甲酯將細(xì)胞標(biāo)記上綠色，在激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙中繼續(xù)
培養(yǎng)48小時(shí)。繼續(xù)在調(diào)整發(fā)射波長(zhǎng)和濾光片，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡及時(shí)動(dòng)態(tài)觀察綠
色熒光的活細(xì)胞在紅色的聚乳酸納米纖維的增殖和移動(dòng)。粘附在紅色的聚乳酸納米纖維的
細(xì)胞數(shù)量見(jiàn)表3。表I通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察到的包裹了異硫氰羅丹明B的聚乳酸納米纖維直
徑
權(quán)利要求
1.一種激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于包括如下步驟: (1)高分子材料溶解在有機(jī)溶劑中，加熱并冷凝回流至共聚物完全溶解，形成溶液I; (2)溶液I中加入熒光染料A，攪拌溶解至完全溶解，形成溶液II； (3)溶液II裝入到噴霧裝置中的玻璃注射器中，進(jìn)行靜電紡絲的制備，得到包裹了熒光染料A的高分子纖維； (4)所制備的高分子纖維浸泡在水中，常溫下恒溫?fù)u床搖晃3 7天，以洗去高分子纖維表面殘余的熒光染料A ; (5)將處理后的高分子纖維進(jìn)行紫外滅菌處理I 2小時(shí)； (6)將滅菌處理的高分子纖維接種上細(xì)胞，37°C，5.0%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng); (7)將細(xì)胞用熒光染料標(biāo)記后，用激光共聚焦顯微鏡觀察，可以選擇如下方法中的一種: a)將細(xì)胞用多聚甲醛或甲醛固定后，用熒光染料B將細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡 直接觀察到高分子纖維及其表面生長(zhǎng)的細(xì)胞； b)將細(xì)胞直接用熒光染料C進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡直接觀察到高分子纖維及其表面生長(zhǎng)的活細(xì)胞； c)將細(xì)胞直接用熒光染料D進(jìn)行活細(xì)胞標(biāo)記，在激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙中繼續(xù)培養(yǎng)，即可通過(guò)激光共聚焦顯微鏡時(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察高分子纖維及其表面生長(zhǎng)的細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于，步驟⑴所述有機(jī)溶劑為氯仿，二氯甲烷，N, N-二甲基甲酰胺，乙酸乙酯中的一種或其組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于，溶液I中所述高分子材料的濃度為I 15% (g/100ml);溶液II中所述高分子材料的濃度為I 15% (g/100ml)，熒光染料A的濃度為0.05 0.5% (g/100ml)。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于，所述靜電紡絲的制備具體操作如下:注射速率為0.1 0.6ml/小時(shí)，針尖正極與基片負(fù)極間產(chǎn)生5000 12000伏的高壓，針尖到接收裝置之間的距離為10 30mm，用玻璃片收集經(jīng)過(guò)靜電紡絲噴出高分子纖維,收集時(shí)間為15 120分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于，所述熒光染料A為羅丹明B，異或硫氰羅丹明B，或其他對(duì)細(xì)胞沒(méi)有刺激作用的熒光染料，優(yōu)先選擇異硫氰羅丹明B。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于，所述熒光染料B為標(biāo)記多聚甲醛或甲醛固定后細(xì)胞的熒光染料，為鈣黃綠素，或鬼筆環(huán)肽，優(yōu)先選擇鬼筆環(huán)肽。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于，所述熒光染料C為標(biāo)記活細(xì)胞的熒光染料，為鈣黃綠素乙酰甲酯，或二乙酸熒光素，優(yōu)先選擇二乙酸熒光素。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于，所述熒光染料D為長(zhǎng)時(shí)間標(biāo)記活細(xì)胞的熒光染料，為鈣黃綠素乙酰甲酯，或二乙酸熒光素，優(yōu)先選擇鈣黃綠素乙酰甲酯。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于，所述高分子材料為聚乳酸，聚3-羥基丁酸酯，聚乳酸-乙醇酸，聚己內(nèi)酯，聚(乳酸-乙烯酸)中的一種或其組合。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于，所述高分子纖維的平均直徑為0.9 4.0μ m。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種激光共聚焦掃描顯微鏡高分子纖維可視化的制備方法，其特征在于包括如下步驟高分子材料溶解在有機(jī)溶劑中，加入熒光染料，進(jìn)行靜電紡絲的制備，得到包裹了熒光染料的高分子纖維；將制備的高分子纖維浸泡在水中，洗去表面殘余的熒光染料；進(jìn)行紫外滅菌；接種上細(xì)胞，將細(xì)胞用熒光染料標(biāo)記后，用激光共聚焦顯微鏡觀察。與單純的細(xì)胞激光共聚焦圖片對(duì)比，有高分子纖維的承托，圖像更有空間感、畫(huà)面得更加真實(shí)。運(yùn)用此方法，可以在同一時(shí)間，通過(guò)激光共聚焦顯微鏡直接觀察活細(xì)胞在高分子纖維上的數(shù)量、分布和形態(tài)；也可以利用激光共聚焦顯微鏡配套的活細(xì)胞培養(yǎng)艙，在同一位置，連續(xù)地直接觀察活細(xì)胞在高分子纖維上的數(shù)量、分布和形態(tài)成為可能。
文檔編號(hào)G01N1/30GK103175723SQ20111043661
公開(kāi)日2013年6月26日 申請(qǐng)日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者魏岱旭, 鐘建, 閆志強(qiáng), 何丹農(nóng) 申請(qǐng)人:上海納米技術(shù)及應(yīng)用國(guó)家工程研究中心有限公司