專利名稱：肌紅蛋白檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫學(xué)領(lǐng)域，涉及一種免疫檢測試劑，進(jìn)一步地，本發(fā)明涉及一種肌紅蛋白檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
肌紅蛋白(myoglobin，MB)是骨骼肌和心肌特異性氧結(jié)合蛋白，分子量為17. 8kD， 由于分子量較小，當(dāng)心肌或骨骼肌損傷時(shí)，MB會(huì)從肌肉組織釋放到循環(huán)血中，并且能經(jīng)腎小球?yàn)V過，出現(xiàn)在尿中。因此血液和尿中MB測定可用于某些肌病和心臟病的診斷，如急性心肌梗死(AMI)、急性肌損傷、急慢性腎衰竭、嚴(yán)重充血性心力衰竭、長時(shí)間休克、肌營養(yǎng)不良、 肌萎縮和多發(fā)性肌炎等疾病。AMI是一種嚴(yán)重危及人類生命的疾病，目前AMI檢測的主要生化標(biāo)志物有肌酸磷酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDL)、心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、肌紅蛋白和心肌肌鈣蛋白I (cTnl)等，但CK-MB、LDL、cTnT、cTnl在診斷心肌梗死時(shí)的敏感性都不如MB高。MB在 AMI后2 4h內(nèi)，血中濃度迅速升高，8 IOh后達(dá)到最高峰，研究表明MB陰性特別有助于排除AMI，可協(xié)助AMI早期診斷。由于MB在血液中的半衰期短，升高后Mh內(nèi)即恢復(fù)至正常水平，因此可作為觀察有無再梗死及梗死有無擴(kuò)展的指標(biāo)。另外，MB還可作為AMI溶栓中評(píng)價(jià)再灌注與否的較敏感指標(biāo)。現(xiàn)有的MB檢測方法主要有放射性免疫法、酶聯(lián)免疫法，化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)熒光分析法。放射性免疫法使用放射性同位素，會(huì)造成環(huán)境污染；酶聯(lián)免疫法測定周期長，不適合急診的快速檢測；化學(xué)發(fā)光法和酶聯(lián)熒光分析法價(jià)格昂貴，需要專門儀器和專業(yè)人員操作， 只適用于中心實(shí)驗(yàn)室使用，不適合中小醫(yī)院尤其是沒有中心實(shí)驗(yàn)室的鄉(xiāng)鎮(zhèn)醫(yī)院。而膠乳增強(qiáng)免疫比濁法操作簡單，經(jīng)濟(jì)，無污染，可以在絕大多數(shù)醫(yī)院的自動(dòng)生化分析儀上使用，特別是對(duì)急診能實(shí)現(xiàn)快速定量檢測，其基本原理是將抗體包被在膠乳顆粒上，與相應(yīng)抗原發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物所產(chǎn)生的濁度，即可測出標(biāo)本中被檢物含量。而抗體包被到膠乳上，一般可采用物理吸附法和化學(xué)偶聯(lián)法，采用物理吸附法得到的致敏膠乳顆粒穩(wěn)定性差，抗體容易從膠乳顆粒上脫落下來；而且用物理吸附法得到的膠乳，有可能受到類風(fēng)濕性因子(RF)和嗜異性抗體的干擾，從而導(dǎo)致檢測結(jié)果假陽性或假性升高。目前，采用的化學(xué)偶聯(lián)法多為隨機(jī)偶聯(lián)法，因隨機(jī)偶聯(lián)的抗體會(huì)隨機(jī)偶聯(lián)到膠乳生物不同部位，將導(dǎo)致抗體損失結(jié)合力，增加了抗體用量和生產(chǎn)成本；若將上述方法得到的致敏膠乳顆粒用于檢測試劑盒中，會(huì)造成特異性差、準(zhǔn)確性低、抗干擾能力弱或生產(chǎn)成本高的缺陷。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種檢測簡單而快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、抗干擾能力強(qiáng)及生產(chǎn)成本低的肌紅蛋白檢測試劑盒。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為一種肌紅蛋白檢測試劑盒，所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2，所述的試劑Rl為適當(dāng)?shù)木彌_液；所述的試劑R2是用肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒、置于適當(dāng)?shù)木彌_液中。所述的肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒在R2中的濃度為0. 08% 0. (即 0. 08 0.沘克 /100ml)。本發(fā)明所述的緩沖液包括但不限于PBS緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸 (MES)緩沖液、氯化銨緩沖液以及其他具有相似性質(zhì)的緩沖液中的一種或幾種。本發(fā)明上述試劑盒中Rl所用的緩沖液與配制R2所用的緩沖液只要為上面的緩沖液中的一種即可，可以為相同的緩沖液，可以為不同緩沖液。本發(fā)明上面所述的聚苯乙烯膠乳顆粒(該聚苯乙烯膠乳顆粒為市售常規(guī)產(chǎn)品)， 其平均粒徑在0. 01 1. 5μ m(10 1500nm)之間，粒徑小于0. 01 μ m時(shí)，膠乳顆粒聚集產(chǎn)生的光密度變化太小，結(jié)果很難達(dá)到試驗(yàn)敏感度要求，在制備試劑的時(shí)候，需要花費(fèi)過多的離心時(shí)間，延長了試劑生產(chǎn)的時(shí)間，增加了試劑成本且不利于重復(fù)性。而粒徑大于1.5μπι 的膠乳顆粒在測量高濃度檢測物時(shí)，其聚集產(chǎn)生的光密度變化超過了檢測限，結(jié)果很難獲得對(duì)應(yīng)于分析物濃度的光密度變化，而且顆粒太大會(huì)加速自聚集，導(dǎo)致分散性降低。膠乳顆粒粒徑隨著試驗(yàn)方法和設(shè)備的改變而改變。所選擇的顆粒粒徑最好是介于0. 05 0. 5μπι(50 500nm)之間。本發(fā)明上面所述的抗體包括但不限于多克隆抗體及單克隆抗體。在本發(fā)明所述的MB檢測試劑盒中，還包含MB校準(zhǔn)。本發(fā)明所述的試劑R2是用MB抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置于適當(dāng)?shù)木彌_液中組成，該試劑R2的制備步驟包括(1)膠乳顆粒的激活在帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒(膠乳)中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺(EDAC)，混合反應(yīng)后加入己二酸二酰胼，繼續(xù)混合反應(yīng)，得到激活的膠乳顆粒；(2)抗體的氧化用高碘酸鈉將抗體非結(jié)合活性區(qū)域Fc端羧基氧化成醛基；(3)抗體與膠乳顆粒的偶聯(lián)將步驟⑴激活的膠乳顆粒和步驟⑵氧化的抗體混合反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，再加入葡萄糖封閉膠乳微球上未反應(yīng)的基團(tuán)，得到偶聯(lián)抗體的膠乳微球即肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置于適量的緩沖液中。上述步驟(3)中肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒在試劑R2中的濃度為 0. 08 0. 28%即 0. 08 U8 克 /100ml。本發(fā)明上述制備方法各個(gè)步驟中物料配比為步驟(1)中乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺膠乳(原料)=0.5 5 100(重量比)；己二酸二酰胼膠乳=50 250 100(重量比)；步驟O)中高碘酸鈉步驟(1)中的膠乳(原料)=0.5 3 100(重量比)； 高碘酸鈉和抗體的用量比=1 15 10 (重量比)步驟(3)中抗體(氧化后抗體)激活的膠乳顆粒=2 22 100 (重量比)，葡萄糖激活的膠乳顆粒=(25 50) 100(重量比)。本發(fā)明所述試劑盒所采用的檢測原理為膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法，其原理是包被
4MB抗體的膠乳顆粒，與標(biāo)本中MB發(fā)生免疫反應(yīng)后，形成聚集顆粒，在一定波長下，通過測定聚集物形成所產(chǎn)生的濁度，即可測出標(biāo)本中MB的含量。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和有益效果1.本發(fā)明的試劑盒具有檢測簡單而快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、抗干擾能力強(qiáng)及生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。2.本發(fā)明采用的MB檢測方法為膠乳增強(qiáng)免疫比濁法，該方法使得MB的檢測更為經(jīng)濟(jì)、方便和快速，適用于絕大多數(shù)醫(yī)院的自動(dòng)生化分析儀，特別是對(duì)急診能實(shí)現(xiàn)快速定量檢測。3.本發(fā)明試劑盒中的試劑R2的制備是采用一種抗原抗體反應(yīng)試驗(yàn)方法，特別之處在于，本發(fā)明采用定向化學(xué)偶聯(lián)法將MB抗體包被到膠乳顆粒上；本發(fā)明將抗體的非結(jié)合活性區(qū)域的Fc端定向偶聯(lián)到膠乳顆粒上，不易受到類風(fēng)濕性因子(RF)和嗜異性抗體的干擾，大大提升了檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可信性。而且該方法不會(huì)發(fā)生抗體結(jié)合力損失的情況， 可大大減少抗體用量，降低了生產(chǎn)成本。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明，但本發(fā)明不僅僅局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1MB檢測試劑盒的制備本發(fā)明的試劑盒涉及試劑的主要原材料如下1 · MB抗體多克隆抗體(市售)。2.膠乳本發(fā)明僅示例性的采用直徑為150 250nm帶羧基基團(tuán)的聚苯乙烯膠乳顆粒(市售)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。本實(shí)施例的主要試劑的配制如下試劑Rl 含1. 5% PEG6000(聚乙二醇6000)、95mmol/LNaCl的甘氨酸緩沖液，該試劑為無色透明溶液。試劑R2 用抗人MB抗體致敏粒徑為200nm的聚苯乙烯膠乳顆粒。該試劑為乳白色溶液。具體步驟如下1.取 Iml (100mg/ml)膠乳，用 0. lM(mol/L)，ρΗ5· O 的 MES 溶液(2-嗎啉乙磺酸緩沖液)洗滌3次，超聲分散；2.然后加入0. 22ml用0. 1M，ρΗ5· O的MES溶液新鮮配制的EDAC(配制的溶液中 EDAC的濃度為10mg/ml)混合完全，室溫混和15min ；3.再加入0. 88ml用0. 1M，pH5. O的MES溶液新鮮配制的己二酸二酰胼(配制的溶液中己二酸二酰胼的濃度為83mg/ml)，4°C反應(yīng)過夜；4.然后用0. 1M，ρΗ5· O的MES溶液洗滌2次，0. 1Μ，ρΗ7· 5的磷酸鹽溶液洗滌1次，
超聲分散備用；5.取2ml抗體(2mg/ml)溶液，加入0. 3ml用0. 1Μ，ρΗ7· 5的磷酸鹽溶液配制的高碘酸鈉溶液(10mg/ml)，室溫混合15min，6.將步驟5中氧化好的抗體加入到步驟4中已激活的膠乳溶液中，4°C反應(yīng)過夜；7.然后加入0. 32ml 10% BSA(小牛血清白蛋白)溶液，4°C混合4h ；8.再加入0.鈿1 10%葡萄糖溶液，4°C混合過夜；
9.然后用0. 15M，pH7. 5的甘氨酸溶液洗滌3次，再加入0. 15M，pH7. 5的甘氨酸溶液(含BSA,0. 2% NaN3的甘氨酸緩沖液)至膠乳(結(jié)合抗體以后的膠乳重量)終濃度 % 0. 18% (質(zhì)量體積比即0. 18克/100ml)。肌紅蛋白校準(zhǔn)品在緩沖溶液中加入不同含量肌紅蛋白，除菌過濾，所述的肌紅蛋白校準(zhǔn)品中肌紅蛋白含量控制在O 700ug/L之間，這些校準(zhǔn)品均為無色透明液體。實(shí)施例2 MB的測定檢測工具日立7060型自動(dòng)分析儀。分析方法兩點(diǎn)終點(diǎn)法；主波長:570nm,副波長:800nm 樣品量:6ul (微升)；Rl 200ul ；R2 :50ul ；反應(yīng)方向上升；測定溫度37°C ；樣品與Rl混勻后，于第10秒讀取吸光度A1 ；于3 5min時(shí)加入R2，于5min后讀取吸光度A2。反應(yīng)吸光度的計(jì)算為A2與A1的差值。計(jì)算方法多點(diǎn)定標(biāo)，根據(jù)吸光度與參考血清的值作劑量/響應(yīng)曲線，樣品含量可根據(jù)其吸光度值在劑量/響應(yīng)曲線上算出。實(shí)施例3 MB檢測試劑盒性能評(píng)價(jià)1.分析靈敏度評(píng)估采用5%牛血清白蛋白溶液作為空白樣本，空白樣本應(yīng)不含被測物。在生化分析儀上連續(xù)檢測20次，計(jì)算20次結(jié)果的均值與標(biāo)準(zhǔn)差SD。以空白均值加兩倍標(biāo)準(zhǔn)差(+2SD) 作為報(bào)告方法的檢測限。從表1可見，靈敏度為1. 59ug/L。表 權(quán)利要求
1.一種肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2，所述的試劑Rl為適當(dāng)?shù)木彌_液；所述的試劑R2是用肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒、置于適當(dāng)?shù)木彌_液中組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒在試劑R2中的濃度為0. 08 0. 28g/100mlo
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒所采用的檢測原理為膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的緩沖液包括PBS 緩沖液、Tris緩沖液、甘氨酸緩沖液、硼酸鹽緩沖液、醋酸鹽緩沖液、檸檬酸-磷酸鹽緩沖液、碳酸鹽-碳酸氫鹽緩沖液、2-嗎啉乙磺酸緩沖液、氯化銨緩沖液以及其他具有相似性質(zhì)的緩沖液中的一種或幾種。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的聚苯乙烯膠乳顆粒的平均粒徑為0. 01 1. 5 μ m。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的聚苯乙烯膠乳顆粒的平均粒徑為0. 05 0. 5 μ m。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒中還包含肌紅蛋白校準(zhǔn)品。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑R2是用肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒，置于適當(dāng)?shù)木彌_液中組成，該試劑R2的制備步驟包括(1)膠乳顆粒的激活在帶有羧基的聚苯乙烯膠乳顆粒即膠乳中加入乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺，混合反應(yīng)后加入己二酸二酰胼，繼續(xù)混合反應(yīng)，得到激活的膠乳顆粒；(2)抗體的氧化用高碘酸鈉將抗體非結(jié)合活性區(qū)域Fc端羧基氧化成醛基；(3)抗體與膠乳顆粒的偶聯(lián)將步驟(1)激活的膠乳顆粒和步驟( 氧化的抗體混合反應(yīng)，待反應(yīng)結(jié)束后，再加入葡萄糖封閉膠乳微球上未反應(yīng)的基團(tuán)，得到偶聯(lián)抗體的膠乳微球，置于適量的緩沖液中。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于步驟(1)中所述的乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺膠乳的重量比=0.5 5 100，己二酸二酰胼膠乳的重量比=50 250 100 ；步驟⑵中所述的高碘酸鈉步驟(1)中膠乳的重量比=0. 5 3 100，高碘酸鈉抗體的重量比=1 15 10 ；步驟(3)中抗體激活的膠乳顆粒的重量比=2 22 100，葡萄糖激活的膠乳顆粒的重量比=25 50 100。
全文摘要
本發(fā)明公開一種肌紅蛋白檢測試劑盒，其特征在于所述的試劑盒包括試劑R1、試劑R2，所述的試劑R1為適當(dāng)?shù)木彌_液；所述的試劑R2是用肌紅蛋白抗體致敏聚苯乙烯膠乳顆粒、置于適當(dāng)?shù)木彌_液中組成。本發(fā)明具有檢測簡單而快速、靈敏度高、準(zhǔn)確性好、抗干擾能力強(qiáng)及生產(chǎn)成本低的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/68GK102565419SQ201110439589
公開日2012年7月11日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者夏佳音, 鄒炳德, 鄒繼華 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司