專利名稱：銪納米粒子熒光質控品及其制備方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種時間分辨免疫分析熒光儀的固相質控板，特別是涉及一種銪納米粒子熒光質控品及其制備方法和應用。
背景技術：
隨著生物標記技術的不斷進步，免疫分析技術得到了長足的發(fā)展。雖然放射免疫分析(RIA)使生物化學分析進入了一個真正的超微量分析時代，但RIA的缺陷也是非常明顯，其短暫的使用期、廢物處理和射線防護方面的要求為它的使用帶來了不便，其標記物不受環(huán)境影響的衰變行為使其難以建立均相免疫分析等。由此涌現了一大批非放射免疫技術，例如酶免分析技術、化學發(fā)光免疫分析技術、時間分辨熒光免疫分析技術(time-resolved fluorescence immunoassay,TRFIA)等。但是從靈敏度來說，只有時間分辨熒光免疫分析技術可與放射免疫媲美。TRFIA就成為20世紀80年代迅速發(fā)展起來的一種公認的、最有發(fā)展前途的、非放射免疫標記技術。TRFIA技術是集酶標記、同位素標記技術的優(yōu)點于一身，其靈敏度高、特異性強、穩(wěn)定性好，且測定范圍更寬(跨越4-5個數量級)，試劑壽命長，樣品用量少、分析速度快、操作簡便和非放射性等特點，受到基礎醫(yī)學、臨床檢測、分子生物學等領域學者的關注，因此非常適用于生物學、醫(yī)學上的超微量分析，是一項非常有前途的、值得推廣的技術。國外該項技術已經成熟，我國近年來檢測項目也不斷增多。目前已經推出幾十種商品化的時間分辨免疫分析試劑盒。時間分辨免疫分析熒光儀是用于時間分辨免疫分析試劑盒定量分析的檢測設備，目前設備生產調試均采用標準量稀土元素與增強液形成螯合物產生熒光信號為標準來調試。用配制一定量稀土元素與增強液反應產生熒光信號，組成一種熒光信號梯度板條，進行時間分辨免疫分析儀的梯度和靈敏度調試；用配制一定量稀土元素與增強液反應產生熒光信號，把熒光信號排列成中間信號強，前后上下信號弱的組合方式來調試光路和確定邊孔效應。由于稀土元素與增強液組成調試設備標準信號板條易受環(huán)境污染(我國是一個富含稀土元素國家，調試設備所用稀土含量極低，外源性稀土離子污染的概率較大)，因此液相標準板條存放非常困難。另外，采用液相標準板條對設備維護保保養(yǎng)和定期校驗也比較困難。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種銪納米粒子熒光質控品及其制備方法和應用。該銪納米粒子熒光質控品，性能穩(wěn)定，即使在高稀土環(huán)境污下，對該銪納米粒子熒光質控品也不影響，因此，非常適合時間分辨免疫分析熒光儀的生產調試和維護保養(yǎng)，解決了時間分辨免疫分析熒光儀生產調試和維護保養(yǎng)過程中，液相標準信號板條的易受環(huán)境污染、穩(wěn)定差、攜帶使用不方便的問題。為解決上述技術問題，本發(fā)明的銪納米粒子熒光質控品，是一種由具有熒光信號微孔反應板按順序排列，形成的固相質控板；其中，具有熒光信號微孔反應板，是由包被有抗體或抗原的的微孔反應板樣品池(容量可為50 300微升)與標記有熒光銪納米粒子的蛋白，經免疫反應后獲得。所述熒光銪納米粒子，是由以下方法制備得到:將A或B方法制備的納米乳膠微粒，通過包裹、浸入熒光物質，形成表面帶有羧基、氨基或羥基的具有熒光的銪納米粒子，其中，A、B方法如下:A、使用苯乙烯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酰胺單體中的兩種以上，通過乳液聚合、種子乳液聚合或無皂乳液聚合中的一種聚合方式，制備成粒徑在10 500nm有機高分子納米乳膠微粒；B、使用四乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷中的一種為原料，以環(huán)己烷為油相，以聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚或聚乙二醇辛基苯基醚為表面活性齊U，制備成粒徑在40 400nm的娃膠納米乳膠微粒；其中，該娃膠納米乳膠微粒的表面帶有羥基。所述蛋白，包括:抗體、抗原、半抗原、鏈親合素、生物素、蛋白A、蛋白G。所述標記有熒光銪納米粒子的蛋白，其制備(標記)過程中，熒光銪納米粒子與蛋白的質量比為2 100: I。所述按順序排列中，其排列方式為下面兩種順序的任意組合:1、按1000 1000萬CPS的熒光信號的微孔反應板樣品池，以從小到大或從大到小的順序排列；I1、按邊孔效應排列:中間微孔反應板樣品池突光信號在400 600萬CPS,該樣品池的左、右、上、下樣品池的熒光信號保持在2500 5000CPS。另外，本發(fā)明還公開了一種銪納米粒子熒光質控品的制備方法，包括步驟:(I)制備熒光銪納米粒子；(2)在滅光箱納米粒子表面標記蛋白；(3)在微孔反應板樣品池上包被抗體或抗原；(4)把包被有抗體或抗原的微孔反應板樣品池與標記有熒光銪納米粒子的蛋白進行免疫反應，制備具有熒光信號微孔反應板；(5)把具有熒光信號微孔反應板按一定的順序排列，制備成銪納米粒子熒光質控
品O對于上述方法，其具體步驟，包括:(I)按以下IA或IB的方法，制備表面帶有羧基、氨基或羥基的納米乳膠微粒(即銪納米粒子)，其中，IA、使用苯乙烯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酰胺單體中的兩種以上，采用如下方式合成有機高分子納米乳膠微粒:采用乳液聚合反應，原料苯乙烯:丙烯酸(或甲基丙烯酸或丙烯酰胺):SDS(十二烷基磺酸鈉):過硫酸鉀的摩爾比為7: 0.3 1: 0.04: 0.5，在65 70°C，反應6 10小時，合成粒徑10 IOOnm有機高分子納米乳膠微粒；或采用種子乳膠聚合反應，將種子液(上述經乳液聚合反應制備的有機高分子納米乳膠微粒)的重量(g):苯乙烯的摩爾數(mol):甲基丙烯酸甲酯的摩爾數(mol):丙烯酸(或甲基丙烯酸或丙烯酰胺)的摩爾數(mol):過硫酸鉀的摩爾數(mol)比為I 5: 0.07: O 0.05: 0.005 0.02: 0.005 (即 I 5g: 70mmol: O 50mmol: 5 20mmol: 5mmol)，在65 70°C，反應15 25小時，合成粒徑50 250nm有機高分子納米乳膠微粒；或采用無皂乳液聚合反應，原料苯乙烯:甲基丙烯酸甲酯:丙烯酸(或甲基丙烯酸或丙烯酰胺):過硫酸氨的摩爾比為7 2: 2 5: 0.5 2: 0.5，在65 70°C，反應6 10小時，合成粒徑200 500nm有機高分子納米乳膠微粒；IB、使用四乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷的一種為原料，以環(huán)己烷為油相，以聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚或聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)中的一種為表面活性劑，其中，反應原料四乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷:表面活性劑:環(huán)己烷:正己醇:氨水的摩爾比為1: 2 8: 100 200: 20 40: 0.1 0.4，室溫攪拌反應20 28小時。制備粒徑在40nm 400nm硅膠納米乳膠微粒;本步驟中，通過上述的帶功能性基團單體之間的聚合反應或經化學修飾修改方法，形成表面帶有羧基、氨基或羥基的納米乳膠微粒；(2)將表面帶有羧基、氨基或羥基的納米乳膠微粒，通過包裹、浸入熒光物質，形成熒光銪納米粒子；本步驟也可參見CN1866012A “一種定量、快速的免疫檢測方法及其專用裝置”所公開的內容；(3)在碳二亞胺(EDC)、溴化氰或戊二醛的活化作用后，熒光銪納米粒子與蛋白進行偶聯反應，形成表面標記有蛋白的熒光銪納米粒子，即把蛋白連接在熒光銪納米粒子上；其中，蛋白包括:抗體、抗原、半抗原、鏈親合素、生物素、蛋白A、蛋白G ;熒光銪納米粒子與蛋白的質量比為2 100: I ；對于表面帶羧基的熒光銪納米粒子，使用I 10mg/ml碳二亞胺，室溫活化時間20 40分鐘，室溫偶聯反應時間20 28小時；對于表面帶氨基的熒光銪納米粒子，使用體積濃度0.5 2%戊二醛，室溫活化時間20 40分鐘，室溫偶聯反應時間20 28小時；對于表面帶羥基的熒光銪納米粒子，使用I 10mg/ml溴化氰，室溫活化時間20 40分鐘，室溫偶聯反應時間20 28小時。(4)米用以下a、b或c方法,制備具有突光信號的微孔反應板:a、通過在微孔反應板樣品池上包被的一抗，與熒光銪納米粒子表面標記的二抗，進行免疫反應，形成具有熒光信號的微孔反應板；或通過在微孔反應板樣品池上包被的二抗，與熒光銪納米粒子表面標記的一抗，進行免疫反應，形成具有熒光信號的微孔反應板；b、在微孔反應板樣品池上包被抗體或抗原，突光銪納米粒子表面標記抗體或抗原，最后在包被有抗體或抗原的微孔反應板樣品池內，進行熒光銪納米粒子與抗原或抗體的雙抗夾心免疫反應，形成具有熒光信號的微孔反應板:C、把標記有蛋白(包括:抗體、抗原、半抗原、鏈親合素、生物素、蛋白A、蛋白G)的熒光銪納米粒子直按包被到微孔反應板樣品池上，形成具有熒光信號的微孔反應板；
(5)將步驟(4)得到的微孔反應板，按一定的順序排列，制備成用于時間分辨免疫分析熒光儀生產調試和維護保養(yǎng)的銪納米粒子熒光質控品，其中，排列方式為下面兩種順序的任意組合:a)用于確定時間分辨免疫分析熒光儀靈敏度和檢測范圍的具有熒光信號微孔反應板樣品池按熒光大小順序按列:具有熒光信號的微孔反應板樣品池的熒光信號從1000CPS到1000萬CPS按順序排列，每種熒光信號微孔反應板樣品池至少保持兩個平行樣孔，安排六個熒光信號梯度，保持在四到五個數量級熒光信號變化量，其中，六個熒光信號梯度以從小到大的方式，每孔熒光信號分別是 500 到 1500CPS、2500 到 5000CPS、8000 到 1.2CPS、8 到 12CPS、80 萬到 120 萬CPS,700萬到1200萬CPS ;或微孔反應板樣品池熒光信號從大到小順序排列；b)用于確定時間分辨免疫分析熒光儀邊孔效應和調試光路準確性的具有熒光信號微孔反應板樣品池的按以下順序排列(邊孔效應排列):中間微孔反應板樣品池的熒光信號在400萬到600萬CPS，此樣品池的左、右、上、下樣品池熒光信號保持在2500到5000CPS。對于上述的兩種排列方式的任意組合方式，如:只測試時間分辨免疫分析熒光儀靈敏度和檢測范圍的梯度排列順序、只測試時間分辨免疫分析熒光儀邊孔效應和調試光路準確性的邊孔效應排列順序和梯度排列順序與邊孔效應排列順序兩種方式組合在一起。所述步驟(2)中，熒光物質包括:Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+稀土元素與其配位體形成的螯合物。本發(fā)明的銪納米粒子熒光質控品，可應用于對生物芯片檢測的時間分辨免疫分析滅光僅校驗和保養(yǎng)，其中，生物芯片，包括:蛋白質芯片、基因芯片、核Ife芯片。本發(fā)明中，稀釋一定濃度的標記有熒光銪納米粒子的蛋白與包被一濃度有抗體或抗原的微孔反應板樣品池反應，其中，稀釋的標記有熒光銪納米粒子的蛋白的濃度是根據熒光質控品的熒光信號要求調整；或包被一濃度有抗體或抗原的微孔反應板樣品池的包被濃度是根據熒光質控品的熒光信號要求調整。本發(fā)明通過制備一種熒光銪納米粒子，并把熒光銪納米粒子結合在微孔反應板樣品池上，使微孔反應板樣品池在干燥狀態(tài)下仍具有一定量熒光信號，并用此熒光銪納米粒子制作成質控品，代替銪離子與增強液制作的液相標準質控品。本發(fā)明的質控品具有使用方便、性能穩(wěn)定等優(yōu)點，可用于時間分辨免疫分析熒光儀的生產調試和維護保養(yǎng)，其具體的有益效果如下:(I)時間分辨免疫分析熒光儀固相質控板是一種使用方便、性能穩(wěn)定、用于時間分辨免疫分析熒光儀的設備生產調試、設備維護保養(yǎng)而設計的固相質控板，由于該質控板是干燥、固體狀態(tài)，因此，外界環(huán)境稀土元素對固相板條信號沒有影響；(2)固相板條非常穩(wěn)定，固相質控板制備通過對處理過的帶一定熒光信號的微孔反應板樣品池按梯度排列來調試時間分辨免疫分析熒光儀的靈敏度和檢測范圍；它通過對處理過的帶一定熒光信號的微孔反應板樣品池按邊孔效應排列來調試時間分辨免疫分析熒光儀的光路準確性的檢測信號的邊孔效應；(3)固相質控板可隨身攜帶，非常方便用于時間分辨免疫層析檢測儀的設備定期維護保養(yǎng)和檢修的質量控制標準。
具體實施例方式實施例1:通過乳液聚合反應制備聚苯乙烯-丙烯酸納米微粒步驟如下:(I)在加有一粒攪拌子的圓底燒瓶內加入含0.4mmol SDS (十二烷基磺酸鈉)IOml去離子水，通氮氣保護；(2)攪拌下加入70mmol苯乙烯(去除阻聚劑)和IOmmol丙烯酸單體(去除阻聚劑);(3)逐漸升高反應溫度至70°C，加入過硫酸鉀(經過重結晶)5mmol，攪拌反應10小時；(4)將反應體系冷卻至室溫；(5)將產物置于0.45微米針頭過濾器中過濾，超速離心機離心，轉速6萬轉/分鐘，離心50分鐘，沉淀用IOOmM的碳酸氫鈉緩沖液(pH9.0)溶解，貯存于4°C環(huán)境。本實施例中合成的聚苯乙烯-丙烯酸納米微粒，其粒徑在10 lOOnm。實施例2:通過乳液聚合反應制備聚苯乙烯-甲基丙烯酸納米微粒按照實施例1的方法進行，但將其中的丙烯酸單體(去除阻聚劑)改成3mmol甲基丙烯酸(去除阻聚劑)單體，反應溫度改為68°C，攪拌反應改為6小時，其余不變，得到聚苯乙烯-甲基丙烯酸納米微粒。實施例3:通過乳液聚合反應制備聚苯乙烯-丙烯酰胺納米微粒按照實施例1的方法進行，但將其中的丙烯酸單體(去除阻聚劑)改成6mmol丙烯酰胺，反應溫度改為65°C，攪拌反應改為8小時，其余不變，得到聚苯乙烯-丙烯酰胺納米微粒。實施例4:通過無皂乳液聚合反應制備聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯納米微粒步驟如下:(I)在加有一粒攪拌子的圓底燒瓶內加入IOml去離子水，通氮氣保護；(2)攪拌下加入70mmol苯乙烯(去除阻聚劑)、30mmol甲基丙烯酸甲酯(去除阻聚劑)和IOmmol丙烯酸單體(去除阻聚劑)；(3)逐漸升高反應溫度至65°C，加入過硫酸銨(經過重結晶)5mmol，攪拌反應10小時；(4)將反應體系冷卻至室溫；(5)采用0.45微米針頭過濾器過濾后，用高速離心機離心，lOOOOg，離心40分鐘，沉淀用IOOmM的碳酸氫鈉緩沖液(pH9.0)溶解，并存放于4°C環(huán)境。本實施例中合成的聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯納米微粒，其粒徑在200 500nm。實施例5:通過無皂乳液聚合反應制備聚苯乙烯-甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯納米微粒按照實施例4的方法進行，但將其中的苯乙烯(去除阻聚劑)改成20mmol，甲基丙烯酸甲酯(去除阻聚劑)改成50mmol，并將丙烯酸單體(去除阻聚劑)改成5mmol甲基丙烯酸(去除阻聚劑)單體，反應溫度改為70°C，攪拌反應改為6小時，其余不變，得到聚苯乙烯-甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯納米微粒。實施例6:通過無皂乳液聚合反應制備聚苯乙烯-丙烯酰胺-甲基丙烯酸甲酯納米微粒按照實施例4的方法進行，但將其中的苯乙烯(去除阻聚劑)改成50mmol，甲基丙烯酸甲酯改成20mmol，并將丙烯酸單體(去除阻聚劑)改成20mmol丙烯酰胺，反應溫度改為68°C，攪拌反應改為8小時，其余不變，得到聚苯乙烯-丙烯酰胺-甲基丙烯酸甲酯納米微粒。實施例7:通過種子乳液聚合反應制備聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯納米微粒步驟如下:(I)按實施例1的方法，取Ig制備得到的聚苯乙烯-丙烯酸納米微粒產物，加入90ml去離子水,通氮氣保護，同時攪拌下，加入70mmol苯乙烯(去除阻聚劑)、50mmol甲基丙烯酸甲酯(去除阻聚劑)、5mmol丙烯酸單體(去除阻聚劑)，溶脹一個晚上；(2)逐漸升高反應溫度至65°C，加入過硫酸鉀(經過重結晶)5mmol，攪拌反應15小時；(3)采用0.45微米過濾器過濾后，用高速離心機離心，15000g,離心50分鐘，用IOOmM的碳酸氫鈉緩沖液(pH9.0)溶解，并存放于4°C環(huán)境。本實施例中合成的聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯納米微粒，其粒徑在50 250nmo實施例8:通過種子乳液聚合反應制備聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯納米微粒按照實施例7的方法進行，但將其中的聚苯乙烯-丙烯酸納米微粒產物改成5g，甲基丙烯酸甲酯(去除阻聚劑)改成20mmol，丙烯酸單體(去除阻聚劑)改成20mmol甲基丙烯酸(去除阻聚劑)，反應溫度改為68°C，攪拌反應改為25小時，其余不變，得到聚苯乙烯-丙烯酸-甲基丙烯酸-甲基丙烯酸甲酯納米微粒。實施例9:通過種子乳液聚合反應制備聚苯乙烯-丙烯酰胺納米微粒按照實施例7的方法進行，但將其中的聚苯乙烯-丙烯酰胺納米微粒產物改成3g，甲基丙烯酸甲酯=0，丙烯酸單體(去除阻聚劑)改成IOmmol丙烯酰胺，反應溫度改為70°C，攪拌反應改為20小時，其余不變，得到聚苯乙烯-丙烯酰胺納米微粒。實施例10:硅膠納米乳膠微粒的制備步驟如下:(I)在加有一粒攪拌子的IOOml圓底燒瓶內加入2ml去離子水、200 μ I的四乙氧基硅烷、2.4g的TritonX-lOOU.9g的正己醇和7.5g的環(huán)己烷，制成ff/Ο型微乳液；(2)在加有一粒攪拌子的IOOml圓底燒瓶內加入2.4g的Triton X_100、l.9g的正己醇、7.5g的環(huán)己燒和200微升的濃氨水,制成另一種微乳液。(3)把⑵的微乳液在劇烈攪拌情況下加入到⑴微乳液，室溫攪拌聚合反應24小時，加入50ml丙酮結束反應,用0.45微米過濾器過濾后,超速離心機離心,轉速6萬轉/分鐘，離心50分鐘，沉淀用IOOmM的碳酸氫鈉緩沖液(pH9.0)溶解，并存放于4°C環(huán)境。本實施例中合成的硅膠納米乳膠微粒，其粒徑在40 400nm。實施例11:硅膠納米乳膠微粒的制備
按照實施例10的方法進行，但將其中的四乙氧基硅烷改成0.5mmol，表面活性劑采用聚氧乙烯基辛基苯基醚總量為2mmol，環(huán)己烷總量改成lOOmmol，正己醇總量為改成20mmol,氨水改成0.1mmol,聚合反應20小時,得到娃膠納米乳膠微粒。實施例12:硅膠納米乳膠微粒的制備按照實施例10的方法進行，但采用4mmol 3_氨丙基三乙氧基硅烷為原料，表面活性劑采用聚氧乙烯基壬基苯基醚總量為8mmol，環(huán)己烷總量改成200mmol，正己醇總量改成40mmol,氨水改成0.4mmol,聚合反應28小時,得到娃膠納米乳膠微粒。實施例13:強熒光有機高分子納米微粒的制備步驟如下:(I)在IOmL IOOmM的碳酸氫鈉緩沖液中(ρΗ9.0)中加入8毫升丙酮(甲醇或四氫呋喃)，再加入4 μ mol氯化銪(EuCl3)，12 μ mol β -萘基甲酰三氟丙酮(β -ΝΤΑ)，12 μ mol三正辛基氧膦(Τ0Ρ0)，逐滴加入到Iml實施例1制備的聚苯乙烯-丙烯酸納米微粒懸浮體(或實施例2到12制備的所有微粒)；(2)螯合物經攪拌擴散到納米微粒內部；(3)用旋轉蒸發(fā)去除有機溶劑，剩余強熒光有機高分子納米微粒用超速離心機離心，轉速40000轉/每分鐘，離心50分鐘，沉淀用pH6.8的磷酸鹽緩沖液PBS (0.1M)緩沖液溶解，得到表面帶羧基的強熒光有機高分子納米微粒，并存放于4°C環(huán)境。實施例14:以強熒光有機高分子納米微粒(表面帶羧基)標記兔IgG (EDC法)步驟如下:(I)攪拌下，將ImL按照實施例13方法制備得到的表面帶羧基的強熒光有機高分子納米微粒(20mg)，在pH6.8的磷酸鹽緩沖液PBS (0.1M)緩沖稀釋到5ml ；(2)加入IOmg碳二亞胺(EDC), IOmg N-輕基琥拍酰亞胺磺酸鈉鹽(N-hydroxysulfosuccinimide Sodium salt)攬拌溶解，室溫反應 30 分鐘；(3)加入2mg兔IgG (辛酸硫酸銨法純化，自制)，攪拌均勻，室溫反應24小時；(4)反應結束后，加入乙醇胺封閉30分鐘，然后用高速離心機離心，15000g，離心30分鐘，用稀釋液(含有5g/L的酪蛋白、5g/L的PVP、0.2%疊氮鈉的pH8.0的50mM的Tris緩沖液)溶解沉淀，4°C冷藏保存。實施例15:以強熒光有機高分子納米微粒(表面帶硅羥基)標記兔IgG (CNBr法)步驟如下:(I)攪拌下，將ImL按照實施例13的方法制備的得到的表面帶硅羥基的強熒光有機高分子納米微粒(20mg)，在pH8.5的硼酸鹽緩沖液(0.1M)緩沖稀釋到5ml ；(2)加入IOmg溴化氰(CNBr)，攪拌溶解，活化20分鐘后，加入2mg兔IgG (辛酸硫酸銨法純化，自制)，攪拌均勻，室溫反應20小時；反應結束后，高速離心機離心，15000g，離心30分鐘；(3)，沉淀用封閉液(含5g/L的BSA的ρΗ8.5的50mM的Tris緩沖液)封閉8 16小時，然后用高速離心機離心，15000g，離心30分鐘，用稀釋液(含5g/L的酪蛋白、5g/L的PVP、0.2%疊氮鈉的pH8.0的50mM的Tris緩沖液)溶解沉淀，4°C冷藏保存。實施例16:以強熒光有機高分子納米微粒(表面帶氨基)標記兔IgG (戊二醛法)按照實施例15的方法進行，但采用表面帶氨基的強熒光有機高分子納米微粒，采用體積濃度為I %的戊二醛進行活化40分鐘后，與蛋白的室溫偶聯反應改成28小時，且強熒光有機高分子納米微粒與蛋白的質量比為2:1或100: 1，其他條件不變，最終得到強熒光有機高分子納米微粒(表面帶氨基)標記兔IgG。實施例17:制備包被羊抗兔IgG微孔反應板樣品池步驟如下:(I)把羊抗兔IgG(辛酸硫酸銨法純化，自制)用IOOmM碳酸鈉緩沖液中(ρΗ9.6)稀釋到2微克/毫升；(2)在每個微孔反應板樣品池內放入100微升上述2微克/毫升羊抗兔IgG，室溫靜止放置24小時；(3)用包被機或洗板機吸干包被液，注入洗滌液(50mM pH7.8的Tris，其中，含有9g/L NaCl、質量濃度0.2%疊氮鈉、質量濃度0.25% Tween-20) 350ul/孔，立即吸干，重復2次。(4)注入封閉液(50mM ρΗ7.8的Tris，其中，含有9g/L NaCl、質量濃度0.2%疊氮鈉、BSA 10g/L、糖40g/L)200ul/孔，放37°C 2小時或室溫放置12小時；(5)吸干封閉液，將板子放入甩干機甩干5分鐘；(6)放入37度恒溫箱I小時，取出。實施例18:免疫反應制備一定突光信號的樣品池步驟如下:(I)把實施例14或15制備的標記有兔IgG的強熒光有機高分子納米乳膠微粒按10倍梯度稀釋，稀釋6個梯度；(2)根據表1、2、3的方式微孔反應板樣品池突光信號要求,按梯度各取100微升上述稀釋了的強熒光有機高分子納米乳膠微粒，放入實施例17制備的包被有羊抗兔IgG微孔反應板樣品池，室溫免疫反應I小時；(3)用洗板機洗板6次，放入甩干機甩干5分鐘，干燥。表I
權利要求
1.一種銪納米粒子熒光質控品，其特征在于:所述銪納米粒子熒光質控品是一種由具有熒光信號微孔反應板按順序排列，形成的固相質控板； 其中，具有熒光信號微孔反應板，是由包被有抗體或抗原的微孔反應板樣品池與標記有熒光銪納米粒子的蛋白，經免疫反應后獲得。
2.如權利要求1所述的銪納米粒子熒光質控品，其特征在于:所述熒光銪納米粒子，是由以下方法制備得到: 將A或B方法制備的納米乳膠微粒，通過包裹、浸入熒光物質，形成表面帶有羧基、氨基或羥基的具有熒光的銪納米粒子，其中，A、B方法如下: A、使用苯乙烯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酰胺中的兩種以上，通過乳液聚合、種子乳液聚合或無阜乳液聚合中的一種聚合方式，制備成粒徑在10 500nm有機高分子納米乳膠微粒； B、使用四乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷為原料，以環(huán)己烷為油相，以聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚或聚乙二醇辛基苯基醚為表面活性劑，制備成粒徑在40nm 400nm的娃膠納米乳膠微粒。
3.如權利要求1所述的銪納米粒子熒光質控品，其特征在于:所述蛋白，包括:抗體、抗原、半抗原、鏈親合素、生物素、蛋白A、蛋白G。
4.如權利要求1所述的銪納米粒子熒光質控品，其特征在于:所述標記有熒光銪納米粒子的蛋白，其標記過程中，熒光銪納米粒子與蛋白的質量比為2 100: I。
5.如權利要求1所述的銪納米粒子熒光質控品，其特征在于:所述按順序排列中，其排列方式為下面兩種順序的任意組合: 1、按1000 1000萬CPS的熒光信號的微孔反應板樣品池，以從小到大或從大到小的順序排列； I1、按邊孔效應排列:中間微孔反應板樣品池突光信號在400 600萬CPS,該樣品池的左、右、上、下樣品池的熒光信號保持在2500 5000CPS。
6.如權利要求1所述的銪納米粒子熒光質控品的制備方法，其特征在于，包括步驟: (1)制備熒光銪納米粒子； (2)在熒光銪納米粒子表面標記蛋白； (3)在微孔反應板樣品池上包被抗體或抗原； (4)把包被有抗體或抗原的微孔反應板樣品池與標記有熒光銪納米粒子的蛋白進行免疫反應，制備具有突光信號微孔反應板； (5)把具有熒光信號微孔反應板按一定的順序排列，制備成銪納米粒子熒光質控品。
7.如權利要求6所述的方法，其特征在于:所述方法，包括步驟: (I)按以下IA或IB的方法，制備表面帶有羧基、氨基或羥基的納米乳膠微粒，其中， IA、使用苯乙烯、丙烯酸、甲基丙烯酸、甲基丙烯酸甲酯或丙烯酰胺中的兩種以上，采用如下方式合成有機高分子納米乳膠微粒: 采用乳液聚合反應，原料苯乙烯:丙烯酸或甲基丙烯酸或丙烯酰胺:SDS:過硫酸鉀的摩爾比為7: 0.3 1: 0.04: 0.5，在65 70°C，反應6 10小時，合成粒徑10 IOOnm有機高分子納米乳膠微粒； 或采用種子乳膠聚合反應，上述經乳液聚合反應制備的有機高分子納米乳膠微粒作為種子液的以克為單位的重量:苯乙烯的摩爾數:甲基丙烯酸甲酯的摩爾數:丙烯酸或甲基丙烯酸或丙烯酰胺的摩爾數:過硫酸鉀的摩爾數為I 5: 0.07: O 0.05: 0.005 0.02: 0.005，在65 70°C，反應15 25小時，合成粒徑50 250nm有機高分子納米乳膠微粒； 或采用無皂乳液聚合反應，原料苯乙烯:甲基丙烯酸甲酯:丙烯酸或甲基丙烯酸或丙烯酰胺:過硫酸氨的摩爾比為7 2: 2 5: 0.5 2: 0.5，在65 701:，反應6 10小時，合成粒徑200 500nm有機高分子納米乳膠微粒； IB、使用四乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷為原料，以環(huán)己烷為油相，以聚氧乙烯基辛基苯基醚、聚氧乙烯基壬基苯基醚或聚乙二醇辛基苯基醚中的一種為表面活性劑，其中，反應原料四乙氧基硅烷或3-氨丙基三乙氧基硅烷:表面活性劑:環(huán)己烷:正己醇:氨水的摩爾比為0.5 4: 2 8: 100 200: 20 40: 0.1 0.4，在室溫反應20 28小時，制備成粒徑在40 400nm硅膠納米乳膠微粒； (2)將表面帶有羧基、氨基或羥基的納米乳膠微粒，通過包裹、浸入熒光物質，形成熒光銪納米粒子； (3)在碳二亞胺、溴化氰或戊二醛的活化作用后，熒光銪納米粒子與蛋白進行偶聯反應，形成表面標記有蛋白的熒光銪納米粒子，其中，熒光銪納米粒子與蛋白的質量比為2 100: 1 ； (4)采用以下a、b或c方法，制備具有熒光信號的微孔反應板: a、通過在微孔反應板樣品池上包被的一抗，與熒光銪納米粒子表面標記的二抗，進行免疫反應，形成具有熒光信號的微孔反應板；或 通過在微孔反應板樣品池上包被的二抗，與熒光銪納米粒子表面標記的一抗，進行免疫反應，形成具有熒光信號的微孔反應板； b、在微孔反應板樣品池上包被抗體或抗原，熒光銪納米粒子表面標記抗體或抗原，最后在包被有抗體或抗原的微孔反應板樣品池內，進行熒光銪納米粒子與抗原或抗體的雙抗夾心免疫反應，形成具有熒光信號的微孔反應板: C、把標記有蛋白的熒光銪納米粒子直按包被到微孔反應板樣品池上，形成具有熒光信號的微孔反應板； (5)將步驟(4)得到的微孔反應板，按一定的順序排列，制備成用于時間分辨免疫分析熒光儀生產調試和維護保養(yǎng)的銪納米粒子熒光質控品，其中，排列方式為下面兩種順序的任意組合: a)用于確定時間分辨免疫分析熒光儀靈敏度和檢測范圍的具有熒光信號微孔反應板樣品池按熒光大小順序按列: 具有突光信號的微孔反應板樣品池的突光信號從1000CPS到1000萬CPS按順序排列，每種熒光信號微孔反應板樣品池至少保持兩個平行樣孔，安排六個熒光信號梯度，保持在四到五個數量級熒光信號變化量，其中，六個熒光信號梯度以從小到大的方式，每孔熒光信號分別是 500 到 1500CPS、2500 到 5000CPS、8000 到 1.2CPS、8 到 12CPS、80 萬到 120 萬 CPS、700萬到1200萬CPS ;或微孔反應板樣品池熒光信號從大到小順序排列； b)用于確定時間分辨免疫分析熒光儀邊孔效應和調試光路準確性的具有熒光信號微孔反應板樣品池的按以下順序排列:中間微孔反應板樣品池的熒光信號在400萬到600萬CPS，此樣品池的左、右、上、下樣品池熒光信號保持在2500到5000CPS。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于:所述步驟(2)中，熒光物質包括:Eu3+、Sm3+、Tb3+或Dy3+稀土元素與其配位體形成的螯合物。
9.如權利要求7所述的方法，其特征在于:所述步驟(3)中，對于表面帶羧基的熒光銪納米粒子,使用I 10mg/ml碳二亞胺,室溫活化時間20 40分鐘,室溫偶聯反應時間20 28小時； 對于表面帶氨基的熒光銪納米粒子，使用體積濃度0.5 2%戊二醛，室溫活化時間20 40分鐘，室溫偶聯反應時間20 28小時； 對于表面帶輕基的突光銪納米粒子，使用I 10mg/ml溴化氰,室溫活化時間20 40分鐘，室溫偶聯反應時間20 28小時。
10.如權利要求1所述的銪納米粒子熒光質控品的應用，其特征在于:應用于對生物芯片檢測的時間分辨免疫分析熒光儀校驗和保養(yǎng)。
11.如權利要求10所 述的應用，其特征在于:所述生物芯片，包括:蛋白質芯片、基因芯片、核酸芯片。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種銪納米粒子熒光質控品及其制備方法和應用，該質控品是一種由具有熒光信號微孔反應板按順序排列，形成的固相質控板；其制備方法，包括1)制備熒光銪納米粒子；2)在熒光銪納米粒子表面標記蛋白；3)在微孔反應板樣品池上包被抗體或抗原；4)把包被有抗體或抗原的微孔反應板樣品池與標記有熒光銪納米粒子的蛋白進行免疫反應，制備具有熒光信號微孔反應板；5)把具有熒光信號微孔反應板按一定順序排列，制備成銪納米粒子熒光質控品；該銪納米粒子熒光質控品，可應用于對生物芯片檢測的時間分辨免疫分析熒光儀校驗和保養(yǎng)，而且具有使用方便、性能穩(wěn)定等優(yōu)點。
文檔編號G01N33/543GK103175953SQ20111044013
公開日2013年6月26日 申請日期2011年12月26日 優(yōu)先權日2011年12月26日
發(fā)明者吳俊清, 任媛媛, 楊揮 申請人:蘇州新波生物技術有限公司