專利名稱：同時(shí)檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B₁、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色譜-熒光法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種同時(shí)檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色譜-熒光法。
背景技術(shù)：
真菌毒素是指在產(chǎn)毒絲狀真菌的生長(zhǎng)代謝過(guò)程中，分泌產(chǎn)生的對(duì)人畜健康有害的次生代謝產(chǎn)物。由于這類真菌毒素分布廣，某些毒素還具有致畸、致癌和致突變等作用，近年被世界衛(wèi)生組織列為食源性疾病的三大根源之一。由于產(chǎn)毒真菌在適宜條件下，極易在產(chǎn)前產(chǎn)后侵染農(nóng)產(chǎn)品，導(dǎo)致真菌毒素的污染，進(jìn)而威脅人類和畜禽的健康，也帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。目前，世界各國(guó)雖對(duì)真菌毒素建立較為完善的防控措施，但在現(xiàn)有生產(chǎn)力水平下，要完全杜絕真菌毒素進(jìn)入人類的食物鏈?zhǔn)菬o(wú)法實(shí)現(xiàn)的。通常條件下，黃曲霉毒素B1 (Aflatoxin B1,AFB1X赭曲霉毒素A (Ochratoxin A,0ΤΑ)、玉米赤霉烯酮(Zearalen0ne，ZEN)等真菌毒素均易出現(xiàn)在霉變谷物中，而且多種毒素并存的現(xiàn)象也有報(bào)道，其毒素的加和毒性更是極具威脅。發(fā)生多種毒素并存的現(xiàn)象主要是由兩方面原因?qū)е碌?，其一，現(xiàn)代食品工業(yè)的高度集成化，增加了不同原料間交叉污染的可能，也極大增加了多種毒素并存的幾率，其二，某些產(chǎn)毒真菌，特別是產(chǎn)毒曲霉，在特定的條件下可以分泌多種真菌毒素。但是不管是單一毒素還是多種毒素，都將嚴(yán)重威脅到人和動(dòng)物的健康。下表為以上所述四種真菌毒素的基本信息。
權(quán)利要求
1.同時(shí)檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色譜-熒光法，其特征在于該方法包括以下步驟 (1)谷物樣品中待測(cè)毒素提取液的制備 (1-1)準(zhǔn)確稱取5 g磨碎的谷物樣品，精確至O. Ol g，置于50 mL具蓋離心管A中，力口Λ 15 mL通用型提取液,劇烈振蕩I min,然后于搖床上以60 r/min振搖20 min,接著加入20 mL乙腈,60 r/min振搖10 min后,加入3 g無(wú)水硫酸鎂和2 g氯化鈉作為復(fù)合鹽析試齊U，迅速并劇烈振蕩I min，以3500 r/min離心10 min，取出上層溶液至100 mL磨口燒瓶B中，待用； (1-2)往離心管A中再加入15 mL乙腈,經(jīng)過(guò)劇烈振蕩I min后，以3500 r/min離心10 min，取出上層溶液，并與步驟(1-1)中取出的提取液合并于燒瓶B中，于40°C下減壓濃縮近干； (2)提取液凈化 往燒瓶B中加入4 mL正己烷和I mL酸性乙腈作為凈化試劑充分蕩洗，收集蕩洗液，以3500 r/min離心后,棄去上層正己燒層，收集下層溶液于2. O mL離心管C中，并用O. 5 mL酸性乙腈重復(fù)洗滌燒瓶B 2次，收集蕩洗液至離心管C中定容至2 mL，以15000 r/min離心I min,取上清液過(guò)O. 22 μ m濾膜，得到待測(cè)樣品溶液，供液相色譜分析； (3)測(cè)定 (3-1)標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)樣品溶液在設(shè)定的液相色譜條件下進(jìn)樣，即將標(biāo)準(zhǔn)工作液和待測(cè)樣品溶液注入高效液相色譜儀分離，并采用熒光檢測(cè)器檢測(cè)，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，用標(biāo)準(zhǔn)工作曲線對(duì)樣品進(jìn)行定量，待測(cè)樣品溶液中真菌毒素的響應(yīng)值應(yīng)該在熒光檢測(cè)器的線性范圍內(nèi)； (3-2)在上述液相色譜條件下，若待測(cè)樣品溶液中出現(xiàn)的真菌毒素色譜峰保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)工作液一致，則判斷待測(cè)樣品中存在相應(yīng)的被測(cè)物，允許偏差小于±2. 5%。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色譜-熒光法，其特征在于步驟(1-1)中所述通用型提取液為12 mL冰乙酸以蒸懼水定容至100 mL制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色譜-熒光法，其特征在于步驟(2)中所述酸性乙腈為乙酸和乙腈按照體積比1:9混合制成。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色譜-熒光法，其特征在于步驟(3)中所述液相色譜條件為
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色譜-熒光法，其特征在于步驟(3)中所述熒光檢測(cè)器為四通道熒光檢測(cè)器，設(shè)定的四種真菌毒素的四通道熒光檢測(cè)器的參數(shù)為激載波長(zhǎng)(Es)發(fā)射波Ι￡(Ειη} _. . *__(uni)__(nm) H■毒素 S,360440.......................................................... Hi 霉素 ~330SIIO'° 1+曲霤毒繼A333"477 ，￡ 米參霉274440—
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的同時(shí)檢測(cè)谷物中黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的液相色譜-熒光法，其特征在于步驟(3)中所述熒光檢測(cè)器為單通道熒光檢測(cè)器，設(shè)定的四種真菌毒素的單通道熒光檢測(cè)器的程序時(shí)間波長(zhǎng)參數(shù)為毒.桌—雜 ~miEHFEm ~SiiiS^(Em)~'minfnni)謂)一口石一-_^_—一一:4「一一. ~ tjgit...........................................Γ(κ —'.........................................................330........................... 1.............................................500............................. .. .. °—■—MA17-19333477~ ~ IE 米赤霉録·19-25274440
全文摘要
本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，提供一種高效液相色譜法同時(shí)檢測(cè)谷物中的黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A、玉米赤霉烯酮和桔霉素的方法。該方法通過(guò)通用型提取液提取，以高效液相色譜-熒光檢測(cè)器法檢測(cè)和外標(biāo)法定量。本發(fā)明的檢出限分別為黃曲霉毒素B11.08μg/kg、赭曲霉毒素A3μg/kg、玉米赤霉烯酮35.85μg/kg和桔霉素6.52μg/kg。該發(fā)明方法簡(jiǎn)便快捷，環(huán)境污染小，檢測(cè)成本低，適用于谷物中四種真菌毒素的同時(shí)定量檢測(cè)。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102636581SQ20111044161
公開(kāi)日2012年8月15日 申請(qǐng)日期2011年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月26日
發(fā)明者周有祥, 李書謙, 王小紅, 胡定金, 董麗娜, 路磊, 陳建彪, 陳福生 申請(qǐng)人:周有祥, 湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所, 陳福生