專利名稱：乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離、檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種高效液相色譜分離、氣相色譜檢測(cè)乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的方法。
背景技術(shù)：
母乳是嬰兒成長(zhǎng)最好的食物，但是，因各種原因不能母乳喂養(yǎng)或母乳供應(yīng)不足以及嬰兒在6個(gè)月以后和斷奶期需要增加輔食的情況下，嬰幼兒配方乳粉成為可供選擇的最
佳食品之一。人乳中最重要的飽和脂肪酸棕櫚酸，大約有70%是酯化在Sn-2位上。而牛乳以及絕大多數(shù)市場(chǎng)上銷售的嬰幼兒配方奶粉中所用的植物油脂里的棕櫚酸則是連在Sn-I或 Sn-3位上(Sn-2上的量少于20% )，這種甘油三酯中的棕櫚酸會(huì)在小腸內(nèi)被胰脂肪酶水解， 形成游離態(tài)脂肪酸，并與鈣元素結(jié)合生成鈣皂，造成嬰幼兒體內(nèi)存在大量供能物質(zhì)棕櫚酸以及鈣元素的流失。因此，如何通過(guò)調(diào)整配方乳粉中Sn-2位棕櫚酸的含量，以使以牛乳為基礎(chǔ)原料的嬰幼兒配方乳粉更加適合寶寶食用成為當(dāng)前國(guó)內(nèi)外各大嬰幼兒乳粉生產(chǎn)企業(yè)的主研課題。目前，國(guó)內(nèi)外許多研究機(jī)構(gòu)開(kāi)展了大量的關(guān)于甘油三酯Sn-2位脂肪酸檢測(cè)技術(shù)的研究工作。基本步驟都是采用酶或化學(xué)試劑對(duì)甘油三酯進(jìn)行部分水解，然后用薄層色譜法(TLC)分離純化，直接或衍生后用氣相色譜(GC)測(cè)定。國(guó)內(nèi)的趙海珍、趙玉生等則是分別采用高效液相色譜法和超高效液相色譜法分別對(duì)豬油甘油三酯和雙低菜籽油/結(jié)構(gòu)脂質(zhì)的脂肪酸位置分布進(jìn)行了測(cè)定，但在測(cè)定Sn-2位上的脂肪酸組成時(shí)卻是通過(guò)間接方式計(jì)算而得，而不是將單甘酯直接或衍生后用氣相色譜進(jìn)行測(cè)定，影響了結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于這些方法多是對(duì)于動(dòng)、植物油的甘油三酯脂肪酸組成的測(cè)定，對(duì)乳粉甘油三酷中Sn-2位脂肪酸組成測(cè)定的報(bào)道很少。因此，開(kāi)展乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸檢測(cè)方法的研究工作，對(duì)提高我國(guó)的嬰幼兒乳品品質(zhì)，加強(qiáng)監(jiān)督有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種高效液相色譜分離、氣相色譜檢測(cè)乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的方法，靈敏度高，穩(wěn)定性好。為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案如下。乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，包括如下步驟A、乳粉脂肪的提?。籅、脂肪酶水解上步所得乳粉脂肪；C、上步所得水解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行分離，收集單甘脂；D、上步所得單甘脂進(jìn)行甲酯化衍生處理，獲取衍生產(chǎn)物；Ε、氣相色譜檢測(cè)上步所得衍生產(chǎn)物，測(cè)定乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的含量。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟A中，采用IS014156法提取乳粉中的甘油
作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟B中，按重量計(jì)，取步驟A所得乳粉脂肪100 份置于離心管中，加入胰脂肪酶(15 邪)份，再加入三羥甲基氨基甲烷緩沖液，小心搖動(dòng)， 然后加入膽酸鈉溶液和CaCL2溶液，蓋上塞子小心搖動(dòng)，并立即將離心管放入38°C 40°C 恒溫水浴鍋中，震動(dòng)反應(yīng)5min 8min，立即加入鹽酸和ニ氯甲烷，然后蓋上塞子并再次用振蕩器劇烈震搖，最后離心分離、吸取ニ氯甲烷層并用濾膜過(guò)濾到高效液相色譜進(jìn)樣瓶中。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟C中高效液相色譜的分離條件為，色譜柱 鍵合氨丙基的氨基柱；流動(dòng)相按體積計(jì)30 60份的乙腈和40 70份的ニ氯甲烷；流速 (0. 8 1. 2)mL/min ；檢測(cè)器采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度為60°C 90°C。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟C中，先在色譜柱上用棕櫚酸單甘油酯標(biāo)樣，記下單甘油酯的保留時(shí)間，再分析步驟B處理好的樣品，在到達(dá)單甘油酯的保留時(shí)間吋，打開(kāi)制備閥門(mén)，收集洗脫液。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟C中，所述乙腈當(dāng)中含有0.05% 0. 12% 體積比的冰乙酸。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟C中，所述鍵合氨丙基的氨基柱為 HyperSil NH2、Zorbax NH2, InertSil NH2 中的ー種。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟D中，向單甘油酯中加入正己烷和(1. 0 2. 5)mol/L的氫氧化鉀甲醇溶液，混勻、離心，其中的Sn-2位單甘酯完全甲酷化，收集上清液；其中，氫氧化鉀甲醇溶液與步驟A中乳粉脂肪的體積重量比為(300 650)uL IOOmgo作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟E中，吸取上步所得上清液于氣相色譜進(jìn)樣瓶中，氣相色譜的分析條件為采用程序升溫，初始溫度為100°c 140°C開(kāi)始，保持 4min 8min，以(3 10) "C /min升至220°C 260°C，保持IOmin 20min ；載氣為高純氮?dú)?；載氣流速為(0. 8 1. 4)mL/min ；分流比為(20 30) 1 ；氣化室溫度為240°C 2800C ；FID檢測(cè)器溫度為260 300°C。作為本發(fā)明的一種優(yōu)選技術(shù)方案，步驟E中，所述氣相色譜柱色譜柱的規(guī)格為 SP-2560, IOOmX 0. 25mm, 0. 20 μ m。采用上述技術(shù)方案所產(chǎn)生的有益效果在于參看附圖，本發(fā)明先采用液相色譜進(jìn)行預(yù)分離，再進(jìn)行液相色譜分析檢測(cè)，排除雜質(zhì)干擾，大大提高了檢測(cè)的靈敏度，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)乳粉中Sn-2位脂肪酸含量的高效檢測(cè)，

圖1 是本發(fā)明第一實(shí)施例中的酶解產(chǎn)物在高效液相色譜氨基柱上的分離圖譜，圖中，峰a是分離出的sn-2單甘酯；圖2是甲酯化衍生物在SP-2560，IOOmX0. 25mm, 0. 20 μ m毛細(xì)管氣相色譜柱上的分離圖譜，圖中，峰a是分離出的sn-2棕櫚酸甲酷。傳統(tǒng)的薄層層析檢測(cè)法需要耗費(fèi)數(shù)個(gè)小吋，后期還需要烘干等步驟，操作也十分繁瑣；本發(fā)明采用色譜柱進(jìn)行分離、檢測(cè)，時(shí)間大大縮短，操作步驟也十分簡(jiǎn)易。本檢測(cè)方法穩(wěn)定性極高，利用其檢測(cè)乳粉中甘油三酯的Sn-2位脂肪酸含量，重現(xiàn)性達(dá)到RSD ^ 5%，下表是同一樣品sn-2位棕櫚酸占sn-2總脂肪酸的百分比10次檢測(cè)結(jié)果及RSD
權(quán)利要求
1.乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于包括如下步驟A、乳粉脂肪的提?。籅、脂肪酶水解上步所得乳粉脂肪；C、上步所得水解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行分離，收集單甘脂；D、上步所得單甘脂進(jìn)行甲酯化衍生處理，獲取衍生產(chǎn)物；Ε、氣相色譜檢測(cè)上步所得衍生產(chǎn)物，測(cè)定乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于步驟A中，采用IS014156法提取乳粉中的甘油三酷。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于步驟B中，按重量計(jì)，取步驟A所得乳粉脂肪100份置于離心管中，加入胰脂肪酶(15 25) 份，再加入三羥甲基氨基甲烷緩沖液，小心搖動(dòng)，然后加入膽酸鈉溶液和CaCL2溶液，蓋上塞子小心搖動(dòng)，并立即將離心管放入38°C 40°C恒溫水浴鍋中，震動(dòng)反應(yīng)5min 8min，立即加入鹽酸和ニ氯甲烷，然后蓋上塞子并再次用振蕩器劇烈震搖，最后離心分離、吸取ニ氯甲烷層并用濾膜過(guò)濾到高效液相色譜進(jìn)樣瓶中。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于步驟C中高效液相色譜的分離條件為，色譜柱鍵合氨丙基的氨基柱；流動(dòng)相按體積計(jì)30 60份的乙腈和40 70份的ニ氯甲烷；流速(0. 8 1. 2)mL/min ；檢測(cè)器采用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，漂移管溫度為60°C 90°C。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于步驟C中，先在色譜柱上用棕櫚酸單甘油酯標(biāo)樣，記下單甘油酯的保留時(shí)間，再分析步驟B處理好的樣品，在到達(dá)單甘油酯的保留時(shí)間時(shí)，打開(kāi)制備閥門(mén)，收集洗脫液。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于步驟C中，所述乙腈當(dāng)中含有0. 05% 0. 12%體積比的冰乙酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于步驟C中，所述鍵合氨丙基的氨基柱為HyperSil NH2^Zorbax NH2、InertSil NH2中的ー種。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于步驟D中，向單甘油酯中加入正己烷和(1. 0 2. 5)mol/L的氫氧化鉀甲醇溶液，混勻、離心， 其中的Sn-2位單甘酯完全甲酷化，收集上清液；其中，氫氧化鉀甲醇溶液與步驟A中乳粉脂肪的體積重量比為(300 650)uL IOOmg0
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于 步驟E中，吸取上步所得上清液于氣相色譜進(jìn)樣瓶中，氣相色譜的分析條件為采用程序升溫，初始溫度為100°C 140°C開(kāi)始，保持^iin 8min，以(3 10) °C /min升至220°C 260°C，保持IOmin 20min ；載氣為高純氮?dú)猓惠d氣流速為(0. 8 1. 4)mL/min ；分流比為 (20 30) 1 ；氣化室溫度為240°C 280°C ；FID檢測(cè)器溫度為260 300°C。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，其特征在于 步驟E中，所述氣相色譜柱色譜柱的規(guī)格為SP-2560，IOOmX0. 25mm,0. 20 μ m。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的檢測(cè)方法，包括如下步驟A、乳粉脂肪的提??；B、脂肪酶水解上步所得乳粉脂肪；C、上步所得水解產(chǎn)物經(jīng)高效液相色譜進(jìn)行分離，收集單甘脂；D、上步所得單甘脂進(jìn)行甲酯化衍生處理，獲取衍生產(chǎn)物；E、氣相色譜檢測(cè)上步所得衍生產(chǎn)物，測(cè)定乳粉甘油三酯中Sn-2位脂肪酸的含量。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法，靈敏度高、穩(wěn)定性好。
文檔編號(hào)G01N30/06GK102539604SQ201110447958
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月28日
發(fā)明者張?zhí)觳? 房新平, 李志鈞, 李朝旭, 翟紅梅, 賈云虹, 賈樹(shù)妍 申請(qǐng)人:河北三元食品有限公司