專利名稱：熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的制備與檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的制備與檢測(cè)方法，其應(yīng)用于熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備エ藝。
背景技術(shù)：
腦惡性膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性惡性腫瘤中最常見(jiàn)的腫瘤。因生長(zhǎng)速度快且沿神經(jīng)纖維浸潤(rùn)性生長(zhǎng)，致使手術(shù)難以完全切除；同時(shí)對(duì)化療和放療僅為中度敏感。因此，目前現(xiàn)有的國(guó)際公認(rèn)的常規(guī)手術(shù)、放療、化療的序貫治療方案，難以根治腦惡性膠質(zhì)瘤。 免疫治療是通過(guò)調(diào)整、提高機(jī)體免疫系統(tǒng)功能，清除殘留的腫瘤細(xì)胞，達(dá)到真正的治愈的目的。目前，以DC為基礎(chǔ)的細(xì)胞疫苗治療是ー種主動(dòng)免疫治療，正成為研究的熱點(diǎn)。DC是體內(nèi)最強(qiáng)大的抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cell APC)，其抗原提呈能力可為其他提呈細(xì)胞的數(shù)百倍，能有效刺激靜息的T細(xì)胞誘發(fā)初次免疫應(yīng)答，其在T細(xì)胞對(duì)腫瘤抗原的識(shí)別過(guò)程中起著重要的作用，DC能通過(guò)血腦屏障進(jìn)入靶向區(qū)，從而發(fā)揮特異性抗腫瘤效應(yīng)。DC 的體外培養(yǎng)在目前已經(jīng)是ー項(xiàng)常用的生物治療技木，國(guó)內(nèi)外動(dòng)物和臨床試驗(yàn)研究的常用方法可分為四類1)特異性腫瘤抗原肽負(fù)載DC。腫瘤抗原肽可以通過(guò)人工合成、弱酸洗脫腫瘤表面的MHC-I類抗原肽獲得；2)腫瘤細(xì)胞抗原負(fù)載DC。利用超聲波破碎、反復(fù)凍融或放射線輻照腫瘤細(xì)胞等方法獲取腫瘤細(xì)胞性抗原，然后致敏DC制備的疫苗；幻腫瘤細(xì)胞-DC 融合體疫苗。DC與腫瘤細(xì)胞融合后的雜交細(xì)胞可獲得雙親本細(xì)胞的表型特性；4)腫瘤細(xì)胞 RNA或cDNA負(fù)載DC。如何選擇ー種高效、安全的DC疫苗制備法是主動(dòng)細(xì)胞免疫治療成敗的關(guān)鍵，對(duì)于臨床推廣價(jià)值意義重大。本方法屬于第二類，先將腫瘤細(xì)胞處于熱休克狀態(tài)， 誘導(dǎo)細(xì)胞高表達(dá)熱休克蛋白(heat shock proteins HSP)，再用化學(xué)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而制備成富含熱休克蛋白的凋亡細(xì)胞抗原，制備好的抗原與未成熟的DC細(xì)胞混合培養(yǎng)制備成熟的DC疫苗。

發(fā)明內(nèi)容
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提出一種熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的制備與檢測(cè)方法，其應(yīng)用于熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備エ藝，所述的制備エ藝采用先將腫瘤細(xì)胞處于熱休克狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞高表達(dá)熱休克蛋白(HSP)，再用化學(xué)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而制備成富含熱休克蛋白的凋亡細(xì)胞抗原，制備好的抗原與未成熟的DC細(xì)胞混合培養(yǎng)獲得成熟的DC疫苗。熱休克腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞負(fù)載的DC疫苗具有較好的凋亡率。且采用熱休克法負(fù)載制備得到的DC疫苗成熟度高，可用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。具體的，所述的制備エ藝包括如下步驟Si.熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的制備和檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251引自美國(guó)ATCC，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，將細(xì)胞置于40°C，5% CO2培養(yǎng)箱中池，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入白樺酯酸至終濃度為10yg/ml，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶移至37°C，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。收獲凋亡細(xì)胞，加入無(wú)菌PBS洗滌4次，獲得凋亡腫瘤細(xì)胞抗原。腫瘤細(xì)胞經(jīng)40°C處理汕后用FITC-Armexin-V和PI雙標(biāo)細(xì)胞后進(jìn)行流式檢測(cè)計(jì)
算凋亡率結(jié)果。軟瓊脂克隆法檢測(cè)細(xì)胞抗原體外成瘤能力，結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞中無(wú)腫瘤細(xì)胞克隆生長(zhǎng)；內(nèi)毒素檢測(cè)按《中華人民共和國(guó)藥典》2005版第三部規(guī)定的方法進(jìn)行；取制備抗原進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。S2. DC腫瘤疫苗的制備和檢測(cè)采集3個(gè)自愿者外周血，采用人工肝素抗凝采集的外周血，置于冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，2，0001~/1^11，101^11，201獲得血細(xì)胞，稀釋2倍后，F(xiàn)icoll分離法分離血細(xì)胞獲取一次新鮮的外周血單個(gè)核細(xì)胞。用培養(yǎng)基重懸新鮮制備的PBMC后鋪于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中90min后，洗去未貼壁細(xì)胞，于培養(yǎng)板內(nèi)加入含lOOng/mL GM-CSF,50ng/mL IL-4的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，第3d進(jìn)行換液，第5d收獲未成熟DC (imDC)，加入凋亡腫瘤細(xì)胞抗原(DC與靶細(xì)胞抗原的比例為3 1)，至371，5%0)2培養(yǎng)箱共同培育48h，收獲DC細(xì)胞，苔盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與表型檢測(cè)。


通過(guò)下面結(jié)合附圖的詳細(xì)描述，本發(fā)明前述的和其他的目的、特征和優(yōu)點(diǎn)將變得顯而易見(jiàn)。其中圖1所示為本發(fā)明的熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備工藝的步驟流程示意圖。
具體實(shí)施例方式如圖1所示的本發(fā)明的熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備工藝的步驟流程示意圖，所述實(shí)施例的具體步驟如下Si.熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的制備和檢測(cè)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251引自美國(guó)ATCC，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)。用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，將細(xì)胞置于40°C，5% CO2培養(yǎng)箱中池，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入白樺酯酸至終濃度為10yg/ml，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶移至37°C，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。收獲凋亡細(xì)胞，加入無(wú)菌PBS洗滌4次，獲得凋亡腫瘤細(xì)胞抗原。腫瘤細(xì)胞經(jīng)40°C處理汕后用FITC-Armexin-V和PI雙標(biāo)細(xì)胞后進(jìn)行流式檢測(cè)計(jì)算凋亡率結(jié)果顯示，凋亡率平均值為66. 23%。軟瓊脂克隆法檢測(cè)細(xì)胞抗原體外成瘤能力，結(jié)果顯示凋亡細(xì)胞中無(wú)腫瘤細(xì)胞克隆生長(zhǎng)。內(nèi)毒素檢測(cè)按《中華人民共和國(guó)藥典》2005版第三部規(guī)定的方法進(jìn)行。取制備抗原進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。S2. DC腫瘤疫苗的制備和檢測(cè)采集3個(gè)自愿者外周血，采用人工肝素抗凝采集的外周血，置于冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，2，0001~/1^11，101^11，201獲得血細(xì)胞，稀釋2倍后，F(xiàn)icoll分離法分離血細(xì)胞獲取一次新鮮的外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell PBMC)。用 RPMI 1640 培養(yǎng)基重懸新鮮制備的PBMC后鋪于六孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放置于37°C，5% CO2培養(yǎng)箱中90min后，洗去未貼壁細(xì)胞，于培養(yǎng)板內(nèi)加入含100ng/mL GM-CSF，50ng/mL IL-4的RPMI 1640完全培養(yǎng)基，第3d進(jìn)行換液，第5d收獲未成熟DC(imDC)，加入凋亡腫瘤細(xì)胞抗原(DC與靶細(xì)胞抗原的比例為3 1)，至37°0，5%0)2培養(yǎng)箱共同培育48h，收獲DC細(xì)胞，苔盼藍(lán)染色進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)與表型檢測(cè)。進(jìn)行流式檢測(cè)HLA-DR+CDllc+、⑶llc+CD86+、⑶Ilc+⑶83+。經(jīng)流式細(xì)胞儀FACS分析顯示，DC的公認(rèn)標(biāo)志HLA-DR+⑶Ilc+的平均值凋亡組為90. 90%, DC的成熟標(biāo)志⑶Ilc+⑶83+的平均值凋亡組為73. 03%,DC的成熟標(biāo)志⑶Ilc+⑶86+的平均值凋亡組為 86. 04%。本研究方法采用先將腫瘤細(xì)胞處于熱休克狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞高表達(dá)熱休克蛋白(HSP)，再用化學(xué)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而制備成富含熱休克蛋白的凋亡細(xì)胞抗原，制備好的抗原與未成熟的DC細(xì)胞混合培養(yǎng)獲得成熟的DC疫苗。熱休克腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞負(fù)載的DC疫苗具有較好的凋亡率，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，DC疫苗具有成熟DC的表型特征，DC的公認(rèn)標(biāo)志HLA-DR+CDlIc+的平均值為90. 90%, DC的成熟標(biāo)志CDllc+CD86+的平均值為73. 03%,⑶llc+CD83+的平均值為86. 04%，高表達(dá)⑶83、⑶86。顯示采用熱休克法負(fù)載制備得到的DC疫苗成熟度高，可用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。本發(fā)明并不局限于所述的實(shí)施例，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在不脫離本發(fā)明的精神即公開(kāi)范圍內(nèi)，仍可作一些修正或改變，故本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍以權(quán)利要求書(shū)限定的范圍為準(zhǔn)。
權(quán)利要求
1. 一種熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的制備與檢測(cè)方法，其應(yīng)用于熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備エ藝，所述制備エ藝包括步驟熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的制備和檢測(cè)以及DC腫瘤疫苗的制備和檢測(cè)；其中，所述熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的制備和檢測(cè)方法包括采用的人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U251引自美國(guó)ATCC，按常規(guī)方法傳代培養(yǎng)；用RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至106/ml，將細(xì)胞置于40°C，5% CO2培養(yǎng)箱中池，取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入白樺酯酸至終濃度為10yg/ml，將細(xì)胞培養(yǎng)瓶移至37°C，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；收獲凋亡細(xì)胞，加入無(wú)菌PBS洗滌4次，獲得凋亡腫瘤細(xì)胞抗原；腫瘤細(xì)胞經(jīng)40°C處理池后用FITC-Armexin-V和PI雙標(biāo)細(xì)胞后進(jìn)行流式檢測(cè)計(jì)算凋亡率結(jié)果；軟瓊脂克隆法檢測(cè)細(xì)胞抗原體外成瘤能力；以及取制備抗原進(jìn)行內(nèi)毒素檢測(cè)。
全文摘要
本發(fā)明提出一種熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的制備與檢測(cè)方法，其應(yīng)用于熱休克凋亡腦膠質(zhì)瘤負(fù)載樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤疫苗的制備工藝，所述制備工藝采用先將腫瘤細(xì)胞處于熱休克狀態(tài)，誘導(dǎo)細(xì)胞高表達(dá)熱休克蛋白(HSP)，再用化學(xué)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡進(jìn)而制備成富含熱休克蛋白的凋亡細(xì)胞抗原，制備好的抗原與未成熟的DC細(xì)胞混合培養(yǎng)獲得成熟的DC疫苗。本發(fā)明采用熱休克法負(fù)載制備得到的DC疫苗成熟度高，可用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。
文檔編號(hào)G01N15/10GK102559598SQ20111044812
公開(kāi)日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月27日
發(fā)明者陸華 申請(qǐng)人:陸華