專利名稱：一種檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置及其方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明申請涉及一種檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置及其方法，屬于臨床免疫學(xué)檢測技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
古德帕斯丘綜合征是一種以腎臟損害為主的自身免疫性疾病，是一種增生性腎小球腎炎伴致命的肺出血疾病。主要表現(xiàn)為腎小球腎炎、肺出血、形成抗腎小球基底膜抗體三聯(lián)癥。組織學(xué)特征為免疫球蛋白沿腎小球基底膜不斷沉積。其病發(fā)率為每年每100萬居民中發(fā)生0.5至I例，是一種急發(fā)病，如果不經(jīng)治療，會出現(xiàn)腎衰和呼吸衰竭，病死率高達(dá)75% 90%。腎小球基底膜(GBM)在解剖學(xué)構(gòu)造上是上皮細(xì)胞和結(jié)締組織之間的屏障，VI膠原蛋白是GBM特有的膠原蛋白，它和其他分子(如層連蛋白、副層連蛋白)一起構(gòu)成基質(zhì)。六條α-鏈(多肽，含超過1650個(gè)氨基酸)中，每3條形成一個(gè)螺旋體，構(gòu)成了 VI膠原蛋白結(jié)構(gòu)的亞單位。古德帕斯丘綜合征特異性抗腎小球基底膜抗體作用于腎小球基底膜VI型膠原蛋白的29kDa NCl端。目前，通過證實(shí)腎小球腎炎、肺出血和抗腎小球基底膜VI膠原蛋白α-3鏈抗體三聯(lián)癥的存在可以診斷古德帕斯丘綜合征。臨床檢測抗腎小球基底膜抗體的常見方法包括放射免疫分析法、間接免疫熒光法、ELISA法。但這些方法都存在著不足之處。一、放射免疫分析法放射免疫分析法是利用同位素標(biāo)記的與未標(biāo)記的抗原，同抗體發(fā)生競爭性抑制反應(yīng)，是一種在無須采用生物測定方法的情況下用于檢測抗原的實(shí)驗(yàn)室測定方法。該法極其敏感而又極其特異，但其卻需要具備尖端復(fù)雜的設(shè)備，且成本也不低。同時(shí)，還需要特殊的預(yù)防措施，因?yàn)槠湟玫椒派湫晕镔|(zhì)。因此，如今放射免疫分析法在很大程度上已經(jīng)被ELISA所取代。二、間接免疫熒光法該法的基本原理是用特異性的抗體與載玻片中的抗原結(jié)合后形成抗原抗體復(fù)合物，繼用熒光抗體與抗原抗體復(fù)合物結(jié)合，形成抗原抗體熒光復(fù)合物。在熒光顯微鏡下，根據(jù)復(fù)合物的發(fā)光情況來確定所檢測的抗體。該方法由于結(jié)合在抗原抗體復(fù)合物上的熒光抗體增多，發(fā)出的熒光亮度強(qiáng)，因而其敏感性強(qiáng)。但是其不足也是明顯的:(I)在分析結(jié)果時(shí)無法根據(jù)分子量的大小區(qū)分非特異性識別；(2)操作相對復(fù)雜，需要價(jià)格較昂貴的熒光顯微鏡，在很多基層醫(yī)院難以推廣，也不太適用于標(biāo)本量較多的實(shí)驗(yàn)室；(3)熒光測定中的本底較高，熒光免疫技術(shù)用于定量測定有一定困難；(4)結(jié)果判定需要有經(jīng)驗(yàn)的專業(yè)人員，分析結(jié)果的客觀性不足；(5)只能進(jìn)行定性檢測，不能進(jìn)行定量測定。三、酶聯(lián)免疫吸附法
酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)被廣泛用于檢測抗腎小球基底膜抗體，但該方法也存在著下述的不足之處:(I)使用12 X 8型、6 X 8型、8 X 12型或整板型96孔專用微孔板作為抗原包被用具和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只能分成12批次、6批次、8批次或整板一次使用，無法進(jìn)行獨(dú)立的、單人份的檢測；(2)定量測定所用的試劑種類較多，每一種檢測試劑都要用試劑瓶來盛裝，并且每使用一種試劑時(shí)都需要更換吸液嘴來分別加注到微孔板的微孔中，不但試劑瓶種類多，力口注試劑的操作也極為繁瑣；(3)缺少對檢測信息的相應(yīng)標(biāo)注，只能通過查看試劑盒外包裝盒的標(biāo)識才能了解或知悉檢測試劑的生產(chǎn)批號及有效期信息，而且所知悉的信息在檢測過程中不受控，具有很大的隨意性；(4)檢測試劑在檢測過程中處于開放的空間，容易引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性；(5)檢測過程多采用手工操作，試劑或樣本的加量不很精確，操作過程極為繁瑣和復(fù)雜，容易發(fā)生操作差錯，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度較差；(6)在檢測項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上均為項(xiàng)目數(shù)X48/96人份，如果需要檢測10個(gè)項(xiàng)目，則試劑的配置及使用數(shù)須為10X48/96人份，如果只有一份樣本需要檢測10個(gè)不同的項(xiàng)目，也需要配置10X48/96人份的試劑，存在著不夠經(jīng)濟(jì)合理的缺點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明專利申請即是針對目前對于抗腎小球基底膜抗體的檢測中存在的上述不足之處，提供一種能夠進(jìn)行獨(dú)立單人份檢測的試劑裝置及其檢測方法。本發(fā)明專利申請基于酶聯(lián)免疫檢測的原理來實(shí)現(xiàn)抗腎小球基底膜抗體的檢測，是一種獨(dú)立的、單人份的、一次性的檢驗(yàn)方法；進(jìn)一步的，本發(fā)明申請還提供了與該方法配套的相應(yīng)的試劑裝置，該試劑裝置將抗腎小球基底膜抗體酶聯(lián)免疫檢測所需要的多種試劑盛裝在一個(gè)獨(dú)立的、多孔結(jié)構(gòu)的試劑裝置內(nèi)，通過分步加注移棄完成檢測步驟；進(jìn)一步的，所述的試劑裝置還可以通過專用的免疫分析儀進(jìn)行相應(yīng)的全自動檢測。本發(fā)明申請的目的之一是提供一種檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置，該目的是通過下述的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:具體來說，本發(fā)明申請所述的檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置為長條狀，包括具有八個(gè)孔位的基體和位于基體一端的手柄，八個(gè)孔位的排列順序從近手柄端開始依次為樣本孔、輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔、稀釋液孔、反應(yīng)孔和稀釋孔，樣本孔內(nèi)盛有待測樣本，輔劑孔供檢測有需要時(shí)加入輔助試劑使用，酶結(jié)合物孔內(nèi)盛有酶結(jié)合物溶液，底物孔內(nèi)盛有底物溶液，終止液孔內(nèi)盛有終止液，稀釋液孔內(nèi)盛有稀釋液，反應(yīng)孔為平底且具有高的光通透性，孔內(nèi)包被有腎小球基底膜蛋白抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測的液體樣本和檢測試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進(jìn)行吸光度測定，稀釋孔作為樣本稀釋容器，供稀釋樣本時(shí)用。進(jìn)一步的，所述的試劑裝置中，輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔和稀釋液孔上覆蓋有密封薄膜，該密封薄膜主要起到在運(yùn)輸和移動的過程中防止液體溢出的作用，另夕卜，也起到防塵防污染及增強(qiáng)穩(wěn)定性的作用。進(jìn)一步的，所述的手柄上粘貼有條形碼，該條形碼標(biāo)識有抗腎小球基底膜抗體檢測試劑及分析裝置的相關(guān)信息。更進(jìn)一步的，所述的信息包括檢測項(xiàng)目代碼、檢測試劑生產(chǎn)批號、試劑有效期、定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號。進(jìn)一步的，所述試劑裝置還包括若干個(gè)支撐柱，所述的支撐柱位于所述試劑裝置基體的下面，相鄰支撐柱之間間隔有一個(gè)以上的孔位，支撐柱的作用是為了加強(qiáng)基體的機(jī)械強(qiáng)度及平衡性。進(jìn)一步的，所述試劑裝置中反應(yīng)孔由外孔和內(nèi)孔構(gòu)成，外孔的底部開有底孔，內(nèi)孔穿過底孔且與底孔緊配合，外孔和內(nèi)孔之間留有防溢腔，防溢腔的作用是在反應(yīng)過程中，如果液體溢出，可以留在腔內(nèi)，不會污染儀器和其他試劑裝置。更進(jìn)一步的，所述試劑裝置中反應(yīng)孔的內(nèi)孔包被的腎小球基底膜蛋白抗原包括天然的IV型膠原蛋白或重組的腎小球基底膜蛋白。應(yīng)該明確的是，本發(fā)明申請中，所述試劑裝置中各孔位的大小、形狀并不加以限制，例如各孔位的開放口緣可為方形或圓形，其剖面的形狀也可以是方形、“U”型、或“V”型，但對于反應(yīng)孔來說，為了獲得較好的光通透性，底部應(yīng)為平底。進(jìn)一步的，所述的樣本孔內(nèi)加入的樣本人為待測血清或血漿，加入的量根據(jù)樣本孔的大小和檢測需要稀釋的倍數(shù)來確定。所述的輔劑孔是在必要的時(shí)候加入輔助試劑之用，例如吸附劑、中和劑、抑制劑、緩沖液等，以去除檢測過程中其他物質(zhì)對檢測反應(yīng)及結(jié)果的干擾。所述的酶結(jié)合物孔內(nèi)加入酶結(jié)合物溶液，主要成份為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG、或IgA、或IgM、或Ig(GAM)抗體，堿性磷酸酶標(biāo)記的抗人IgG、或IgA、或IgM、或Ig (GAM)抗體，葡萄糖氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG、或IgA、或IgM、或Ig(GAM)抗體,或β -半乳糖苷酶標(biāo)記的抗人IgG、或IgA、或IgM、或Ig(GAM)抗體。所述的底物孔中加入的底物溶液主要成份為TMB、OPD或ABTS。TMB作為一種新型安全的色原試劑，已逐步取代強(qiáng)致癌物聯(lián)苯胺和其他致癌性的聯(lián)苯胺衍生物，應(yīng)用于臨床化驗(yàn)、法醫(yī)檢驗(yàn)、刑事偵破及環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域，尤其是在臨床生化檢驗(yàn)方面，TMB作為過氧化物酶的新底物，在酶免疫分析法(EIA)和酶聯(lián)免疫吸附檢驗(yàn)法(ELISA)中獲得了廣泛的應(yīng)用。所述的終止液孔中加入的終止液主要成份為濃度是0.1 0.5M的硫酸或鹽酸溶液。所述的稀釋液孔中加入的稀釋液主要成份為磷酸鹽緩沖液、Tris緩沖液、硼酸鹽緩沖液或碳酸鹽緩沖液，并含一定濃度的牛血清白蛋白、疊氮化鈉等組份，用于排除樣本中小分子物質(zhì)的非特異性反應(yīng)的干擾及增加穩(wěn)定性。本發(fā)明申請的另一個(gè)目的是提供利用上述試劑裝置進(jìn)行抗腎小球基底膜抗體的檢測方法，所述的方法包括如下的步驟:I)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本；2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中；3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔；
4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中，將樣本進(jìn)行稀釋；5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋；6)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min ；7)用洗滌液對反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體；8)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體；9)重復(fù)步驟7)；10)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min ；11)從終止液孔中吸取終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長法測定，波長范圍在620nm 690nm。進(jìn)一步的，所述的方法包括如下的步驟:I)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本，體積至少為樣本孔容量的1/4 ；2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中，吸取的量為孔內(nèi)液體總量的7/10以上；3)移除稀釋液孔中的剩余液體，根據(jù)預(yù)期稀釋倍數(shù)從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔；4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中，將樣本進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)為I 10倍;5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋，稀釋倍數(shù)為I 100倍；6)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min ；7)用洗滌液對反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體；8)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體；9)重復(fù)步驟7)；10)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min ；11)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長法測定，波長范圍在620nm 690nm。更進(jìn)一步的，所述的方法包括如下的步驟:I)在所述的樣本孔中加入樣本80 150 μ L ;2)用精密加液器從稀釋液孔中吸取360 μ L液體到稀釋孔中；3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取180 μ L液體回稀釋液孔；4)用精密加液器從樣本孔中吸取20 μ L液體到稀釋液孔中，樣本10倍稀釋；5)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體20 μ L到稀釋孔中，樣本100倍稀釋；6)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體IOOyL到反應(yīng)孔中，25 37°C下，孵育60min后移除液體；7)用洗滌液對反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體；
8)用精密加液器從酶結(jié)合物孔中吸取100 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進(jìn)行反應(yīng)，25 37°C下，反應(yīng)30min后移除液體；9)重復(fù)步驟7)；10)用精密加液器從底物孔中吸取100 μ L的TMB底物溶液至反應(yīng)孔中反應(yīng)10 15min ；11)用精密加液器從終止液孔中吸取100 μ L的終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm和630nm雙波長條件下進(jìn)行檢測，讀取OD值。所述的洗滌液包括PBST溶液，PBST溶液是指PBS溶液加上Tween-20，PBS溶液是指磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Solution),滲透壓近似于生理?xiàng)l件,又有很強(qiáng)的pH緩沖能力，常用來洗細(xì)胞和作為細(xì)胞培養(yǎng)的基礎(chǔ)液，而Tween-20為一種非離子表面活性劑，對細(xì)胞生長可產(chǎn)生影響，Tween-20有復(fù)性抗原的作用，可提高特異性的識別能力。本發(fā)明申請所述測定抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置及其方法，不但具有其他檢測方法所具有的特異性強(qiáng)、靈敏度高，準(zhǔn)確性好、成本較低、使用要求不高、操作較為簡便、獲得檢測結(jié)果時(shí)間短、應(yīng)用廣泛等的優(yōu)點(diǎn)，而且解決了其他檢測方法的諸多不足，具體體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:1.所述的檢測方法運(yùn)用酶聯(lián)免疫分析原理，利用特定的分析儀器，采用配套專用的檢測試劑盒及分析試劑裝置，自動實(shí)現(xiàn)抗腎小球基底膜抗體定量測定，是一種全新的、適用的、實(shí)用的、高效的、快速的檢測抗腎小球基底膜抗體的方案；2.它是一種獨(dú)立的、單人份的檢測試劑及分析裝置，無需像通用ELISA法那樣使用12X8型、6X8型、8X 12型或整板型96孔專用酶聯(lián)免疫微孔板作為抗原包被用品和反應(yīng)容器，在使用時(shí)只要有一份樣本即可進(jìn)行對應(yīng)項(xiàng)目的檢測而無試劑的浪費(fèi)，如果樣本的數(shù)量超過一份，按實(shí)際樣本數(shù)使用該試劑及分析裝置即可；3.它將每一檢測必需的試劑盛裝在一個(gè)分析試劑裝置的試劑孔位內(nèi)，而無須將檢測試劑分別用不同的試劑瓶來盛裝，不但操作極為簡便，而且不容易造成操作差錯，從而保證檢測結(jié)果的正確性；4.它對每一個(gè)分析試劑裝置都有一個(gè)專用條形碼，條形碼的數(shù)值包含檢測所對應(yīng)的檢測項(xiàng)目代碼、檢測試劑生產(chǎn)批號、試劑有效期、定量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、具體的酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號等信息，不能隨意被改變，使用時(shí)嚴(yán)格受控，尤其是在使用超過有效期檢測試劑時(shí)，將被識別并阻止發(fā)出檢測報(bào)告，從而可以確保檢測的準(zhǔn)確性；5.它將每一檢測試劑進(jìn)行有效分隔和密封，不會引起各種試劑之間的交叉污染而影響檢測結(jié)果；6.它是一種專用于特定分析儀器的分析試劑裝置，在檢測過程中用全自動的精密加液器來加注檢測試劑、洗滌液或樣本，操作自動化，加量精確，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密
度高；7.在檢測項(xiàng)目成套試劑的數(shù)量配置及使用上，一切按實(shí)際使用需要來進(jìn)行配備即可，尤其是在對多項(xiàng)目檢測上，配備更為適量，不會出現(xiàn)超配置及使用情況。


圖1是本發(fā)明申請所述試劑裝置的一個(gè)實(shí)施例的剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是圖1所述實(shí)施例的平面俯視圖；圖3是本發(fā)明申請所述試劑裝置的另一個(gè)實(shí)施例的剖面結(jié)構(gòu)示意圖；圖4是本發(fā)明申請所述試劑裝置的再一個(gè)實(shí)施例中反應(yīng)孔的平面俯視圖；圖5和圖6是圖4所述試劑裝置中反應(yīng)孔中內(nèi)孔和外孔的裝配示意圖；其中，10為基體、20為手柄、30為條形碼、40為密封薄膜、50為支撐柱、11為樣本孔、12為輔劑孔、13為酶結(jié)合物孔、14為底物孔、15為終止液孔、16為稀釋液孔、17為反應(yīng)孔、18為稀釋孔、171為外孔、172為內(nèi)孔、173為防溢腔、174為底孔。
具體實(shí)施例方式以下結(jié)合具體的檢測裝置與實(shí)施步驟對本發(fā)明申請所述的試劑裝置和檢測方法進(jìn)行進(jìn)一步的描述，目的是為了公眾更好的理解本發(fā)明申請所述的技術(shù)方案，而不是對所述技術(shù)方案的限制。事實(shí)上，以相同或近似的原理，對所述試劑裝置進(jìn)行的改進(jìn)，包括其形狀、尺寸、所用材質(zhì)的改變，以及相應(yīng)結(jié)構(gòu)的增減或替換，都在本發(fā)明申請所要求保護(hù)的技術(shù)方案之內(nèi)。實(shí)施例一檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置一如圖1-2所示，本發(fā)明申請所述的檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置為長條狀，包括具有八個(gè)孔位的基體10和位于基體10 —端的手柄20，八個(gè)孔位的排列順序從近手柄10端開始依次為樣本孔11、輔劑孔12、酶結(jié)合物孔13、底物孔14、終止液孔15、稀釋液孔16、反應(yīng)孔17和稀釋孔18，所述的樣本孔11內(nèi)盛有待測樣本，輔劑孔12供檢測需要時(shí)加入輔助試劑使用，在本發(fā)明申請所述的檢測方法中輔劑孔12內(nèi)未加入任何試劑，酶結(jié)合物孔13內(nèi)加入酶結(jié)合物溶液，底物孔14內(nèi)加入底物溶液，終止液孔15加入終止液，稀釋液孔16內(nèi)加入稀釋液，反應(yīng)孔17為平底并具有很高的光通透性，當(dāng)盛裝無色或空白試劑溶液時(shí)，對可見光或紫外光或熒光的吸光度值接近于零，孔內(nèi)已包被有高度純化的腎小球基底膜蛋白組成的抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測的液體樣本和檢測試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進(jìn)行吸光度測定，稀釋孔18作為樣本稀釋容器，供稀釋樣本時(shí)用。進(jìn)一步的，所述的試劑裝置中，輔劑孔12、酶結(jié)合物孔13、底物孔14、終止液孔15和稀釋液孔16上覆蓋有密封薄膜40，該密封薄膜40主要起到在運(yùn)輸和移動的過程中，防止液體溢出的作用，另外，也起到防塵防污染及增加穩(wěn)定性的作用。進(jìn)一步的，所述的手柄20上粘貼有條形碼30，該條形碼30標(biāo)識有抗腎小球基底膜抗體檢測試劑及分析裝置的信息，所述的信息包括檢測項(xiàng)目代碼、檢測試劑生產(chǎn)批號、試劑有效期、定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號。實(shí)施例二檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置二如圖3所示，本實(shí)施例中的檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置，其基本結(jié)構(gòu)與實(shí)施例一中的試劑裝置相同，在所述試劑裝置還包括若干個(gè)支撐柱50，所述的支撐柱50位于所述試劑裝置中基體10的下面，相鄰支撐柱50之間間隔有一個(gè)以上的孔位，支撐柱50的作用是為了加強(qiáng)基體的機(jī)械強(qiáng)度及平衡性。實(shí)施例三檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置三如圖4-6所示，為本發(fā)明申請所述檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置的優(yōu)選的實(shí)施例，其基本結(jié)構(gòu)與實(shí)施例一或?qū)嵤├嗤?，區(qū)別在于反應(yīng)孔17為可拆卸式的結(jié)構(gòu)，反應(yīng)孔17由外孔171和內(nèi)孔172構(gòu)成，外孔171的底部開有底孔174，內(nèi)孔172穿過底孔174且與底孔174緊配合，外孔171和內(nèi)孔172之間留有防溢腔173，防溢腔173的作用是在反應(yīng)過程中，如果液體溢出，可以留在腔內(nèi)，防止污染儀器和其他試劑裝置。進(jìn)一步的，所述內(nèi)孔和外孔的配合固定方式還可以是將內(nèi)孔的外壁設(shè)計(jì)為兩段，上段外壁的厚度大于下段外壁的厚度，外孔的底孔的直徑與內(nèi)孔下段的外徑相等，這樣將內(nèi)孔下段插入底孔中，內(nèi)孔的上段恰好卡在底孔之上，同樣可以起到緊固的效果。實(shí)施例四試劑裝置或試劑盒的制作-間接法檢測抗腎小球基底膜抗體本發(fā)明是基于酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)上的一種更加簡單、準(zhǔn)確、有效的一套方法，其采用的基本原理為間接酶聯(lián)免疫法:將由高度純化的腎小球基底膜蛋白組成的抗原吸附于固相上，通過孵育使稀釋的人血清或血漿中的特異性抗體與抗原結(jié)合，洗滌去除未與固相結(jié)合的抗體，加入用辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人免疫球蛋白酶聯(lián)物，孵育，去除未結(jié)合的酶聯(lián)物，加入酶色原底物，產(chǎn)生的顏色與檢測樣本中的特異性抗體濃度成正比。這種方法主要是通過用于酶聯(lián)免疫檢測的分析試劑裝置和配套試劑來實(shí)現(xiàn)抗腎小球基底膜抗體的免疫檢測。通過這種酶聯(lián)免疫方法，同時(shí)運(yùn)用特定分析儀器的分析試劑裝置和試劑，可快速，準(zhǔn)確的做出判斷用于輔助臨床診斷。以孔位11作為樣本孔，在使用時(shí)加入液體樣本，供檢測時(shí)取用；以孔位12作為輔劑孔，用密封薄膜封口，供檢測備用；以孔位13作為酶結(jié)合物孔，加入酶結(jié)合物溶液用密封薄膜封口，供檢測時(shí)取用；以孔位14作為底物孔，加入TMB底物溶液后用密封薄膜封口，供檢測時(shí)用；以孔位15作為終止液孔，加入終止液后用密封薄膜封口，供檢測時(shí)用；以孔位16作為稀釋液孔，加入樣本稀釋液后用密封薄膜封口，供檢測時(shí)用；以孔位17作為包被物孔/反應(yīng)孔/比色孔，已包被有高度純化的腎小球基底膜蛋白組成的抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測的液體樣本和檢測試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進(jìn)行吸光度測定；以孔位18作為稀釋孔，供稀釋樣本時(shí)用；在手柄20粘貼有抗腎小球基底膜蛋白抗體檢測試劑及分析裝置信息的條形碼30，該條形碼包括檢測項(xiàng)目代碼、檢測試劑生產(chǎn)批號、試劑有效期、定量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號。按照上述方法制備若干分析裝置，另外制備相應(yīng)的校準(zhǔn)品和質(zhì)控物。這樣即構(gòu)成了完整的抗腎小球基底膜抗體測定試劑盒組份。將檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置及配套使用組份裝入試劑盒的外包裝盒，即制成檢測抗腎小球基底膜抗體試劑盒。實(shí)施例五抗腎小球基底膜抗體IgG的檢測方法本發(fā)明申請?zhí)峁┮环N利用上述試劑裝置進(jìn)行抗腎小球基底膜抗體IgG檢測的方法，所述的方法包括如下的步驟:1.在所述的樣本孔中加入樣本80 150μ L ;2.用精密加液器從稀釋液孔中吸取360 μ L液體到稀釋孔中；3.移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取180 μ L液體回稀釋液孔；4.用精密加液器從樣本孔中吸取20 μ L液體到稀釋液孔中，樣本10倍稀釋；
5.用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體20 μ L到稀釋孔中，樣本100倍稀釋；6.用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體IOOyL到反應(yīng)孔中，25°C下，孵育60min后移除液體；7.用洗滌液對反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體；8.用精密加液器從酶結(jié)合物孔中吸取100 μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進(jìn)行反應(yīng)，25°C下,反應(yīng)30min后移除液體；9.重復(fù)步驟7;10.用精密加液器從底物孔中吸取100 μ L的TMB底物溶液至反應(yīng)孔中反應(yīng)10 15min ；11.用精密加液器從終止液孔中吸取100 μ L的終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm和630nm雙波長條件下進(jìn)行檢測，讀取OD值。實(shí)施例六通過全自動分析儀實(shí)現(xiàn)對樣本中抗腎小球基底膜抗體IgG檢測的分析操作流程進(jìn)一步的，本發(fā)明申請所述的檢測方法還包括相應(yīng)配合使用的全自動分析儀，該全自動分析儀包括一個(gè)分析裝置托盤，它是與分析裝置的形狀相配套的，一共有30個(gè)位置可供分析裝置放置，用于檢測分析，此外還包括模塊式集成機(jī)械電子結(jié)構(gòu)及軟件控制系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)自動化的加注、稀釋、孵育、洗滌、讀數(shù)、分析過程。每個(gè)位置獨(dú)立定量分析，保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。儀器運(yùn)行后，分析裝置托盤會自行轉(zhuǎn)動到不同的位置進(jìn)行加注，稀釋，孵育，洗滌以及讀數(shù)的步驟。具體的操作包括如下的步驟:(I)檢查程序的準(zhǔn)備:按要求配置好相應(yīng)的溶液，包括洗滌緩沖液，清洗液或消毒液，配制完畢裝入相應(yīng)的液體瓶中；(2)與外接計(jì)算機(jī)相連:儀器和外接計(jì)算機(jī)相連，從而將儀器正常工作所得結(jié)果交由集中式系統(tǒng)處理；(3)開機(jī):打開儀器開關(guān)后，通過外接計(jì)算機(jī)的工作界面對儀器設(shè)置自動或手動自檢，從而為儀器的正常運(yùn)行做準(zhǔn)備；(4)預(yù)熱:在開機(jī)后，儀器會啟動加熱程序，將溫度調(diào)至待檢溫度；(5)沖洗檢查；(6)抗腎小球基底膜抗體IgG的檢測:I)從有密封口的一邊打開包裝袋，取用所需數(shù)量的分析試劑裝置，排除空氣后將袋口封緊；2)檢查分析試劑裝置TMB底物孔中的溶液，應(yīng)為無色澤改變，否則應(yīng)棄掉；3)分別在每個(gè)分析試劑裝置的樣本孔中加50 120 μ L未稀釋的樣本，建議加100 μ L的樣本，每更換一個(gè)批號的試劑，應(yīng)取其中一個(gè)分析試劑裝置及校準(zhǔn)品進(jìn)行儀器校準(zhǔn)；4)按照所需檢測的數(shù)量在分析裝置托盤中放入相對應(yīng)數(shù)量的分析試劑裝置，點(diǎn)擊“開始”、“掃描”，儀器可自動地掃描分析試劑裝置條碼、質(zhì)控物條碼和校準(zhǔn)品條碼，然后對樣本進(jìn)行編號，或通過外部條碼掃描儀對樣本條碼進(jìn)行掃描；5)點(diǎn)擊“運(yùn)行”，儀器根據(jù)條碼信息自動運(yùn)行，根據(jù)條碼，程序首先檢測校準(zhǔn)品，通過校準(zhǔn)，修正標(biāo)準(zhǔn)曲線；其次對質(zhì)控物進(jìn)行檢測，如果其檢測結(jié)果在標(biāo)示的范圍內(nèi)，則表示檢測的標(biāo)準(zhǔn)曲線符合要求，可用于樣本的檢測，最后開始樣本的檢測程序；6)稀釋:加注針刺破孔位密封薄膜自動吸取稀釋液360 μ L到稀釋孔中，并移除稀釋液孔中的剩余液體，再從稀釋孔中吸取稀釋液180μ L回稀釋液孔，加注針從樣本孔自動吸取樣品20 μ L到稀釋液孔進(jìn)行樣本稀釋，再從稀釋液孔中吸取20 μ L到稀釋孔，動作完成后，被稀釋的樣本被加注針移至反應(yīng)孔孵育30 60min，通常儀器設(shè)定為60min，之后移除液體；7)洗滌:沖洗針從相應(yīng)的液瓶中吸取一定量的洗滌緩沖液對試劑孔進(jìn)行三到五次洗滌后移除液體；8)加注針刺破酶結(jié)合物孔密封薄膜吸取IOOyL辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)30 60min后移除液體，通常儀器設(shè)定為30min ；9)重復(fù)步驟7);10)加注針刺破TMB底物孔密封薄膜吸取100 μ L的TMB底物溶液至反應(yīng)孔反應(yīng)10 20min,通常儀器設(shè)定為IOmin ；11)加注針刺破終止液孔密封薄膜吸取100 μ L的終止液加注至反應(yīng)孔，在I IOmin內(nèi)于450nm/630nm雙波長下讀取OD值。(7)檢測結(jié)果:當(dāng)檢測程序運(yùn)行完畢，可通過計(jì)算機(jī)上的數(shù)據(jù)處理軟件分析，最后生成報(bào)告單以便查閱；(8)關(guān)機(jī):檢測結(jié)束后，在儀器關(guān)機(jī)前，必須啟動清洗循環(huán)，這樣可以避免來自溶液中的殘留鹽份在液路中結(jié)晶，避免損壞儀器或?qū)е聶z測結(jié)果無效，清洗完成后，儀器電源自動關(guān)閉。實(shí)施例七患者樣本中抗腎小球基底膜抗體IgG的檢測應(yīng)用、結(jié)果分析以及檢測的質(zhì)控采用實(shí)施例五的操作方法與程序，使用實(shí)施例四所述的試劑盒，可用于定量測定人血清或血漿中的抗腎小球基底膜抗體IgG水平?？鼓I小球基底膜抗體IgG是抗基底膜抗體型腎小球腎炎特異性抗體，包括古德帕斯丘綜合征、急進(jìn)型腎小球腎炎及免疫復(fù)合物型腎小球腎炎。檢測古德帕斯丘綜合征患者血清中自身抗體對診斷和治療均非常重要。約低于1/3(15%左右)患者有腎小球基底膜抗體?？筛鶕?jù)檢測的結(jié)果來輔助臨床診斷，初步判斷患者患病的情況，最終確診應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他診斷方法/指標(biāo)進(jìn)行綜合考慮。以下為檢測結(jié)果的分析:(I)參考值(參考范圍)正常參考值:0 10AU/mL ;檢測一定數(shù)量(具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)的陰性樣本，結(jié)果的平均值加3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差(即I + 3SD )為參考值的上限。各實(shí)驗(yàn)室可根據(jù)實(shí)際情況建立適宜的參考范圍。(2)檢測結(jié)果的解釋若樣本值> 10AU/mL,提示抗體水平升高,但應(yīng)結(jié)合臨床表現(xiàn)或其他診斷方法/指標(biāo)進(jìn)行確診。
為了方便臨床應(yīng)用，可參考如下判斷規(guī)則:樣本值<8AU/mL陰性8AU/mL彡樣本值彡12AU/mL 可疑樣本值> 12AU/m L陽性當(dāng)檢測結(jié)果為可疑時(shí)，應(yīng)重新檢測，若仍為可疑，需在2 3周后重新采集樣本檢測。以下是將實(shí)施例六的檢測過程重復(fù)檢測陽性和陰性質(zhì)控血清，檢查結(jié)果的再現(xiàn)
性，獲得如下的結(jié)果:
權(quán)利要求
1.一種檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置，其特征在于:所述的試劑裝置為長條狀，包括具有八個(gè)孔位的基體和位于基體一端的手柄，八個(gè)孔位的排列順序從近手柄端開始依次為樣本孔、輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔、稀釋液孔、反應(yīng)孔和稀釋孔，樣本孔內(nèi)盛有待測樣本，輔劑孔供檢測有需要時(shí)加入輔助試劑使用，酶結(jié)合物孔內(nèi)盛有酶結(jié)合物溶液，底物孔內(nèi)盛有底物溶液，終止液孔內(nèi)盛有終止液，稀釋液孔內(nèi)盛有稀釋液，反應(yīng)孔為平底且具有高的光通透性，孔內(nèi)包被有腎小球基底膜蛋白抗原，并作為反應(yīng)容器加注待測的液體樣本和檢測試劑及洗滌液，反應(yīng)終止后進(jìn)行吸光度測定，稀釋孔作為樣本稀釋容器，供稀釋樣本時(shí)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑裝置，其特征在于:所述的試劑裝置中，輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔和稀釋液孔上覆蓋有密封薄膜。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑裝置，其特征在于:所述的手柄上粘貼有條形碼，該條形碼標(biāo)識有抗腎小球基底膜抗體檢測試劑及分析裝置的相關(guān)信息。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑裝置，其特征在于:所述的信息包括檢測項(xiàng)目代碼、檢測試劑生產(chǎn)批號、試劑有效期、定量檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線參數(shù)、酶聯(lián)免疫反應(yīng)類型、試劑及分析裝置的序列號。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑裝置，其特征在于:所述試劑裝置還包括若干個(gè)支撐柱，所述的支撐柱位于所述試劑裝置中基體的下面，相鄰支撐柱之間間隔有一個(gè)以上的孔位。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑裝置，其特征在于:所述試劑裝置中反應(yīng)孔由外孔和內(nèi)孔構(gòu)成，外孔的底部開有底孔，內(nèi)孔穿過底孔且與底孔緊配合，外孔和內(nèi)孔之間留有防溢腔。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑裝置，其特征在于:所述試劑裝置中反應(yīng)孔的內(nèi)孔包被的腎小球基底膜蛋白抗原包括天然的IV型膠原蛋白或重組的腎小球基底膜蛋白。`
8.一種利用權(quán)利要求1-7所述的試劑裝置進(jìn)行抗腎小球基底膜抗體檢測的方法，其特征在于:所述的方法包括如下的步驟: 1)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本； 2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中； 3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔； 4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中,將樣本進(jìn)行稀釋； 5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋； 6)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min； 7)用洗滌液對反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體； 8)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體； 9)重復(fù)步驟7)； 10)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min； 11)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長法測定，波長范圍在620nm 690nm。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟:1)在所述的樣本孔中加入未稀釋的樣本，體積至少為樣本孔容量的1/4； 2)從稀釋液孔中吸取稀釋液加入稀釋孔中，吸取的量為孔內(nèi)液體總量的7/10以上； 3)移除稀釋液孔中的剩余液體，根據(jù)預(yù)期稀釋倍數(shù)從稀釋孔中吸取部分液體回稀釋液孔； 4)從樣本孔中吸取樣本加入稀釋液孔中，將樣本進(jìn)行稀釋，稀釋倍數(shù)為I 10倍； 5)從稀釋液孔中吸取液體加入稀釋孔中，將樣本進(jìn)行進(jìn)一步的稀釋，稀釋倍數(shù)為I 100 倍； 6)從稀釋孔中吸取液體加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，孵育30 60min； 7)用洗滌液對反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體； 8)從酶結(jié)合物孔中吸取酶結(jié)合物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)30 60min后移除液體； 9)重復(fù)步驟7)； 10)從底物孔中吸取底物溶液加入反應(yīng)孔中，25 37°C的條件下，反應(yīng)10 20min； 11)從終止液孔中吸取終止液加入反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm讀取OD值，或選擇雙波長法測定，波長范圍在620nm 690nm。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步驟: 1)在所述的樣本孔中加入樣本80 150μ L ; 2)用精密加液器從稀釋液孔中吸取360μ L液體到稀釋孔中； 3)移除稀釋液孔中的剩余液體，從稀釋孔中吸取ISOyL液體回稀釋液孔； 4)用精密加液器從樣本孔中吸取20μ L液體到稀釋液孔中，樣本10倍稀釋； 5)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體20μ L到稀釋孔中，樣本100倍稀釋； 6)用精密加液器從稀釋液孔中吸取液體100μ L到反應(yīng)孔中，25 37°C下，孵育60min后移除液體； 7)用洗滌液對反應(yīng)孔進(jìn)行3 5次洗滌后移除液體； 8)用精密加液器從酶結(jié)合物孔中吸取100μ L辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體酶結(jié)合物溶液至反應(yīng)孔進(jìn)行反應(yīng)，25 37°C下，反應(yīng)30min后移除液體； 9)重復(fù)步驟7)； 10)用精密加液器從底物孔中吸取IOOyL的TMB底物溶液至反應(yīng)孔中反應(yīng)10 15min ； 11)用精密加液器從終止液孔中吸取100μ L的終止液加注至反應(yīng)孔中，I IOmin內(nèi)于450nm和630nm雙波長條件下進(jìn)行檢測，讀取OD值。
全文摘要
本發(fā)明申請公開一種檢測抗腎小球基底膜抗體的試劑裝置及其方法，所述的試劑裝置為長條狀，包括具有八個(gè)孔位的基體和位于基體一端的手柄，八個(gè)孔位的排列順序從近手柄端開始依次為樣本孔、輔劑孔、酶結(jié)合物孔、底物孔、終止液孔、稀釋液孔、反應(yīng)孔和稀釋孔。本發(fā)明申請基于酶聯(lián)免疫檢測的原理，利用上述的試劑裝置對抗腎小球基底膜抗體進(jìn)行檢測，是一種獨(dú)立的、單人份的分析檢測方法，并且可以與相應(yīng)的特定分析儀器配合使用，在檢測過程中，用全自動的精密加液器來加注檢測試劑或樣本，具有操作自動化，加量精確，檢測結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度高的優(yōu)點(diǎn)，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號G01N33/543GK103185781SQ201110451878
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月30日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月30日
發(fā)明者胡德明, 劉清波, 何林, 陽輝 申請人:深圳市亞輝龍生物科技有限公司