專利名稱：一種分析測定食品中多種內(nèi)分泌干擾物的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及食品內(nèi)內(nèi)分泌干擾物的分析測定方法，具體涉及一種分析測定奶粉和液態(tài)奶中多種內(nèi)分泌干擾物的方法。尤其是采用固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜分析方法同時分析奶粉和液態(tài)奶中26種4類內(nèi)分泌干擾物的方法。
背景技術(shù)：
研究顯示，內(nèi)分泌干擾物能夠干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)，給動物或者人造成有害影響的往往是自然的或者與人類活動相關(guān)的化合物。據(jù)文獻(xiàn)報道，暴露于內(nèi)分泌干擾物與性早熟，前列腺癌，子宮癌和乳腺癌等激素相關(guān)疾病的發(fā)生有關(guān)。食品是人們暴露于內(nèi)分泌干擾物的重要途徑。牛奶和奶制品作為日常生活中重要的食品之一，其安全受到人們的強(qiáng)烈關(guān)注。然而，據(jù)調(diào)查，奶牛的現(xiàn)代養(yǎng)殖為了提高牛奶產(chǎn)量，需要使奶牛不斷的受孕，盡可能延長產(chǎn)奶期，同時縮短干涸期，這種養(yǎng)殖方式導(dǎo)致了大部分牛奶來自于懷孕中奶牛，因此有可能使牛奶中的內(nèi)性激素(孕激素、雄激素和雌激素、)的含量增加。有報道，牛奶的消費(fèi)量與卵巢癌、乳腺癌和前列腺有關(guān)，同時已在牛奶或者奶制品中檢測出孕酮、雄烯二酮、雌酮和雌二醇等內(nèi)源性激素。烷基酚類(如辛基酚和壬基酚)和雙酚A是常用的工業(yè)原料，主要用于烷基酚聚氧乙烯醚，環(huán)氧樹脂和聚碳酸酯的生產(chǎn)，最終制成產(chǎn)品，如嬰兒奶瓶等。該些產(chǎn)品在反復(fù)使用或者加熱等因素的作用下，可直接或者降解后釋放出烷基酚單體和雙酚A進(jìn)入到食品中。有研究在牛奶，奶粉和嬰兒配方食品中已經(jīng)檢測出壬基酚和雙酚A等酚類。為保障牛奶及其奶制品的安全，評價人群通過食品暴露于內(nèi)分泌干擾物的程度，探討內(nèi)分泌干擾物與疾病的關(guān)系，建立牛奶和奶制品中多種內(nèi)分泌干擾物的有效分析方法是第一步。目前，食品中內(nèi)分泌干擾物的分析方法主要為氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法和液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法。由于氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法在分析內(nèi)分泌干擾物時需要衍生化，而且靈敏度低于液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法，所以前者在食品內(nèi)分泌干擾物分析中的地位，正在逐步被后者取代。液相色譜三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)法在分析孕激素和雄激素時，一般在離子源為陽離子模式下分析，采用的流動相為甲醇和水，可以加甲酸或者不加；而在雌激素和酚類(烷基酚和雙酚A)分析時，一般在離子源為陰離子模式下分析，采用的流動相為乙腈和水，可以加氨水或者不加。然而，在研究中需要同時分析孕激素、雄激素、雌激素和酚類時，是將它們分為2組，即孕激素、雄激素與雌激素和酚類，按上述分析方法分2次測定，既耗時又費(fèi)溶劑。三重四極桿在定量分析時，通常采用多反應(yīng)監(jiān)測模式用以獲得較高的靈敏度，然而在此模式下檢測離子以外的用于結(jié)構(gòu)解釋的碎片離子信息被丟棄；而在離子全掃描模式下，又損失較大的靈敏度。四極桿飛行時間質(zhì)譜儀可以較高靈敏度獲得全部碎片離子的精確分子量，克服了三重四極桿不能兼顧結(jié)構(gòu)解釋和靈敏度的困境。因此在定量分析中，四極桿飛行時間質(zhì)譜儀也逐漸受到關(guān)注。然而，在食品內(nèi)分泌干擾物分析中，由于內(nèi)分泌干擾物的含量常常極低(ng/kg或者pg/kg級)，此濃度水平與四極桿飛行時間質(zhì)譜儀的檢出限接近，四極桿飛行時間質(zhì)譜儀難以準(zhǔn)確分析食品中內(nèi)分泌干擾物。因此，有關(guān)領(lǐng)域需要尋求及建立一次色譜進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)上述4類內(nèi)分泌干擾物同時準(zhǔn)確分析測定的方法。尤其是改善四極桿飛行時間質(zhì)譜儀靈敏度，以使其能適應(yīng)食品中內(nèi)分泌干擾物的準(zhǔn)確分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種食品內(nèi)內(nèi)分泌干擾物的分析測定方法，具體涉及一種分析測定奶粉和液態(tài)奶中多種內(nèi)分泌干擾物的方法。尤其是采用固相萃取-超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜分析方法同時分析奶粉和液態(tài)奶中26種4類內(nèi)分泌干擾物的方法。本發(fā)明方法能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中不能實(shí)現(xiàn)一次色譜進(jìn)樣同時分析所述述4類內(nèi)分泌干擾物的缺陷，同時能提高四極桿飛行時間質(zhì)譜儀的靈敏度，實(shí)現(xiàn)食品中內(nèi)分泌干擾物四極桿飛行時間質(zhì)譜儀的準(zhǔn)確分析。本發(fā)明所述的奶粉和液態(tài)奶中26種4類內(nèi)分泌干擾物包括下述10種雌激素包括雌三醇、雌二醇、α-雌二醇、馬烯雌留酮、17 α-乙炔雌二醇、雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚和2-甲氧雌二醇；7種孕激素包括孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、炔諾酮、21 α -羥孕酮、17 α -羥孕酮和甲基炔諾酮；3種酚類包括雙酚A、4-tert- 丁基酚和4-tert-辛基酚；6種雄性激素包括睪酮、雄烯二酮、康力龍、甲睪酮、群勃龍和諾龍。本發(fā)明采用下述技術(shù)方案分析測定食品中多種內(nèi)分泌干擾物:用水充分溶解樣品，加入與水混溶的有機(jī)溶劑超聲提取待測物后，加入鈉鹽，使有機(jī)溶劑與水相分離，實(shí)現(xiàn)液液萃?。蝗《坑泻写郎y物的機(jī)溶劑，經(jīng)C18填料的固相萃取凈化，丹酰氯衍生(使雌激素和酚類的離子化方式從陰離子模式轉(zhuǎn)變?yōu)殛庪x子模式)后，超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀分析。具體而言，本發(fā)明的分析測定食品中多種內(nèi)分泌干擾物的方法，其特征在于，其包括步驟:I)樣品前處理:取一定量樣品用水充分溶解后，加入有機(jī)溶劑超聲提取待測物(如果為液態(tài)奶側(cè)直接加入有機(jī)溶劑超聲提取待測物)，加入鈉鹽，通過離心使水相與有機(jī)相分離；取含有待測物的有機(jī)溶劑提取液，用微氮?dú)饬鞔抵两珊?，純水?fù)溶后，過C18填料固相萃取小柱，用乙腈水溶液洗脫待測物后；向洗脫液中加入鈉鹽，通過離心使乙腈與水相分離；取乙腈提取液，用微氮?dú)饬鞔抵两珊?，用丹酰氯衍生?0°C反應(yīng)一定時間得待測物，冷卻至室溫后，直接進(jìn)樣分析；本發(fā)明所述待測物為雄激素、孕激素和丹?；萍に睾头宇惖娜芤?；尤其包括10種雌激素:雌三醇、雌二醇、α-雌二醇、馬烯雌留酮、17 α-乙炔雌二醇、雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚和2-甲氧雌二醇；7種孕激素:孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、炔諾酮、21α-羥孕酮、17α-羥孕酮和甲基炔諾酮；3種酚類:雙酚A、4-tert-丁基酚和4-tert-辛基酚；6種雄性激素:睪酮、雄烯二酮、康力龍、甲睪酮、群勃龍和諾龍。本發(fā)明中，加入的鈉鹽為氯化鈉或者硫酸鈉，優(yōu)選加入氯化鈉；本發(fā)明中，所說的有機(jī)溶劑選自乙腈或者丙酮，其中優(yōu)選乙腈；本發(fā)明中，所說的固相萃取乙腈洗脫溶液濃度為I ;50_80，其中優(yōu)選1: 60 ;
本發(fā)明中，所說的衍生化溫度為60-80°C，其中優(yōu)選60°C ；本發(fā)明中，所說的衍生化時間為10-30分鐘，其中優(yōu)選10分鐘；2)超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀測定色譜柱采用C18柱，流動相為IOMm的甲酸銨水溶液和乙腈溶液，離子源采用陽離子模式；其中，色譜條件:色譜柱:C18(柱長:100mm柱內(nèi)徑:2.1mm填料粒徑:1.7μ m);流動相:10mM的乙酸銨的甲醇和水；流速:0.3mL/min ;梯度洗脫；色譜柱溫度:40°C ;進(jìn)樣量為:10 μ L ；質(zhì)譜條件:電噴霧離子源(陽離子模式);霧化氣:氮?dú)猓慌鲎矚?氬氣；毛細(xì)管電壓:3.0kV ;去溶劑氣溫度:400°C ;去溶劑氣流量:600L/h ;源溫度:120°C ;采樣錐電壓:40V ；錐孔氣流量:40L/h。3)計算濃度:采用基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法，以峰面積計算樣品中26種內(nèi)分泌干擾物的含量。本發(fā)明方法的優(yōu)點(diǎn)在于:1，實(shí)現(xiàn)一次色譜進(jìn)樣同時分析4類內(nèi)分泌干擾物，2，同時能提高四極桿飛行時間質(zhì)譜儀的靈敏度，實(shí)現(xiàn)食品中內(nèi)分泌干擾物四極桿飛行時間質(zhì)譜儀的準(zhǔn)確分析。為了便于理解，以下將通過具體的附圖和實(shí)施例對本發(fā)明的分析測定食品中多種內(nèi)分泌干擾物的方法進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特別指出的是，具體實(shí)例和附圖僅是為了說明，顯然本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)本文說明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納入本發(fā)明的范圍內(nèi)。


圖1為雌激素母離子提取色譜圖。圖2為雄激素和酚類母離子提取色譜圖。圖3為孕激素母離子提取色譜圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1測定奶粉中26種內(nèi)分泌干擾物I，儀器和試劑:ACQUITY超高效液相色譜儀(美國Waters)，SYNAPT G2高分辨率飛行時間質(zhì)譜儀(美國Waters)，2200T超聲波清洗器(上海安譜)，TGL-10B高速臺式離心機(jī)(上海安亭)，KD200氮?dú)獯祾邇x(杭州奧盛)；12位固相萃取儀(德國CNW) ;C18固相萃取柱(上海迪馬，500mg，3mL) ；LC-MS 級乙腈(美國 Fisher)，LC-MS 級純水(美國 Fisher)，LC-MS 級乙酸乙酯(美國Fisher)，優(yōu)級純氯化鈉(上海國藥集團(tuán))。標(biāo)準(zhǔn)品:10種雌激素、7種孕激素和3種酚類均購于美國Sigma，6種雄激素購于德國Dr.Ehrenstorfer ;標(biāo)準(zhǔn)品純度均大于97.8 %。標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液的配置:分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品10.0mg于IOmL棕色容量瓶中，用甲乙腈定容之刻度，搖勻得到1.0mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，于-20°C保存?；旌蠘?biāo)準(zhǔn)工作溶液的配置:用乙腈/水(10/90，V/V)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液(1.0mg/mL) IOOO倍得到lug/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，然后逐級稀釋得到所需的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。2，分析方法2.1樣品前處理稱取混勻的奶粉樣品4.0g,置于50mL具塞塑料離心管中，加入IOmL純水，充分混勻，超聲波提取IOmin后,加入20mL乙腈,振搖2min,再次超聲波提取IOmin,然后加入3g氯化鈉，振搖2min,離心IOmin (7000rpm),取IOmL上清液于5.0mL離心管中；加入3mL正己烷，振搖Imin后，靜置5min，去除上層正己烷，重復(fù)操作I次，下層乙腈提取液用微氮?dú)饬鞔抵两?約剩余100 μ L),剩余物用2mL純水復(fù)溶后,待凈化；預(yù)先依次用6mL乙腈和5%乙腈水溶液活化平衡C18固相萃取小柱后，將上述2mL待凈化液全部上柱，再用10mL60%乙腈水溶液洗脫待測物；上樣和洗脫的流速控制在3mL/min ；向洗脫液中加入1.5g氯化鈉，振搖混勻靜置分層后，取3mL上層乙腈，用氮?dú)饬鞔抵两?，剩余物用于丹酰氯衍生；向上述剩余物中加?00 μ L碳酸鈉緩沖溶液(pH = 10.0)和100 μ L丹酰氯丙酮溶液(lmg/mL)，漩渦混勻，60°C水浴條件下，反應(yīng)20min，冷卻至室溫后，直接進(jìn)樣分析。2.2色譜條件和質(zhì)譜條件Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100mmX2.1mm，1.8μ m);流動相:0.1% 甲酸的水溶液(A)和0.1 %甲酸的乙腈溶液(B);梯度洗脫程序=O-1min內(nèi)保持10% B，l-3min內(nèi)10% B線性升至50% B，3-1 Imin內(nèi)50% B線性升至80% B，ll_18min內(nèi)80% B線性升至 95% B, 18-21min 內(nèi) 95% B 線性升至 100% B，21-21.5min 內(nèi) 100% B 線性降至 10% B,21.5-24min內(nèi)保持10% B ;流速:0.3mL/min ;柱溫:40°C;樣品室溫度:5°C;進(jìn)樣量=IOyL0ESI陽離子模式；毛細(xì)管電壓3.0Kv ;錐孔電壓:40Kv ;提取錐電壓:4ν ;離子源溫度:120°C ;脫溶劑氣(氮?dú)?溫度:40(TC ;錐孔氣流量:40L/h ;脫溶劑氣流量:600L/h ;碰撞氣:氬氣；MS模式采集參數(shù):質(zhì)量范圍:100-800Da，掃描時間:0.2s。2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢出限用經(jīng)檢測26種內(nèi)分泌干擾物含量均低于檢出限的空白奶粉作為基質(zhì)樣品，按所述樣品前處理方法得到經(jīng)C18固相萃取凈化后的乙腈樣品處理液。將標(biāo)準(zhǔn)曲線的6個濃度水平制備在6份完全相同的3mL該處理液中，之后的衍生、分析與樣品的操作一致。6個濃度水平分別為0.5、1.0,2.0,5.0、20和100ng/mL。各濃度水平內(nèi)標(biāo)濃度均為5.0ng/mL。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制是基于在MS模式下提取窗口為0.02Da的母離子的提取色譜圖峰面積。以各待測物的母離子色譜峰面積與內(nèi)標(biāo)母離子色譜峰面積之比乘以內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度(Y)為縱坐標(biāo)，各待測物的質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制內(nèi)標(biāo)法校準(zhǔn)曲線。以3倍信噪比(S/N)對應(yīng)的樣品中待測物濃度作為檢出限(LOD)，10倍信噪比(S/N)對應(yīng)的樣品中待測物濃度作為定量限(LOQ)，獲得各待測物的檢出限和定量限。結(jié)果顯示(如表I所示)，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，定量限和檢出限分別為0.007-0.2 μ g/kg和0.002-0.05 μ g/kg。表I 26種內(nèi)分泌干擾物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限
權(quán)利要求
1.一種分析測定食品中多種內(nèi)分泌干擾物的方法，其特征在于，該方法中，采用水溶解樣品，加入與水混溶的有機(jī)溶劑超聲提取待測物后，加入鈉鹽，使有機(jī)溶劑與水相分離，實(shí)現(xiàn)液液萃?。蝗《坑泻写郎y物的機(jī)溶劑，經(jīng)C18填料的固相萃取凈化，丹酰氯衍生后，用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀分析測定食品中多種內(nèi)分泌干擾物。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的多種內(nèi)分泌干擾物為奶粉和液態(tài)奶中26種4類內(nèi)分泌干擾物，包括雌三醇、β-雌二醇、α-雌二醇、馬烯雌留酮、17 α-乙炔雌二醇、雌酮、己烯雌酚、己二烯雌酚、己烷雌酚和2-甲氧雌二醇；孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、炔諾酮、21 α -羥孕酮、17 α -羥孕酮和甲基炔諾酮；雙酚A、4_tert_ 丁基酚和4-tert-辛基酚；睪酮、雄烯二酮、康力龍、甲睪酮、群勃龍和諾龍。
3.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的方法其包括步驟: 1)樣品前處理: 取樣品用水充分溶解后，加入有機(jī)溶劑超聲提取待測物，加入鈉鹽，離心使水相與有機(jī)相分離；取含有待測物的有機(jī)溶劑提取液，用微氮?dú)饬鞔抵两珊螅兯畯?fù)溶，過C18填料固相萃取小柱，用乙腈水溶液洗脫待測物；向洗脫液中加入鈉鹽，離心使乙腈與水相分離；取乙腈提取液，用微氮?dú)饬鞔抵两?，用丹酰氯衍生?0°C反應(yīng)得待測物，冷卻至室溫后，直接進(jìn)樣分析； 2)超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀測定: 色譜柱采用C18柱，流動相為IOMm的甲酸銨水溶液和乙腈溶液，離子源采用陽離子模式； 其中，色譜條件:色譜柱:C18 ;柱長:100mm ;柱內(nèi)徑:2.1mm ;填料粒徑:1.7 μ m ;流動相:10mM的乙酸銨的甲醇和水；流速:0.3mL/min ;梯度洗脫；色譜柱溫度:40°C ;進(jìn)樣量為:10μ L ； 質(zhì)譜條件:電噴霧離子源采用陽離子模式；霧化氣:氮?dú)猓慌鲎矚?氬氣；毛細(xì)管電壓:3.0kV ;去溶劑氣溫度:40(TC ;去溶劑氣流量:600L/h ;源溫度:120°C ;采樣錐電壓:40V ;錐孔氣流量:40L/h。
3)計算濃度: 采用基質(zhì)匹配內(nèi)標(biāo)法，以峰面積計算樣品中26種內(nèi)分泌干擾物的含量。
4.按權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的有機(jī)溶劑選自乙腈或者丙酮。
5.按權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的鈉鹽選自氯化鈉或者硫酸鈉。
6.按權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的鈉鹽選自氯化鈉。
7.按權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的固相萃取乙腈洗脫液濃度為I: 50-80。
8.按權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述的固相萃取乙腈洗脫液濃度為1: 60。
9.按權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于所述的衍生化溫度為60-80°C。
10.按權(quán)利要求1或2或3所述的方法，其特征在于，所述的衍生化時間為10-30分鐘。
全文摘要
本發(fā)明屬于食品檢驗(yàn)領(lǐng)域，涉及食品內(nèi)內(nèi)分泌干擾物的分析測定方法，具體涉及一種分析測定奶粉和液態(tài)奶中多種內(nèi)分泌干擾物的方法。本發(fā)明采用水溶解樣品，加入與水混溶的有機(jī)溶劑超聲提取待測物后，加入鈉鹽，使有機(jī)溶劑與水相分離，實(shí)現(xiàn)液液萃取；取定量有含有待測物的機(jī)溶劑，經(jīng)C18填料的固相萃取凈化，丹酰氯衍生后，用超高效液相色譜串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜儀同時分析測定食品中26種4類內(nèi)分泌干擾物。本發(fā)明方法能彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)中不能實(shí)現(xiàn)一次色譜進(jìn)樣同時分析食品中多種內(nèi)分泌干擾物的缺陷，同時能提高四極桿飛行時間質(zhì)譜儀的靈敏度，實(shí)現(xiàn)食品中內(nèi)分泌干擾物四極桿飛行時間質(zhì)譜儀的準(zhǔn)確分析。
文檔編號G01N30/06GK103185762SQ20111045881
公開日2013年7月3日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者王和興, 周穎, 姜慶五 申請人:復(fù)旦大學(xué)