專利名稱：甲胎蛋白檢測(cè)用絲網(wǎng)印刷電極傳感器的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
甲胎蛋白檢測(cè)用絲網(wǎng)印刷電極傳感器技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種用于檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物-甲胎蛋白的磁性復(fù)合納米微粒修飾電極傳感器，該傳感器器件是基于抗體/抗原特異性反應(yīng)的絲網(wǎng)印刷電極，屬于分析測(cè)試領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甲胎蛋白(a-fetoprotein，簡(jiǎn)稱AFP)是由胎兒肝細(xì)胞合成、胚胎發(fā)育早期的一種主要血清蛋白，成人由肝細(xì)胞產(chǎn)生。正常成人血清中AFP含量甚少，但大多數(shù)原發(fā)性肝癌和畸胎瘤病人血清中AFP含量較高，而且其含量與病情的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此血清中AFP含量不僅可作為原發(fā)性肝癌和畸胎瘤的早期診斷指標(biāo)之一，也可作為療效觀察和愈后判斷的指標(biāo)，血清中AFP的升高對(duì)原發(fā)性肝癌診斷具有重要意義，具有確立診斷、早期診斷、鑒別診斷的作用。目前臨床檢測(cè)血清中AFP大多用放射免疫法(簡(jiǎn)稱RIA)、化學(xué)發(fā)光法(簡(jiǎn)稱CL)、 時(shí)間分辨免疫熒光分析法(簡(jiǎn)稱TRFIA)以及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法(簡(jiǎn)稱ELISA)。RIA法雖然有較好的靈敏度，但穩(wěn)定性欠佳，且有放射性污染之嫌，操作時(shí)間長(zhǎng)。CL法雖然有較好的靈敏度和穩(wěn)定性，但目前試劑和儀器全部為進(jìn)口產(chǎn)品，成本相對(duì)較高。TRFIA法需要稀土離子標(biāo)記抗原或抗體，標(biāo)記物制備復(fù)雜、耗時(shí)且由于各批次檢測(cè)結(jié)果均采用同一標(biāo)準(zhǔn)曲線定量，所以標(biāo)準(zhǔn)曲線要求很高。ELISA法靈敏度及穩(wěn)定性不夠好，假陽(yáng)性較高。電化學(xué)免疫傳感器結(jié)合了電化學(xué)檢測(cè)的高靈敏度和免疫分析的高特異性，具有樣品用量小、檢測(cè)快速、結(jié)果準(zhǔn)確等突出優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于腫瘤標(biāo)志物檢測(cè)?；诮z網(wǎng)印刷電極(簡(jiǎn)稱SPCEs)構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器，具有能夠?qū)崿F(xiàn)批量生產(chǎn)、電極集成、樣品用量小、成本低且一次使用可拋棄的優(yōu)點(diǎn)，避免了共用同一電極檢測(cè)多個(gè)樣本時(shí)的交叉干擾問(wèn)題，為推動(dòng)安培免疫傳感器走向廉價(jià)、大規(guī)模應(yīng)用提供了一種具有前景的途徑。納米修飾電化學(xué)傳感器由于其卓越的靈敏度引起人們的廣泛關(guān)注。碳納米管(簡(jiǎn)稱CNTs)具有比表面積大，明顯促進(jìn)生物分子的電子傳遞、擴(kuò)增響應(yīng)電流以及電化學(xué)催化等性質(zhì)；鐵磁性氧化物粒子形成的核殼結(jié)構(gòu)納米復(fù)合材料-Fe304/Au (金磁復(fù)合納米微粒)，具備Au表面生物分子快速標(biāo)記和Fe3O4超順磁性的雙重特質(zhì)，在生物物質(zhì)分離及醫(yī)學(xué)檢測(cè)方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。Nafion是一種全氟化高分子聚合物陽(yáng)離子交換劑，由于其優(yōu)良的成膜、溶解分散、抗干擾能力及離子交換等特性，已廣泛用于生物傳感器表面敏感膜構(gòu)建。SPCEs與電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)聯(lián)用將具有分析速度快、信息量大、試劑消耗少、污染小、 操作費(fèi)用低、儀器簡(jiǎn)便以及檢測(cè)速度和靈敏度俱佳等優(yōu)點(diǎn)。目前，在SPCEs技術(shù)領(lǐng)域，利用磁性復(fù)合納米微粒修飾SPCEs來(lái)快速、準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物-AFP的相關(guān)技術(shù)和方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型需解決的技術(shù)問(wèn)題是，在絲網(wǎng)印刷技術(shù)這樣一個(gè)總的技術(shù)框架內(nèi)，研發(fā)出一種應(yīng)用于快速、準(zhǔn)確檢測(cè)腫瘤標(biāo)志物-AFP的絲網(wǎng)印刷電極傳感器。根據(jù)上述的技術(shù)問(wèn)題，設(shè)計(jì)了一種絲網(wǎng)印刷電極傳感器，其包括一基片、設(shè)于基片上的反應(yīng)腔、位于反應(yīng)腔內(nèi)的三個(gè)相互獨(dú)立設(shè)置的電極和設(shè)于基片上一端的接頭，所述三個(gè)電極分別為工作電極、對(duì)電極和參比電極，三個(gè)電極分別通過(guò)三條相互絕緣的連接引線與接頭相連。所述三個(gè)電極均采用絲網(wǎng)印刷技術(shù)于陶瓷基底的SPCEs表面印制，集成于反應(yīng)腔中，三電極材料以及形狀均可以任意選定，材料可以是碳、銀以及金等等；任意選定的形狀例如方片形狀、半圓形片狀、條形狀等等。但是，出于盡量少用待測(cè)液樣以及降低試劑損耗等方面的考慮，所述電極形狀最好均選用毫米級(jí)的寬度。所述反應(yīng)腔是用于腫瘤標(biāo)志物-AFP抗體、抗原等生物蛋白質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)的場(chǎng)所，反應(yīng)腔形狀可以是任意選定的形狀，圓形空腔狀、方柱形空腔狀、橢圓形空腔狀等等。本實(shí)用新型SPCEs傳感器當(dāng)然還可以進(jìn)一步包括一些附件，所述附件例如電化學(xué)工作站以及電極連接頭等等，所述電化學(xué)工作站的技術(shù)含義以及電極連接頭的技術(shù)含義是公知的。作為本實(shí)用新型進(jìn)一步改進(jìn)，所述工作電極的數(shù)量是一個(gè)，且該工作電極的表層修飾有磁性復(fù)合納米微粒。磁性復(fù)合納米顆粒修飾有助于大幅度地?cái)U(kuò)展工作電極的有效工作界面并擴(kuò)增響應(yīng)電流，磁性顆粒有利磁場(chǎng)條件下電極表面的迅速更新，并且，進(jìn)一步地， 將電子媒介體包埋于Nafion膜中還使得該工作電極具備良好的抗干擾性。磁性復(fù)合納米顆粒溶解于一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Nafion溶液中并在電極表面成膜，以及，將包被腫瘤標(biāo)志物 AFP抗原的i^304/Au微粒通過(guò)外加磁場(chǎng)吸附于SPCEs表面的Nafion膜，Naf ion膜與包被腫瘤標(biāo)志物AFP抗原的!^e3O4Au微粒在電極表面可以渾然一體。作為本實(shí)用新型進(jìn)一步改進(jìn)，所述工作電極表面上覆蓋有一層Nafion敏感膜。所述Nafion膜中復(fù)合納米顆粒修飾的工作電極，其中復(fù)合納米顆粒(CNTs濃度以及電子媒介體(普魯士藍(lán)、二茂鐵、等)濃度)可以根據(jù)響應(yīng)電流大小以及檢測(cè)限的需要而優(yōu)化。所述 Nafion膜表面采用磁場(chǎng)吸附的包被腫瘤標(biāo)志物AFP抗體的i^304/Au納米顆粒的粒徑不限， 所述納米顆粒的直徑可以是根據(jù)需要設(shè)定任意的尺寸，但是，所述納米顆粒的優(yōu)選直徑范圍是介于10納米至50納米之間。作為本實(shí)用新型進(jìn)一步改進(jìn)，所述三條連接引線均采用導(dǎo)電銀漿印制而成，各表
面覆蓋有絕緣層。作為本實(shí)用新型進(jìn)一步改進(jìn)，所述基片與反應(yīng)腔位置對(duì)應(yīng)的底部貼附有一強(qiáng)磁鐵，用來(lái)控制反應(yīng)腔中金磁微粒在電極表面的吸附與脫附，達(dá)到迅速更新電極表面的目的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型的優(yōu)點(diǎn)是在一塊基片上集成了三個(gè)電極，其集成構(gòu)造的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及工作電極的復(fù)合納米微粒修飾特異形態(tài)決定了該電極的使用有助于減小樣液用量，有利于加快AFP診斷效率，有助于降低AFP診斷費(fèi)用。

圖1是本實(shí)用新型實(shí)施方式絲網(wǎng)印刷電極傳感器的構(gòu)造輪廓示意圖；圖2是本實(shí)用新型實(shí)施方式絲網(wǎng)印刷電極傳感器與電化學(xué)工作站聯(lián)用時(shí)的整體結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本實(shí)用新型實(shí)施方式絲網(wǎng)印刷電極傳感器檢測(cè)不同濃度AFP抗原時(shí)的電化學(xué)電流響應(yīng)圖。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合附圖和實(shí)施方式對(duì)本實(shí)用新型作進(jìn)一步說(shuō)明。如圖1所示，本實(shí)用新型SPCEs傳感器的結(jié)構(gòu)中包括組合在一起的三電極，該三個(gè)電極分別是裝設(shè)位置不同的工作電極1、參比電極2和對(duì)電極3，該三個(gè)電極均集成于反應(yīng)腔4中。反應(yīng)腔4設(shè)置于基片的一端。該反應(yīng)腔4內(nèi)容納了工作電極1、參比電極2和對(duì)電極3，該工作電極的表層修飾有磁性復(fù)合納米微粒，磁性復(fù)合納米微粒溶解于一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的Nafion溶液中并在電極表面成Nafion敏感膜。反應(yīng)腔4的容積大小可以根據(jù)需要隨意設(shè)定，實(shí)際操作中為了降低樣品耗費(fèi)，一般設(shè)置為25yL 35yL。三個(gè)電極的一端經(jīng)由裝設(shè)位置不同但都起到導(dǎo)電作用的采用銀漿印制的三條連接引線5、6、7分別通過(guò)電極連接頭9與電化學(xué)工作站11連接，如圖2。三條連接引線5、6、7的表面覆蓋了一薄層的絕緣膜8，防止電解質(zhì)溶液將三電極聯(lián)通，造成短路。基片與反應(yīng)腔位置對(duì)應(yīng)的反面(也即基片與反應(yīng)腔4對(duì)應(yīng)的底部)附貼有一強(qiáng)磁鐵10， 強(qiáng)磁鐵10用來(lái)控制電極反應(yīng)腔中包被有AFP抗體的金磁微粒在電極表面的吸附與脫附，達(dá)到迅速更新電極表面的目的。本實(shí)用新型SPCEs傳感器一次性免疫分析法測(cè)定AFP抗原濃度的具體檢測(cè)步驟如下1、合成包被AFP抗體的Fe304/Au納米顆粒。在5mL 0. 02mol 'L^1Tris-HCl緩沖液的離心管中加入5 μ L Img .HiL-1Fe3CVAu溶液與10 μ L Img 'mL^AFP抗體，35°C下振蕩反應(yīng) 20min后，將離心管置于磁性分離器中磁性分離3min，棄上清液，重新加入5mL Tris-HCl緩沖液和5 μ L牛血清蛋白溶液(w = 0. 25%)室溫下攪拌lh，以封閉未包被AFP抗體的Fe3O4/ Au表面，磁性分離，棄上清。如此操作重復(fù)3次，在Fe3O4Au中加入IOmLTris-HCl緩沖液， 輕搖重懸磁粒，制得Fe3O4Au包被AFP抗體溶液(Fe304/Au-AFP)，冰箱中4°C保存?zhèn)溆谩?、復(fù)合納米微粒修飾SPCEs免疫電極的構(gòu)建滴加含Nafion (w = 0. 2 % ), 0. 6mg · mL^CNTs 和 0. Imol · L—1 二茂鐵(簡(jiǎn)稱 Fe) 的二甲苯溶液5 μ L均勻涂覆于SPCEs的工作電極表面，待其自然干燥得到SPCEs | CNTs/Fc/ Nafion電極；繼續(xù)滴加5 μ L Fe3O4Au-AFP抗體溶液，在電極底部加一塊磁鐵，借助磁力將 Fe3O4Au-AFP抗體吸附于電極表面，自然晾干即得SPCEs免疫電極。需要更新電極表面時(shí)， 移去磁鐵并用ρΗ = 6. O磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗電極表面，即可實(shí)現(xiàn)電極再生。3、在SPCEs免疫電極的25 μ L反應(yīng)腔中加入20 μ L ρΗ = 6. 0PBS，采用示差脈沖伏安(DPV)法檢測(cè)其還原峰電流(I。)。4、在上述電極反應(yīng)腔中再加入1 μ L不同濃度的AFP抗原溶液，并在35°C下溫育 10min，DPV測(cè)定還原峰電流(I)。由于溶液中AFP抗原與電極表面AFP抗體發(fā)生免疫反應(yīng)， 當(dāng)被測(cè)AFP抗原濃度越高時(shí)DPV響應(yīng)電流越小。這是因?yàn)锳FP抗原濃度提高后，溶液中恒量的AFP抗體與電極表面AFP抗原結(jié)合形成免疫復(fù)合物機(jī)會(huì)增大，對(duì)電子媒介體Fc的電子傳遞阻礙增加，因此DPV還原峰電流隨著AFP抗原濃度的增加不斷下降。5、DPV還原峰電流下降百分比與被測(cè)AFP抗原在一定濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行AFP抗原定量。圖3為不同濃度的樣品加入反應(yīng)腔中采用一次性免疫分析法測(cè)定時(shí)的電化學(xué)DPV響應(yīng)圖。測(cè)定結(jié)果表明隨著AFP抗原濃度的不斷增加(a f)，DPV響應(yīng)電流逐漸減小，電流下降百分比與AFP抗原濃度之間存在緊密的正相關(guān)性，可以用于定量分析。 以上所述的僅是本實(shí)用新型的實(shí)施方式，在此應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本實(shí)用新型創(chuàng)造構(gòu)思的前提下，還可以做出改進(jìn)，但這些均屬于本實(shí)用新型的保護(hù)范圍。
權(quán)利要求1.一種絲網(wǎng)印刷電極傳感器，其特征在于所述絲網(wǎng)印刷電極包括一基片、設(shè)于基片上的反應(yīng)腔、位于反應(yīng)腔內(nèi)的三個(gè)相互獨(dú)立設(shè)置的電極和設(shè)于基片上一端的接頭，所述三個(gè)電極分別為工作電極、對(duì)電極和參比電極，三個(gè)電極分別通過(guò)三條相互絕緣的連接引線與接頭相連。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的絲網(wǎng)印刷電極傳感器，其特征在于所述工作電極的數(shù)量是一個(gè)，且該工作電極的表層修飾有磁性復(fù)合納米微粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的絲網(wǎng)印刷電極傳感器，其特征在于所述工作電極表面上覆蓋有一層Nafion溶液形成的敏感膜。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的絲網(wǎng)印刷電極傳感器，其特征在于所述三條連接引線均采用導(dǎo)電銀漿印制而成，各表面覆蓋有絕緣層。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的絲網(wǎng)印刷電極傳感器，其特征在于所述基片與反應(yīng)腔位置對(duì)應(yīng)的底部貼附有一強(qiáng)磁鐵。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種甲胎蛋白(AFP)檢測(cè)用絲網(wǎng)印刷電極傳感器，所述絲網(wǎng)印刷電極包括一基片、設(shè)于基片上的反應(yīng)腔、位于反應(yīng)腔內(nèi)的三個(gè)相互獨(dú)立設(shè)置的電極和設(shè)于基片上一端的接頭，所述三個(gè)電極分別為工作電極、對(duì)電極和參比電極，三個(gè)電極分別通過(guò)三條相互絕緣的連接引線與接頭相連。本實(shí)用新型優(yōu)點(diǎn)是有利于加快AFP診斷效率，有助于降低AFP診斷費(fèi)用。
文檔編號(hào)G01N27/327GK202041497SQ201120016568
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月11日
發(fā)明者李元祥, 楊欣, 袁吉, 陳迪釗 申請(qǐng)人:懷化學(xué)院