專利名稱：一種三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，本實(shí)用新型涉及一種三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(英文名Melamine)，簡(jiǎn)稱三胺，又叫2，4，6-三氨基-1，3，5-三嗪、1，3， 5-三嗪-2，4，6-三胺、2，4，6_三氨基脲、蜜胺、三聚氰酰胺、氰脲三酰胺，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，是重要的氮雜環(huán)有機(jī)化工原料。在食品工業(yè)中，需要測(cè)定食品的蛋白質(zhì)含量，而直接測(cè)量蛋白質(zhì)技術(shù)上比較復(fù)雜，所以通常采用凱氏定氮法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，即通過(guò)測(cè)定食品中氮的含量來(lái)間接推算蛋白質(zhì)的含量。由于三聚氰胺與蛋白質(zhì)相比含有更多的氮原子，所以添加在食品中的三聚氰胺可以造成食品蛋白質(zhì)含量較高的假象，因而被不法商販所利用。三聚氰胺被攝入人體后，通過(guò)小腸吸收進(jìn)入血液循環(huán)并最終進(jìn)入腎臟，形成腎結(jié)石，尤其對(duì)于哺乳期的嬰兒，更容易造成結(jié)石。三聚氰胺的檢測(cè)目前主要采用儀器檢測(cè)的方法。主要方法有GC-MS法、 Spectra-Quad在線檢測(cè)、超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法、反相高效液相色譜法、高效液相色譜-二極管陣列法、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-四極桿質(zhì)譜聯(lián)用、固相萃取與高效液相色譜聯(lián)用、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MSMQ等。這些儀器方法價(jià)格昂貴，且方法操作復(fù)雜，需受過(guò)專門訓(xùn)練的人員才能操作，而且存在著適用范圍窄、設(shè)備昂貴、成本高等問(wèn)題。20世紀(jì)80年代興起的膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)，基于免疫層析原理，操作簡(jiǎn)便快捷，結(jié)果清晰，無(wú)需復(fù)雜的實(shí)驗(yàn)技能和設(shè)備，特別適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。但是膠體金技術(shù)只能實(shí)現(xiàn)定性檢測(cè)，且膠體金的制備成本較高。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種成本低廉、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、 操作簡(jiǎn)便、靈敏性高的三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本實(shí)用新型采取了以下技術(shù)方案一種三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條，包括底板，在所述底板上依次相互搭接有樣品墊、涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體的玻璃纖維膜標(biāo)記墊、硝酸纖維素包被膜和吸水紙，所述包被膜上設(shè)有質(zhì)控線和檢測(cè)線，所述檢測(cè)線由偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺全抗原包被。所述質(zhì)控線由抗鼠抗體IgG包被。所述質(zhì)控線和檢測(cè)線之間的距離為2_5mm ；更優(yōu)選地，所述質(zhì)控線和檢測(cè)線之間的距離為3. 5mm，非特異性干擾性小。三聚氰胺為小分子化合物，抗原性弱，不能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫應(yīng)答，必須把其連接到大分子物質(zhì)(如載體蛋白質(zhì))上，才能形成較為理想的免疫原。常用的蛋白質(zhì)偶聯(lián)方法主要有碳二亞胺(EDC)法、混合酸酐法(MA)、戊二醛法、N-羥基琥珀酰亞胺(MB)法、琥珀酸酐法和重氮法等。本實(shí)用新型的三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試劑條是建立在免疫層析的競(jìng)爭(zhēng)抑制性原理上，利用化學(xué)合成的方法將三聚氰胺連接到大分子載體蛋白上合成三聚氰胺人工全抗原；采用載體蛋白偶聯(lián)的三聚氰胺全抗原制備高靈敏度的三聚氰胺抗體；利用彩色膠乳標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記三聚氰胺抗體，載體蛋白偶聯(lián)的三聚氰胺人工全抗原組成層析裝置， 對(duì)樣本中的三聚氰胺小分子進(jìn)行定性檢測(cè)。當(dāng)試紙條以樣品墊末端浸入樣本后，樣品溶液沿著試紙條通過(guò)毛細(xì)作用從下向上流動(dòng)，溶解標(biāo)記墊上涂覆的彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體。如果待測(cè)的樣品中不含有三聚氰胺時(shí)，彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體會(huì)和包被在硝酸纖維素包被膜的檢測(cè)線處的偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺全抗原發(fā)生反應(yīng)，從而聚集彩色膠乳顆粒，在檢測(cè)線處顯色， 未與三聚氰胺全抗原反應(yīng)的彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體繼續(xù)向前，與質(zhì)控線上的抗鼠抗體發(fā)生反應(yīng)，在質(zhì)控線處顯色，因此在硝酸纖維素包被膜上呈現(xiàn)兩條色帶，表示樣品為三聚氰胺陰性；若待測(cè)樣品中含有三聚氰胺，則彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體首先與樣品中的小分子發(fā)生反應(yīng)，檢測(cè)線處不顯色，當(dāng)反應(yīng)后的彩色膠乳顆粒標(biāo)記的抗體和抗原復(fù)合物流動(dòng)到質(zhì)控線處時(shí)，與質(zhì)控線處包被的抗鼠抗體反應(yīng)，質(zhì)控線處顯色，硝酸纖維素包被膜上只呈現(xiàn)一條色帶，說(shuō)明檢測(cè)樣品為陽(yáng)性。由此可見(jiàn)，無(wú)論檢測(cè)樣品中是否含有三聚氰胺小分子，質(zhì)控線處均顯色，如果質(zhì)控線無(wú)色帶產(chǎn)生，則說(shuō)明試紙條失效或者操作有誤。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本實(shí)用新型具有以下有益效果本實(shí)用新型的檢測(cè)試紙條是根據(jù)競(jìng)爭(zhēng)抑制性固相免疫層析原理而制備的，即樣品中的三聚氰胺小分子和固定在包被膜上的偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺全抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合彩色膠乳標(biāo)記的三聚氰胺抗體，提高了檢測(cè)的靈敏度，使用更加便捷；采用本實(shí)用新型的試紙條進(jìn)行定性檢測(cè)不需要任何輔助儀器，操作簡(jiǎn)便，一步完成，檢測(cè)時(shí)間為5 15min ；可以檢測(cè)動(dòng)物飼料、肌肉組織等處理檢材，檢測(cè)靈敏度達(dá)到5ng/mL ；準(zhǔn)確率大于97%。

圖1是本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖；附圖標(biāo)記1、底板；2、樣品墊；3、玻璃纖維膜標(biāo)記墊；4、硝酸纖維素包被膜；5、吸水紙；6、檢測(cè)線；7、質(zhì)控線。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。實(shí)施例1三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條如圖1所示，為本發(fā)明一種三聚氰胺免疫層析快速檢測(cè)試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖，所述試紙條，包括底板1，在所述底板1上依次相互搭接有樣品墊2、涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體的玻璃纖維膜標(biāo)記墊3、硝酸纖維素包被膜4和吸水紙5，所述包被膜4上設(shè)有質(zhì)控線7和檢測(cè)線6，所述檢測(cè)線6由偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺全抗原包被，兩條檢測(cè)線之間的距離為3. 5mm，所述質(zhì)控線7包被抗鼠抗體IgG。所述彩色乳膠顆粒為粒徑為 100-500nm的聚苯乙烯顆粒，所述聚苯乙烯顆粒表面修飾有-C00H、-NH2或-SH基團(tuán)。三聚氰胺抗體為三聚氰胺單克隆抗體或三聚氰胺多克隆抗體。在該實(shí)施例中，使用的是三聚氰胺多克隆抗體。[0019]在該實(shí)施例中，包被用三聚氰胺全抗原的載體蛋白為卵血清白蛋白OVA。偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺全抗原的濃度為5mg/ml，在所述檢測(cè)區(qū)的用量為15μ l/35cm ；所述抗鼠抗體IgG的濃度為18μ g/ml，在所述控制區(qū)的用量為25μ l/35cm。在該實(shí)施例中，所述三聚氰胺多克隆抗體與彩色膠乳顆粒的比例為 100 μ g/100 μ g，所述彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺多克隆抗體涂敷在玻璃纖維膜標(biāo)記墊上的稀釋參數(shù)為30cm2/ml。該實(shí)施例的試紙條是由以下方法制備而得A.制備偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺全抗原采用戊二醛做交聯(lián)劑，將三聚氰胺與載體蛋白(卵血清白蛋白OVA)進(jìn)行偶聯(lián)制備人工抗原。取^IigMEL(三聚氰胺)溶于Iml的PBS溶液中，加入30 μ L戊二醛，常溫反應(yīng) lh，加入含IOmg OVA的PBS溶液，RT攪拌反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)液用葡聚糖凝膠kphadex G-25 過(guò)柱純化，制得三聚氰胺全抗原0VA-MEL，零下20攝氏度保存。B.制備三聚氰胺單克隆抗體或多克隆抗體制備三聚氰胺多抗采用常規(guī)免疫程序免疫新西蘭大白兔，制備多克隆抗體，免疫沉淀實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體效價(jià)，兩個(gè)月后采用頸動(dòng)脈取血法收集抗血清，硫酸銨法純化抗體， 0. 01mol/L PBS (pH7. 2)透析直至透析外液與氯化鋇反應(yīng)無(wú)沉淀為止，加入終濃度為0. 01% 的疊氮鈉，分裝后置_70°C低溫保存。用重氮法合成三聚氰胺-牛血清白蛋白(作為包被抗原)，用于間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)，測(cè)定三聚氰胺特異性抗體的效價(jià)。C.篩選直徑為100-500nm的、表面修飾有-C00H，-NH2, -SH等基團(tuán)的彩色乳膠顆粒，將彩色膠乳顆粒與步驟B制得的MEL多克隆抗體相偶聯(lián)，并涂覆到玻璃纖維膜標(biāo)記墊上。D.將步驟A中偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺全抗原噴膜于硝酸纖維素包被膜的檢測(cè)區(qū)，將抗鼠抗體IgG包被于包被膜的控制區(qū)，質(zhì)控線和檢測(cè)線之間的距離設(shè)置為3. 5mm, 并在35-40°C烘箱干燥15分鐘。E.將涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的MEL多克隆抗體的玻璃纖維素膜標(biāo)記墊、包被有載體蛋白-MEL全抗原和抗鼠抗體的包被膜、吸水紙依次搭接在底板上，即得。使用方法及結(jié)果判斷加樣后，反應(yīng)5分鐘內(nèi)即可看到檢測(cè)線和質(zhì)控線相應(yīng)的位置上呈色情況，如果檢測(cè)線和質(zhì)控線均出現(xiàn)顏色條帶，結(jié)果為陰性，說(shuō)明樣品中不含有三聚氰胺；檢測(cè)線不出現(xiàn)顏色條帶，質(zhì)控線出現(xiàn)顏色條帶，結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明樣品中含有三聚氰胺；質(zhì)控線不出現(xiàn)顏色條帶，說(shuō)明試紙條失效。實(shí)施例2三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條在該實(shí)施例中，質(zhì)控線和檢測(cè)線之間的距離為2mm。載體蛋白為牛血清白蛋白BSA，偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺抗原的濃度為18mg/ml，在所述檢測(cè)區(qū)的用量為 18μ l/35cm ；所述抗鼠抗體IgG的濃度為25 μ g/ml，在所述控制區(qū)的用量為25 μ l/35cm。 所述三聚氰胺抗體與彩色膠乳顆粒的比例為75 μ g/100 μ g，所述彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體涂敷在玻璃纖維膜標(biāo)記墊上的稀釋參數(shù)為25cm2/ml。該實(shí)施例中的試紙條結(jié)構(gòu)均與實(shí)施例1相同。[0034]除了步驟B中制備三聚氰胺單克隆抗體外，其他制備方法與實(shí)施例1相同。步驟B為制備三聚氰胺單抗以50μ g-ΙΟΟμ g/只的劑量，用三聚氰胺載體蛋白偶聯(lián)物(步驟A中的BSA-MEL)免疫6-8周齡BALB小鼠3_4次，每次間隔時(shí)間3_5周，確定抗體效價(jià)符合要求之后強(qiáng)化免疫，之后3-4天，將免疫小鼠眶下竇采血，分離陽(yáng)性血清，脫頸致死， 用75%酒精浸泡小鼠5-lOmin消毒，無(wú)菌取脾臟，將脾臟剪碎并研磨，經(jīng)過(guò)尼龍紗布過(guò)濾， IOOOrpm離心15min，收集脾細(xì)胞。將IO8的脾細(xì)胞與NSO骨髓瘤細(xì)胞按10 1比例混合， IOOOrpm離心IOmin棄上清，細(xì)胞沉淀物于37°C水浴中緩緩加入0. 7-1. Oml的50% PEG4000 作用lmin，然后緩緩加入無(wú)血清1640培養(yǎng)基15ml，以終止PEG的作用，37°C水浴5-lOmin， IOOOrpm離心IOmin棄上清，將細(xì)胞沉淀物重懸與HAT選擇培養(yǎng)基中，并加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)孔(100 μ L-200 μ L/孔)，置于37°C、5% (X)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)10-14天，用間接ELISA法進(jìn)行陽(yáng)性孔篩選，選擇強(qiáng)陽(yáng)性、抑制率高、細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛的孔進(jìn)行三次有限的稀釋克隆化， 而后擴(kuò)大培養(yǎng)，建立雜交瘤細(xì)胞株。所制備的雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體可特異性地與三聚氰胺反應(yīng)。該實(shí)施例中的試紙條的使用方法與實(shí)施例1相同。實(shí)施例3在該實(shí)施例中，質(zhì)控線和檢測(cè)線之間的距離為5mm。載體蛋白為人血清白蛋白，偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺抗原的濃度為8mg/ml，在所述檢測(cè)區(qū)的用量為20μ l/35cm ；所述抗鼠抗體IgG的濃度為30μ g/ml，在所述控制區(qū)的用量為25μ l/35cm。在該實(shí)施例中，所述三聚氰胺抗體與彩色膠乳顆粒的比例為150 μ g/100 μ g，所述彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體涂敷在玻璃纖維膜標(biāo)記墊上的稀釋參數(shù)為35cm2/ml。該實(shí)施例中的試紙條結(jié)構(gòu)均與實(shí)施例1相同。制備和使用方法也與實(shí)施例1相同。實(shí)施例1-3中的三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限和靈敏度在250ng/ml左
右ο
權(quán)利要求1.一種三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于，包括底板(1)，在所述底板(1)上依次相互搭接有樣品墊( 、涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體的玻璃纖維膜標(biāo)記墊(3)、硝酸纖維素包被膜⑷和吸水紙(5)，所述包被膜上設(shè)有質(zhì)控線(7)和檢測(cè)線(6)， 所述檢測(cè)線(6)由偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺全抗原包被。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述質(zhì)控線(7) 由抗鼠抗體IgG包被。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述質(zhì)控線(7) 和檢測(cè)線(6)之間的距離為2-5mm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條，其特征在于，所述質(zhì)控線(7) 和檢測(cè)線(6)之間的距離為3. 5mm。
專利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種三聚氰胺免疫層析檢測(cè)試紙條，包括底板，在所述底板上依次相互搭接有樣品墊、涂覆有彩色膠乳顆粒標(biāo)記的三聚氰胺抗體的玻璃纖維膜標(biāo)記墊、硝酸纖維素包被膜和吸水紙，所述包被膜上設(shè)有質(zhì)控線和檢測(cè)線，所述檢測(cè)線由偶聯(lián)有載體蛋白的三聚氰胺全抗原包被。采用本實(shí)用新型的試紙條進(jìn)行定性檢測(cè)不需要任何輔助儀器，操作簡(jiǎn)便，一步完成，可以檢測(cè)動(dòng)物飼料、肌肉組織等處理檢材，檢測(cè)靈敏度達(dá)到5ng/mL，準(zhǔn)確率大于97％。
文檔編號(hào)G01N33/558GK202110174SQ201120164139
公開(kāi)日2012年1月11日 申請(qǐng)日期2011年5月20日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月20日
發(fā)明者唐海波, 王繼華 申請(qǐng)人:廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)有限公司