專(zhuān)利名稱(chēng)：甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型是涉及生物應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種以膠體金免疫層析法快速檢測(cè)甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙
背景技術(shù)：
甲型病毒性肝炎(簡(jiǎn)稱(chēng)甲肝)是由甲肝病毒(HAV)引起的一種病毒性肝炎。甲肝病毒屬微小RNA病毒，對(duì)各種外界因素有較強(qiáng)的抵抗力而能長(zhǎng)期在外界環(huán)境中存活，能通過(guò)各種污染物品以及水和食物傳播，也可經(jīng)蒼蠅攜帶而傳播。人類(lèi)感染甲肝病毒后，大多表現(xiàn)為亞臨床或隱性感染，僅少數(shù)表現(xiàn)問(wèn)急性甲型肝炎。一般可完全恢復(fù)，不轉(zhuǎn)為慢性肝炎。甲肝主要通過(guò)糞-口途徑傳播，潛伏期15-45天，病毒常在患者轉(zhuǎn)氨酶升高前的 5-6天就存在于患者的血液和糞便中。感染后血清中抗-HAV IgM抗體很快出現(xiàn)，在兩周左右達(dá)高峰，然后逐漸下降，在8周之內(nèi)消失，是HAV急性感染和近期感染的血清學(xué)證據(jù)； 抗-HAV IgG抗體產(chǎn)生較晚，在急性期后期和恢復(fù)期早期出現(xiàn)(IgM開(kāi)始下降時(shí)，IgG逐漸上升)屬保護(hù)性抗體，在恢復(fù)期達(dá)高峰，可持久存在，可保護(hù)人體不再次感染，對(duì)甲肝流行病學(xué)調(diào)查、健康體檢、了解易感人群有重要意義。目前對(duì)甲型肝炎病毒檢測(cè)的主要方法是甲型肝炎病毒特異性抗體檢測(cè)。檢測(cè)甲型肝炎病毒IgM判定是否為現(xiàn)癥感染，檢測(cè)IgG判定是否曾經(jīng)感染過(guò)，免于再次感染。檢測(cè)兩種抗體有利于對(duì)被檢對(duì)象的進(jìn)行全面的判定。目前甲型肝炎病毒抗體的檢測(cè)方法主要是 RIA、ELISA等檢測(cè)方法。在膠體金的檢測(cè)方法中，有單獨(dú)檢測(cè)甲型肝炎病毒IgM或IgG的報(bào)道，但用膠體金類(lèi)免疫層析技術(shù)同時(shí)檢測(cè)甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體的檢測(cè)試紙尚未有相關(guān)報(bào)道。和用兩種試劑分別檢測(cè)IgM和IgG抗體相比，同時(shí)檢測(cè)IgM和IgG抗體能減少檢測(cè)人員的工作量，節(jié)約成本；同時(shí)減少采血量，減少患者的痛苦。免疫層析膠體金技術(shù)是新型的診斷技術(shù)，在抗體檢測(cè)方面已得到較為廣泛運(yùn)用， 基本原理如下利用膠體金標(biāo)記一種抗原或抗體，在試劑的NC膜上包被相應(yīng)的配對(duì)抗原或抗體，檢測(cè)時(shí)當(dāng)樣品中含相應(yīng)的特異性抗體或抗原時(shí)，膠體金標(biāo)記顆粒和樣品中配體相結(jié)合形成復(fù)合物，然后在NC膜上層析，再被包被抗原或抗體捕獲，形成肉眼可見(jiàn)的檢測(cè)T 線，通過(guò)檢測(cè)線的有無(wú)實(shí)現(xiàn)對(duì)結(jié)果的判定。具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、 適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型的目的是提供一種甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體檢測(cè)試紙，具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)用新型提供一種甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于塑料支撐板(8) —端粘貼上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記甲型肝炎病毒特異性的抗原VPl或VP3的膠體金墊( ，膠體金墊( 一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)， 硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測(cè)線Tl (5)、檢測(cè)線T2 (6)和質(zhì)控C線，檢測(cè)線Tl (5)為包被在NC膜上的抗人IgM抗體，檢測(cè)線T2 (6)為包被在NC膜上的抗人IgG抗體，質(zhì)控C線為包被在NC膜上的抗甲型肝炎病毒VPl或VP3抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊⑷形成試紙。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于所述的抗原甲型肝炎病毒特異性的主要抗原VPl或VP3抗原，抗原可以利用基因工程重組表達(dá)或在培養(yǎng)病
毒中純化。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于所述的上樣墊(1) 為玻璃纖維膜或無(wú)紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，所述的抗原的包被方法為以 0. OlM pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBS)將抗人IgM抗體配制成l_2mg/ml的溶液，以0. OlM pH 7. 2磷酸鹽緩沖液(PBQ將抗人IgG抗體配制成l-2mg/ml的溶液，用噴膜儀在NC膜下部以 1-1. 5ul/cm的參數(shù)進(jìn)行劃線，包被T1、T2線，同時(shí)在NC膜上部包被抗甲型肝炎病毒VPl抗體作為C線，劃線后將NC膜在干燥間，溫度20-25°C，濕度小于30%，干燥2_5小時(shí)。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，所述的抗原標(biāo)記膠體金顆粒的方法為以氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為30-50nm的膠體金溶液，制備完成后取 IOOml膠體金液放在燒杯內(nèi)，用0. 2M K2CO3調(diào)至pH8. 5，按IOOml膠體金溶液加入0. 5-2mg 甲型肝炎病毒VP1和(或)VP3抗原，室溫?cái)嚢?小時(shí)，加入1 %牛血清白蛋白BSA，1 %聚乙二醇PEG20000封閉20min，12000r/m離心30分鐘，棄上清，用膠體金工作液復(fù)溶至100ml， 按Iml溶液鋪20cm2的比例均勻地鋪在玻璃纖維膜或無(wú)紡布上，再置干燥間，溫度20_25°C， 濕度小于30%，干燥2-5小時(shí)，制成膠體金墊。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，所述的試紙的裝配方法為在干燥室內(nèi)，溫度20-25 V，濕度小于40 %，取塑料支撐板板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/ 粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊，搭膠體金墊的1/5 ；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊，搭吸樣墊的1/10 ； 最后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成2-5mm寬的試紙條，切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi)， 形成檢測(cè)卡。所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，檢測(cè)方法為將被檢血清或血漿平衡至溫室，將試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入5-20ul被檢樣品，再加入 50-100ul的樣品稀釋液，使膠體金溶解并在NC膜上層析，然后用肉眼直接觀察在15分鐘內(nèi) C、Tl、T2線的出現(xiàn)情況，并判定檢測(cè)結(jié)果。本實(shí)用新型的有益效果是提供一種利用免疫層析膠體金技術(shù)檢測(cè)甲型肝炎病毒 IgM和IgG抗體的新型試紙。采用膠體金標(biāo)記甲型肝炎病毒特異性抗原，包被抗人IgM和 IgG抗體實(shí)現(xiàn)對(duì)血液中抗甲型肝炎病毒抗體的檢測(cè)，一次檢測(cè)獲得兩種檢測(cè)指標(biāo)，節(jié)約時(shí)間和成本，減輕患者的痛苦。具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、敏感性高、特異性強(qiáng)、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。

圖1甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙結(jié)構(gòu)示意圖。附圖符號(hào)說(shuō)明
4[0017]1 上樣墊；2 膠體金墊；3 =NC膜；4 吸樣墊5 檢測(cè)線Tl ；6 檢測(cè)線T2 ；7 質(zhì)控C線；8 塑料支撐板
具體實(shí)施方式
實(shí)施例制備甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙1主要材料1. 1甲型肝炎病毒特異性VPl抗原、VPl抗體深圳市菲鵬生物股份有限公司產(chǎn)品，為重組抗原，VPl抗原用于膠體金標(biāo)記，VPl抗體用于NC膜質(zhì)控線包被；鼠抗人IgM和 IgG抗體=Arista公司產(chǎn)品，用于NC膜包被；氯金酸=Sigma公司產(chǎn)品；硝酸纖維素(NC)膜 Millipore公司產(chǎn)品；牛血清白蛋白(BSA)，聚乙二醇PEG20000，水解酪蛋白=Sigma產(chǎn)品。 其它常用試劑均為分析純?cè)噭?.2臨床血清由公司在相關(guān)醫(yī)院獲得，其中甲型肝炎病毒IgG抗體陽(yáng)性樣本50份， IgM抗體陽(yáng)性樣本15份，其中包括兩種抗體均陽(yáng)性樣本8份。兩種抗體全為陰性正常人樣本60份。1. 3甲型肝炎病毒IgM抗體檢測(cè)試劑盒(ELISA法)，甲型肝炎病毒IgG抗體檢測(cè)試劑盒(ELISA法)國(guó)內(nèi)已注冊(cè)的商用產(chǎn)品。2 方法2. 1甲型肝炎病毒VPl重組抗原的膠體金標(biāo)記氯金酸-檸檬酸三鈉還原法制備直徑為40nm的膠體金溶液，制備完成后取三份膠體金，分別用0. 2M K2CO3將溶液調(diào)到pH7. 5、 pH8. 5和pH9. 5。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌，按每IOOml溶液加入0. 5mg、lmg、 1. 5mg將重組抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2小時(shí)，再滴加入到終濃度為
0.的PEG2000和的BSA進(jìn)行封閉20min，標(biāo)記結(jié)束后以12000r/m離心，棄上清，沉淀按原體積復(fù)溶至不同配比的膠體金工作液硼酸鹽緩沖液，PH8. 5，含BSA、羊血清，蔗糖和表面活性劑中。然后將標(biāo)記膠體金溶液按Iml溶液鋪20cm2的比例加樣于無(wú)紡布上，在溫度 20-25°C，相對(duì)濕度在< 30%的干燥間干燥2-4小時(shí)，制成膠體金墊。2. 2NC 膜包被用 0. OlM pH7. 2PBS 將鼠抗人 IgM 分別稀釋成 0. 5mg/ml、lmg/ml、
1.5mg/ml,2mg/ml,鼠抗人 IgG 分別稀釋成 0. 5mg/ml、lmg/mlU. 5mg/ml、ang/ml，然后用噴膜儀在NC膜下部按lul/cm進(jìn)行分別劃線包被，同時(shí)在NC膜上部包被抗VPl抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控，包被完成后將NC膜在在溫度20-25°C，相對(duì)濕度在< 30%的干燥間干燥2_5小時(shí)。2.3甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙的組裝在干燥室內(nèi)(溫度 20-25°C，相對(duì)濕度< 30% )取塑料支撐板，將已包被的NC膜放置在塑料支撐板的中部粘貼，在NC膜T線一側(cè)搭接膠體金墊(搭膠體金墊的1/ 粘貼，在膠體金墊另一側(cè)搭接粘貼上樣墊(搭膠體金墊的1/5)；在NC膜C線一側(cè)搭接吸樣墊(搭吸樣墊的1/10)；然后用裁剪機(jī)將貼好塑料板切成3mm或4mm寬的試紙條。切好的試紙條可以再裝入塑料卡內(nèi)，形成甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑卡。2. 4檢測(cè)方法將被檢血清或血漿平衡至溫室，將制備好的試紙條或試劑卡平放，在上樣墊上加入IOul被檢樣品，若樣品中含抗甲型肝炎病毒IgM或IgG抗體，則和樣品墊上的標(biāo)記VPl抗原的膠體金結(jié)合，形成復(fù)合物，并擴(kuò)散到NC膜上進(jìn)一步層析，當(dāng)遇到包被在NC
5膜上Tl線處的鼠抗人IgM時(shí)，復(fù)合物則又和包被抗IgM抗體結(jié)合，被捕獲在包被處；當(dāng)遇到包被在NC膜上T2線處IgG時(shí)，復(fù)合物則又和包被抗體結(jié)合，被捕獲在包被線T2處；當(dāng)被捕獲的膠體金復(fù)合物達(dá)到一定數(shù)量時(shí)，則形成一條肉眼可見(jiàn)的Tl或T2線；若血清中不含特異性抗體，則不能形成免疫復(fù)合物，亦不能形成T線，C線作為試劑的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，陽(yáng)性和陰性樣品檢測(cè)時(shí)均會(huì)出現(xiàn)。用肉眼直接觀察在5、10、15、20、和30分鐘內(nèi)C、T線的出現(xiàn)情況，并判定檢測(cè)結(jié)果。2. 5試紙工藝參數(shù)調(diào)試將濃度不同標(biāo)記、包被的試劑進(jìn)行組合配對(duì)，制備小樣，利用質(zhì)控血清對(duì)試劑進(jìn)行測(cè)試，發(fā)現(xiàn)最佳組合。2. 6臨床血清檢測(cè)用本試劑按檢測(cè)方法對(duì)所有臨床血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用商用檢測(cè)ELISA試劑進(jìn)行對(duì)照檢測(cè)。3 結(jié)果3. 1試紙參數(shù)確定根據(jù)小樣的檢測(cè)結(jié)果，確定了試紙的最佳標(biāo)記pH值為8. 5 ；重組混合抗原的最佳標(biāo)記量為lmg/100ml膠體金溶液；最佳的膠體金工作液為IOmM硼酸酸鹽緩沖液，PH8. 5，含0. 5% BSA、10%羊血清，2%蔗糖，0. 2% Tween 20 ；最佳包鼠抗人IgM和 IgG包被濃度均為1.5mg/ml。檢測(cè)結(jié)果的最佳判定時(shí)間為5_15分鐘。但以上參數(shù)在制備不同批次產(chǎn)品時(shí)可能需要適當(dāng)調(diào)整。3. 2臨床血清檢測(cè)以ELISA試劑為對(duì)照，對(duì)IgG抗體進(jìn)行檢測(cè)，本試劑IgG檢測(cè)出陽(yáng)性48份，ELISA檢測(cè)出IgG陽(yáng)性50份，靈敏度=48/50 = 96% ；本試劑對(duì)IgG陰性樣本檢測(cè)為陰性樣本數(shù)59份，相對(duì)特異性=59/60 = 98. 3%。P > 0. 05。以ELISA試劑為對(duì)照， 對(duì)IgM抗體進(jìn)行檢測(cè)，本試劑IgM檢測(cè)出陽(yáng)性10份，ELISA檢測(cè)出IgM陽(yáng)性10份，靈敏度 =10/10 = 100. 0%;本試劑對(duì)IgM陰性樣本檢測(cè)均為陰性，相對(duì)特異性100%。P > 0. 05。 IgM和IgG同時(shí)為陽(yáng)性的樣本本試劑檢測(cè)和ELISA試劑完全一致。臨床檢測(cè)表明本試劑的性能和ELISA試劑相比無(wú)顯著性差異，適合用于臨床檢測(cè)。
權(quán)利要求1.一種甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于塑料支撐板(8) —端粘貼上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記甲型肝炎病毒特異性的抗原VPl或 VP3的膠體金墊O)，膠體金墊( 一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)，硝酸纖維素膜包被有相互分離的檢測(cè)線Tl (5)、檢測(cè)線T2 (6)和質(zhì)控C線，檢測(cè)線Tl (5)為包被在NC膜上的抗人IgM抗體，檢測(cè)線T2 (6)為包被在NC膜上的抗人IgG抗體，質(zhì)控C線(7)為包被在NC膜上的抗甲型肝炎病毒VPl或VP3抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于所述的抗原為甲型肝炎病毒特異性的主要抗原VPl或VP3抗原，抗原可以利用基因工程重組表達(dá)或在培養(yǎng)病毒中純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙，其特征在于所述的上樣墊(1)為玻璃纖維膜或無(wú)紡布，吸樣墊由吸水濾紙構(gòu)成。
專(zhuān)利摘要本實(shí)用新型公開(kāi)了一種甲型肝炎病毒IgM和IgG抗體聯(lián)合檢測(cè)試紙。特征在于塑料支撐板(8)一端粘貼上樣墊(1)，上樣墊(1)的一端緊密壓接含有標(biāo)記甲型肝炎病毒抗原VP1或VP3的膠體金墊(2)，膠體金墊(2)一端緊密壓接硝酸纖維素NC膜(3)，膜上包被有相互分離的檢測(cè)線T1(5)、檢測(cè)線T2(6)和質(zhì)控C線，檢測(cè)線T1(5)為抗人IgM抗體，檢測(cè)線T2(6)為抗人IgG抗體，質(zhì)控C線(7)為抗甲型肝炎病毒VP或VP1抗體，硝酸纖維素膜的另一端連接吸樣墊(4)形成試紙。檢測(cè)時(shí)將被檢樣品加在試紙上樣墊上，15分鐘內(nèi)肉眼直接觀察，判定檢測(cè)結(jié)果。具有操作簡(jiǎn)便、快速、適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和經(jīng)濟(jì)實(shí)用等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/532GK202149901SQ20112018608
公開(kāi)日2012年2月22日 申請(qǐng)日期2011年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月3日
發(fā)明者劉寅, 岳曉燕, 張有青, 王晶, 羅云萍, 霍五奎, 馬雪明 申請(qǐng)人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司