專利名稱：一種熒光定量檢測克侖特羅的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實用新型屬于醫(yī)學(xué)檢驗領(lǐng)域，具體地說，本實用新型涉及一種熒光定量檢測克侖特羅(CLB)的免疫層析檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
克倫特羅是一種平喘藥，該藥物既不是獸藥，也不是飼料添加劑，而是腎上腺類神經(jīng)興奮劑?？藗愄亓_在家畜和人體內(nèi)吸收好，而且與其它興奮劑相比，它的生物利用度高，以至食用了含有克倫特羅的豬肉出現(xiàn)中毒。目前克倫特羅的檢測方法主要有4種，分別是試紙條速測法、酶聯(lián)免疫吸附測定法，氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜法。酶聯(lián)免疫吸附測定法、氣相色譜-質(zhì)譜法和高效液相色譜法可以定量檢測，但所需儀器設(shè)備昂貴不便于基層采用。試紙條法操作簡便、敏感靈敏度高，檢出率達90 %以上可用于現(xiàn)場快速診斷。申請?zhí)枮?00920108Μ5. 9的發(fā)明專利，涉及一種檢測動物源食品中克倫特羅含量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、克倫特羅抗體工作液、 克倫特羅6個濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、高濃度標(biāo)準(zhǔn)品、蓋板膜、自封袋、說明書和質(zhì)檢報告。采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中殘留的克倫特羅將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗克倫特羅抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中克倫特羅的殘留量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點，可在動物源性食品中克倫特羅的殘留量檢測中發(fā)揮重要作用。申請?zhí)枮镃N02153852. 2的發(fā)明專利，提供一種能夠快速半定量檢測鹽酸克倫特羅是否存在的試劑條及其制造方法。檢測鹽酸克倫特羅的試劑條，包括設(shè)有凹槽的吸附板， 在所述吸附板的凹槽內(nèi)吸附有帶固化相抗鹽酸克倫特羅的抗體的載體膜，所述載體膜上放置有帶有鹽酸克倫特羅與過氧化物酶偶聯(lián)物的釋放墊；所述試劑條還包括一個裝有底物和顯色劑的遮光容器。本發(fā)明的產(chǎn)品為一次性用檢測工具，屬于快速微量檢測，CBL的檢測限為lng/ml，對于控制瘦肉精等違禁藥物的非法使用具有重要的價值。

實用新型內(nèi)容本實用新型的目的在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種成本低廉、操作簡便、 靈敏性高的一種熒光檢測克侖特羅試劑盒。為實現(xiàn)上述目的，本實用新型采取了以下技術(shù)方案一種熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試劑盒，該試劑盒包括有試紙條和裝有熒光標(biāo)記液的試劑瓶，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；所述檢測區(qū)包被有0. 27 2. 70ug 的CLB-BSA偶聯(lián)物(克倫特羅-牛血清白蛋白偶聯(lián)物)，所述質(zhì)控區(qū)包被有0. 27-2. 7ug的抗兔IgG ；所述熒光標(biāo)記液中含有濃度分別為0. 5 2ug/ml的熒光標(biāo)記CLB抗體(克倫特羅抗體)和熒光標(biāo)記兔IgG。所述熒光標(biāo)記液的激發(fā)波長(Ex)為310 550nm，發(fā)射波長(Em)為340 620nm。本實用新型所述的克侖特羅的免疫層析試紙盒的檢測原理是競爭法，熒光素分子或熒光膠乳微粒與CLB抗體共價結(jié)合。將檢測樣本(尿樣或提取液)加入熒光標(biāo)記物中， 其熒光標(biāo)記CLB抗體可與尿液中的CLB結(jié)合，形成復(fù)合物；而包被在硝酸纖維素膜上檢測區(qū) (T)的CLB-BSA偶聯(lián)物也競爭結(jié)合熒光標(biāo)記CLB抗體。當(dāng)含CLB樣本與熒光標(biāo)記物混合后滴加至試紙條的上，在層析作用下混合液沿著硝酸纖維素膜向前移動，樣本中所含CLB量越多，可與T區(qū)CLB-BSA偶聯(lián)物結(jié)合的熒光標(biāo)記的抗體越少，從而使T區(qū)測得熒光檢出值降低。通過熒光檢測儀掃描T區(qū)熒光信號強度，可檢測出樣本中CLB含量。本實用新型的克侖特羅免疫層析試紙條與GC/MS、HPLC等色譜儀器以及酶免法檢測克侖特羅相比，具有簡便(簡單操作一步完成)、適合不同數(shù)量樣本檢測和快速(15分鐘左右即可有結(jié)果)等優(yōu)點；與免疫膠體金標(biāo)記試紙條相比，本實用新型具有靈敏度更高、準(zhǔn)確定量等優(yōu)點。本實用新型的克侖特羅層析試劑盒，不需要標(biāo)記墊，采用瓶裝的熒光標(biāo)記液與樣本預(yù)先混合的方法，使反應(yīng)與信號釋放更加均一，與其他層析法相比，其批量生產(chǎn)的精密度和準(zhǔn)確度達到最好效果。在熒光定量檢測儀上可以達到僅10秒就能對克侖特羅進行靈敏的定量測定，更快更精確的測定動物組織中所含的克侖特羅殘留；克侖特羅層析試紙條具有良好的準(zhǔn)確度(回收率為80%-110% )，定量偏差20%以內(nèi))和高靈敏度(靈敏度達 0. 2ug/kg)，需要的樣品量少(SOul)，操作非常簡便。

圖1是本實用新型的所述熒光定量檢測克侖特羅層析試劑盒中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖2是本實用新型的所述熒光定量檢測克侖特羅層析試劑盒中試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖；圖3是本實用新型的所述熒光定量檢測克侖特羅層析試劑盒中用于放置試紙條的檢測卡的結(jié)構(gòu)示意圖；附圖標(biāo)記說明1、樣品墊，2、硝酸纖維素包被膜，3、包括檢測區(qū)，4、質(zhì)控區(qū)，5、吸水6、底板，7、卡外殼，8、顯示窗，9、加樣孔。
具體實施方式
本實用新型所述熒光標(biāo)記液為熒光素與蛋白的標(biāo)記物或帶有熒光膠乳與蛋白的標(biāo)記物，其中所使用的熒光素為異硫氰酸熒光素、四乙基羅丹明、四甲基異硫氰酸羅丹明、 藻紅蛋白、多甲藻綠素蛋白、鑭系螯合物、羧基熒光素、香豆素等其中的一種或幾種。在本實用新型實施例中，所采用的CLB抗體為常規(guī)單克隆抗體技術(shù)制備的單抗， 所采用的CLB-BSA偶聯(lián)物(即克侖特羅抗原)是利用常規(guī)化學(xué)合成方法得到，利用競爭法的原理檢測標(biāo)本。本實用新型的試紙條根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法制備，所述試紙條的寬度通常為2. 7-3. 5mm,以下實施例例舉的試紙條的寬度為3mm。
以下結(jié)合附圖和具體實施例來詳細說明本實用新型。實施例一在該實施例中，熒光定量檢測克侖特羅免疫層析試劑盒，包括有試紙條和裝有熒光標(biāo)記液的試劑瓶(圖省略)。其中，按試紙條的常規(guī)方法，試紙條由樣品墊1、包括檢測區(qū)(T區(qū))3和質(zhì)控區(qū)(C 區(qū))4的硝酸纖維素包被膜2、吸水紙5依次相互搭接地粘貼在底板6上而構(gòu)成，如圖1和圖 2所示。在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線處包被有0. 72ug的CLB-BSA偶聯(lián)物(即克侖特羅抗原)，在包被膜的質(zhì)控區(qū)C線處包被有0. 45ug的抗兔IgG，用于結(jié)合熒光標(biāo)記的兔 IgG，用于檢測試紙條的有效性。在該實施例中，熒光標(biāo)記液受3IOnm激發(fā)，發(fā)射波長為340nm。在該實施例中，熒光標(biāo)記液的制備采用含羧基的熒光膠乳標(biāo)記物(本實施例用到的熒光素為7-羥基香豆素膠乳)的制備方法(A)，步驟如下將500mg的7_羥基香豆素膠乳分別與70mgCLB抗體或兔IgG混合后，邊攪拌邊緩慢加入1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC)和N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)， 使其整個反應(yīng)體系中EDC的含量為0. aiig，NHS含量為0. lmg，在低溫下2 8 °C避光反應(yīng)過夜。用透析或其他方法去除雜質(zhì)；用熒光保護劑復(fù)溶。將上述制備好的熒光膠乳微粒標(biāo)記的CLB抗體和熒光膠乳微粒標(biāo)記兔IgG按適當(dāng)比例混合，以使兩種抗體濃度分別都為2ug/ml，分裝備用。實施例二在該實施例中，熒光定量檢測克侖特羅免疫層析試劑盒，包括有試紙條和裝有熒光標(biāo)記液的試劑瓶(圖省略)。其中，按試紙條的常規(guī)方法，試紙條由樣品墊1、包括檢測區(qū)(T區(qū))3和質(zhì)控區(qū)(C 區(qū))4的硝酸纖維素包被膜2、吸水紙5依次相互搭接地粘貼在底板6上而構(gòu)成，如圖1和圖 2所示。其中，試紙條由樣品墊、包括檢測區(qū)(T區(qū))和質(zhì)控區(qū)(C區(qū))的纖維素包被膜、吸水紙按試紙條的常規(guī)方法依次相互搭接地粘貼在底板上。在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線處包被有1. Sug的CLB-BSA偶聯(lián)物(即克侖特羅抗原)，在包被膜的質(zhì)控區(qū)C線處包被有1. Sug的抗兔IgG，用于結(jié)合熒光標(biāo)記的兔IgG， 用于檢測試紙條的有效性。在該實施例中，熒光標(biāo)記液受550nm激發(fā)后，發(fā)射波長為620nm。在該實施例中，熒光標(biāo)記液的制備采用含氨基的熒光膠乳標(biāo)記物(本實施例用到的熒光素為四甲基異硫氰酸羅丹明膠乳)的制備方法，步驟如下將500mg熒光膠乳標(biāo)記物與75mgCLB抗體或75mg兔IgG混合后，置于4 40°C環(huán)境，調(diào)節(jié)體系PH7. 0 8. 5，一邊攪拌一邊緩慢加入0. 4 0. 6%戊二醛；反應(yīng)2 5小時， 透析或其他方法去除雜質(zhì)，用熒光保護劑復(fù)溶。將上述制備好的熒光膠乳微粒標(biāo)記的CLB抗體和熒光膠乳微粒標(biāo)記兔IgG按適當(dāng)比例混合，以致兩種抗體濃度分別都為0. 5ug/ml，分裝備用。[0037]實施例三在該實施例中，熒光定量檢測克侖特羅免疫層析試劑盒，包括有試紙條和裝有熒光標(biāo)記液的試劑瓶(圖省略)。其中，按試紙條的常規(guī)方法，試紙條由樣品墊1、包括檢測區(qū)(T區(qū))3和質(zhì)控區(qū)(C 區(qū))4的硝酸纖維素包被膜2、吸水紙5依次相互搭接地粘貼在底板6上而構(gòu)成，如圖1和圖 2所示。本實施例的克侖特羅免疫層析檢測試劑盒，半成品通過以下工序組裝而成由樣品墊1、包被膜2、吸水紙5順次搭接粘貼在底板6上，構(gòu)成試紙條，再試紙條安裝在卡外殼 7 (如圖3所示)內(nèi)，固定成檢測卡，所述卡外殼7還涂有可供熒光儀掃描識別的產(chǎn)品信息噴碼標(biāo)記層。與寫入信息的ID芯片(現(xiàn)有技術(shù)中的ID芯片采用的定量計算公式為檢測信號值與計算濃度的半對數(shù)直線方程式或其他計算方程式，可自動進行結(jié)果判定)。分裝好的熒光標(biāo)記液和其他配件組裝成試劑盒。本實用新型所述熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試劑盒，在使用時，組裝在由塑料上殼和塑料下殼扣合而成的塑料卡外殼7 (檢測卡)中，塑料上殼設(shè)有兩個開孔，加樣孔9和顯示窗8，加樣孔9對應(yīng)于所述的熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試紙條樣品墊， 結(jié)果顯示窗8對應(yīng)于所述熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試紙條的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)，該熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試紙條可以從該塑料外殼中取出。在該實施例中，包被膜的檢測區(qū)T線處包被有0. 9ug的CLB-BSA偶聯(lián)物(即克侖特羅抗原)，在包被膜的質(zhì)控區(qū)C線處包被有0. 9ug的抗兔IgG，用于結(jié)合熒光標(biāo)記的兔IgG， 用于檢測試紙條的有效性。在該實施例中，熒光標(biāo)記液受490nm激發(fā)，發(fā)射波長為530nm。在該實施例中，熒光標(biāo)記液的制備采用含硫碳酰氨基的熒光素(本實施例用到的熒光素為異硫氰酸熒光素)的制備方法，步驟如下用pH8. 0 pH9. 6碳酸緩沖液分別溶解65mgCLB抗體或65mg兔IgG，用pH8. 0 PH9. 6碳酸緩沖液溶解或懸浮20mg異硫氰酸熒光素；邊攪拌邊將上述的異硫氰酸熒光素漸漸加入球蛋白溶液中，加完后，繼續(xù)避光攪拌ι池左右，結(jié)合完畢后，裝入透析袋中，用上述碳酸緩沖鹽水在低溫下透析過夜，用熒光保護劑復(fù)溶。將上述制備好的熒光物標(biāo)記的CLB抗體和熒光膠乳微粒標(biāo)記兔IgG按適當(dāng)比例混合，以致兩種抗體濃度分別都為lug/ml，分裝備用用來測試免疫層析試紙條的熒光定量光譜檢測系統(tǒng)(免疫熒光檢測儀)，主要包含熒光光源系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)及自動軟件分析控制系統(tǒng)。本實用新型的所述熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試劑盒，檢測樣本需要通過以下操作吸取50 150ul的樣本(尿樣/提取液)與熒光標(biāo)記液等量混合，混勻后吸取 50 150ul，往水平放置檢測卡加樣孔加入，不要帶入氣泡，開始層析反應(yīng)。反應(yīng)15分鐘， 由熒光檢測儀讀取測試結(jié)果。本發(fā)明的實施例1-3所述的定量克倫特羅免疫層析檢測試劑盒與免疫熒光檢測儀對200例樣本(尿樣/提取液)的測定結(jié)果比較表明在0. 2ppb 5ppb范圍內(nèi)測定克倫特羅的準(zhǔn)確性高定量曲線線性系數(shù)均大于0. 99，樣本中含Ippb與2ppb濃度的克倫特羅其準(zhǔn)確度為80% 120%，試劑盒檢出限為0.2ppb。相對一般采用的膠體金法(定性)和酶聯(lián)免疫檢測法檢測試劑盒的檢測結(jié)果具有更好的靈敏度和特異性。具體如下表。
權(quán)利要求1.一種熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試劑盒，其特征是，該試劑盒包括有試紙條和裝有熒光標(biāo)記液的試劑瓶，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成；所述硝酸纖維素包被膜包括有包被有0. 27 2. 7ug的克倫特羅-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的檢測區(qū)和包被有0. 27-2. 7ug的抗兔IgG的質(zhì)控區(qū)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試劑盒，其特征是，還包括有卡外殼，所述試紙條被包裝在卡外殼內(nèi)，所述卡外殼一側(cè)的表面設(shè)有加樣孔和顯示窗， 所述加樣孔對應(yīng)于試紙條樣品墊的位置，所述顯示窗對應(yīng)于試紙條的檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)的位置。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試劑盒，其特征是，所述卡外殼還涂有供熒光儀掃描識別的產(chǎn)品信息的噴碼標(biāo)記層。
專利摘要本實用新型公開了一種熒光定量檢測克侖特羅的免疫層析試劑盒，該試劑盒包括有試紙條和裝有熒光標(biāo)記液的試劑瓶，所述試紙條由樣品墊、硝酸纖維素包被膜、吸水紙順次搭接粘貼在底板上構(gòu)成；所述硝酸纖維素包被膜包括檢測區(qū)和質(zhì)控區(qū)；所述檢測區(qū)包被有CLB-BSA偶聯(lián)物，所述質(zhì)控區(qū)包被抗兔IgG；所述熒光標(biāo)記液中含有熒光標(biāo)記CLB抗體和熒光標(biāo)記兔IgG。與免疫膠體金標(biāo)記試紙條相比，本實用新型具有靈敏度更高、準(zhǔn)確定量等優(yōu)點，而操作比酶聯(lián)法更加快速和簡便。
文檔編號G01N33/577GK202330435SQ20112040385
公開日2012年7月11日 申請日期2011年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月21日
發(fā)明者唐海波, 彭運平, 王繼華 申請人:廣州萬孚生物技術(shù)有限公司