專利名稱：基于磁性傳感器的定量結(jié)合動力學分析的制作方法
基于磁性傳感器的定量結(jié)合動力學分析相關(guān)串請的引用根據(jù)美國法典第35篇第119條(e)款，本申請要求2010年3月12日提交的美國臨時專利申請第61/313,604號的優(yōu)先權(quán)，其公開內(nèi)容全文特此以引用方式并入本文。政府支持串明本發(fā)明由美國政府支持通過國家癌癥研究所(National Cancer Institute)的基金第1U54CA119367號以及國家科學基金會(National Science Foundation)的基金第ECCS-0801385-000號完成。所述政府在本發(fā)明中享有特定權(quán)益。 企塑生物過程決定于第一和第二分子的分子對之間的分子相互作用。這些分子相互作用的實例包括核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、酶-底物相互作用以及受體-配體相互作用，例如，抗體-抗原相互作用和受體-激動劑或拮抗劑相互作用。對DNA雜交、抗原-抗體結(jié)合以及DNA-蛋白質(zhì)相互作用的基于親和性的感應均已表明在基礎科研、臨床診斷、生物分子工程和藥物設計中發(fā)揮重要作用。隨著該領(lǐng)域進展狀況，對用于測定分子身份和反應細節(jié)的精確、敏感、高通量和迅速的方法的需求在分析方法的演化中造成持續(xù)的壓力。為滿足這些迫切需要，研究者已經(jīng)轉(zhuǎn)向于分子標記物以期改善對稀少分子檢測的敏感度。然而，這些標記物可能會改變擴散以及空間排布現(xiàn)象。此外，高通量或速度的要求通常不允許經(jīng)典的平衡方法的使用，因而詳細了解反應動力學、擴散現(xiàn)象以及表面固定化的含義對于獲取有意義的反應參數(shù)而言變得至關(guān)重要。當評價給定分子相互作用的動力學時，多種定量動力學參數(shù)可能成為目標。一種目標定量動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)。結(jié)合速率常數(shù)(即，ka、km)是描述兩種分子在平衡中的結(jié)合親和性的數(shù)學常數(shù)，諸如抗體和抗原的結(jié)合親和性。另一種目標定量動力學參數(shù)是解離速率常數(shù)(即，kdAtjff)。所述解離速率常數(shù)是描述較大物體可逆地分離(解離)成為較小組分的傾向的數(shù)學常數(shù)，如當受體/配體復合體解離成為其組分分子的時候。第三種目標動力學參數(shù)是擴散速率常數(shù)kM，該常數(shù)是描述標記的分子向傳感器進行擴散的速率的數(shù)學常數(shù)。發(fā)明概沭提供了對分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)進行定量地測定的方法。本方法的實施方案的方面包括制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器裝置包含與分析混合物接觸的磁性傳感器，所述分析混合物包含磁性標記的分子以產(chǎn)生可檢測的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實時信號；以及由所述實時信號定量地確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。還提供了被配置為用于所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。本發(fā)明的方面包括定量測定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的方法。所述方法包括制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器裝置包括與分析混合物接觸的磁性傳感器，所述分析混合物具有磁性標記的分子以產(chǎn)生可檢測的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實時信號；以及由所述實時信號定量地確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。
在某些實施方案中，所述結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)CO。在一些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是解離速率常數(shù)(kd)。在某些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是擴散限制速率常數(shù)(kM)。在某些實施方案中，結(jié)合動力學參數(shù)為結(jié)合速率常數(shù)CO、解離速率常數(shù)(kd)和擴散限制速率常數(shù)(kM)中的至少一種。在某些實施方案中，所述磁性傳感器包括與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括將所述磁性標記的分子涂覆于所述磁性傳感器。在某些實施方案中，所述磁性傳感器包括捕獲探針，所述捕獲探針特異地結(jié)合于與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括將與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子和所述磁性標記的分子相繼地涂覆于所述磁性傳感器。在一些情況下，所述磁性傳感器包括捕獲探針，所述捕獲探針特異地結(jié)合于與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括制備具有與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子和所述磁性標記的分子的反應混合物，并且隨后將所述反應混合物涂覆于所述磁性傳感器。在某些實施方案中，所述磁性傳感器是自旋閥傳感器。在一些情況下，所述磁性傳感器是磁性隧道結(jié)傳感器。在某些情況下，所述分子結(jié)合相互作用是諸如核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用或蛋白質(zhì)-核酸相互作用的結(jié)合相互作用。在一些情況下，定量測定的步驟包括用擬合算法處理所述實時信號。在某些情況下，所述擬合算法是二室擬合算法(two-compartment fitting algorithm)。在一些實施方案中，所述二室擬合算法包括主體區(qū)室(bulk compartment)和表面區(qū)室(surfacecompartment)。本發(fā)明的方面還包括定量測定兩種或更多種不同分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的方法，其中各個不同分子結(jié)合相互作用包括不同磁性標記的分子。所述方法包括制備包括兩個或更多個不同的磁性傳感器的磁性傳感器裝置，各個磁性傳感器接觸具有磁性標記的分子的分析混合物從而產(chǎn)生兩種或更多種不同的分子結(jié)合相互作用；從各個磁性傳感器中獲取實時信號；以及從所述實時信號中定量測定針對所述兩種或更多種不同的分子結(jié)合相互作用中的每種的結(jié)合動力學參數(shù)。在某些實施方案中，所述結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)CO。在一些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是解離速率常數(shù)(kd)。在某些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是擴散限制速率常數(shù)(kM)。在某些實施方案中，結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)CO、解離速率常數(shù)(kd)和擴散限制速率常數(shù)(kM)中的至少一種。在某些實施方案中，所述結(jié)合相互作用是諸如核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用或蛋白質(zhì)-核酸相互作用的結(jié)合相互作用。本發(fā)明的方面還包括磁性傳感器裝置。所述磁性傳感器裝置包括磁性傳感器，所述磁性傳感器被配置為檢測磁性標記的分子；以及處理器，所述處理器被配置為從所述磁性傳感器中獲取實時信號和由所述實時信號定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。在某些實施方案中，所述結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)CO。在一些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是解離速率常數(shù)(kd)。在某些情況下，所述結(jié)合動力學參數(shù)是擴散限制速率常數(shù)(kM)。在某些實施方案中，結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)CO、解離速率常數(shù)(kd)和擴散限制速率常數(shù)(kM)中的至少一種。在某些情況下，所述磁性傳感器是自旋閥傳感器。在一些情況下，所述磁性傳感器是磁性隧道結(jié)傳感器。在某些實施方案中，所述磁性傳感器包括兩個或更多個感應區(qū)。在一些情況下，所述磁性傳感器包括四個或更多個感應區(qū)。在一些情況下，所述感應區(qū)以串聯(lián)和并聯(lián)的方式連接。在某些情況下，所述裝置包括兩個或更多個不同的磁性傳感器。在一些情況下，所 述裝置包括100個或更多個不同的磁性傳感器。在一些情況下，所述裝置包括1000個或更多個不同的磁性傳感器。在某些實施方案中，所述裝置還包括所述磁性標記的分子和與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子。本發(fā)明的方面還包括試劑盒，該試劑盒包括(a)磁性標記物；以及(b)以下物質(zhì)中的至少一種(i)計算機可讀的媒介，其上儲存有計算機程序，當計算機執(zhí)行該程序時，該程序操控計算機由獲自磁性傳感器的實時信號定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)；以及(ii)具有用于獲得所述計算機程序的地址的物理基板。


圖1(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的使用與磁性傳感器結(jié)合的捕獲抗體、與所述捕獲抗體結(jié)合的分析物和與磁性標簽連接的檢測抗體進行的夾心分析法的示意圖。圖I (b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的使用與磁性傳感器結(jié)合的捕獲DNA、與所述捕獲DNA結(jié)合的靶DNA和與磁性標簽連接的檢測DNA進行的DNA夾心分析法的示意圖。圖2提供了根據(jù)本發(fā)明實施方案的二室反應擴散模型的示意圖。標記的抗體通過運輸過程移向傳感器表面并且隨后通過結(jié)合流動(conjugation flux)進行結(jié)合和釋放。圖3示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的鏈霉親和素-生物素結(jié)合相互作用的(a)和EpCAM抗體對EpCAM抗原的(b)的動力學模型與實時結(jié)合數(shù)據(jù)之間的比較圖。一旦所述模型與所述結(jié)合數(shù)據(jù)進行了擬合，由所述擬合計算所述結(jié)合速率常數(shù)、解離速率常數(shù)和擴散限制速率常數(shù)。圖3(c)和3(d)所示的實時結(jié)合曲線示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的以平行實驗進行的CEA抗體對CEA抗原的結(jié)合動力學監(jiān)測從而比較磁性納米傳感器與表面等離子體共振(SPR)系統(tǒng)。所述GMR生物傳感器具有5. OX IO4 M、—1的ka計算值以及4. 4X 10_4s^1的kd計算值，而SPR實驗產(chǎn)生了 4. 44X IO4 M、-1的ka以及I. 17X 10_4 s-1的kd。圖4(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的抗體-抗原結(jié)合(并非按比例繪制)的示意圖。在左側(cè)，用磁性標簽標記的抗體在濃度為Cs的溶液中靠近所述GMR傳感器表面。當未結(jié)合時，擴散磁性標記的抗體距離所述GMR傳感器過遠以致不能被檢測到。在所述傳感器表面的是抗原,其以nmax的初始表面濃度被固定。正如右側(cè)所描述，一旦所述磁性標記的抗體與所述抗原結(jié)合，來自所述磁性標簽的磁場就被下方的基于接近度的GMR傳感器檢出。 所述捕獲的抗體-抗原復合體以n表示。圖4(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的按比例繪制的磁性標記的抗體的示意圖。所述磁性標簽包括包埋于葡聚糖聚合物內(nèi)的若干個氧化鐵核并且其隨后使用抗體或受體進行功能化。圖4(c)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的包括1，008個磁性傳感器的Imm2芯片的照片。圖4(d)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的經(jīng)完全加工的芯片的光學顯微照片和掃描電子顯微鏡(SEM)圖像。1，008個GMR生物傳感器被分成16個亞陣列，并且各亞陣列占90 u mX90 u m的面積。圖5(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的通過方程M. 6中的分析模型(虛線)所預測的抗-EpCAM抗體對表面固定化的EpCAM抗原的結(jié)合曲線圖以及所測得的實驗數(shù)據(jù)(實線)的結(jié)合曲線圖，其中EpCAM蛋白的表面濃度以2X的系列稀釋度從5阿摩爾(n_)被稀釋至20仄摩爾(z印tomole) (n_/256)。本實驗中的全部曲線對通過所述模型所預測曲線的擬合誤差為R2 = 0. 98。圖5(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的分析模型所預測的(虛線)MNP-抗-EpCAM抗體對固定化于所述傳感器表面的833仄摩爾(nmax/6)的EpCAM抗原的結(jié)合曲線圖以及所測得的實驗數(shù)據(jù)(實線)的結(jié)合曲線圖，其中MNP-抗-EpCAM蛋白的溶液濃度為未經(jīng)稀釋、2X稀釋和8X稀釋。全部曲線對通過所述模型的擬合誤差為R2 =
0.96。y_軸以百萬分比(ppm)顯示了對初始MR進行歸一化的MR變化。圖6 (a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的在12組重復傳感器上的抗CEA抗體對抗原的多元動力學分析以及在3組重復傳感器上的抗VEGF抗體對抗原的多重動力學分析圖。圖6(b)示出了監(jiān)測生物素對鏈霉親和素結(jié)合動力學的25組重復傳感器示圖。圖6(c)示出了SPR圖并且圖6(d)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的基于磁性納米傳感器的平臺的結(jié)果圖，當在平行實驗中對CEA抗體結(jié)合CEA抗原進行監(jiān)測時所述圖提供了類似的實時結(jié)合曲線。圖7示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的每傳感器的磁性標簽數(shù)量隨時間變化的圖。獲得了各個加載團塊的SEM圖像(示于圖7右側(cè))用以對所述實驗中結(jié)合的MNP數(shù)量與所述模型預測的數(shù)量進行比較。圖8示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的不同固定化抗原加載量隨時間的傳感器信號圖。圖9(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的針對表位分布和交叉反應因素的選擇性蛋白質(zhì)定向的示意圖。圖9(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的用抗-EGFR捕獲抗體(作為對照)功能化的抗-EGFR Ab傳感器的圖，其可捕獲EGFR并且當所述抗EGFR抗體-MNP復合體結(jié)合之時被檢出。圖9(c)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的證實了被監(jiān)測的動力學與結(jié)合EGFR的抗-EGFR抗體-MNP復合體相關(guān)的圖。y_軸以百萬分比(ppm)顯示了對初始MR進行歸一化的MR變化。圖10示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的使用高密度GMR傳感器陣列產(chǎn)生的2D空間內(nèi)不同時間下蛋白質(zhì)擴散動力學的可視化效果。y_軸單位以百萬分比(ppm)顯示了對初始MR進行歸一化的MR變化。圖11(a)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的用于監(jiān)測穿過使用磁性傳感器組的芯片陣列的蛋白質(zhì)擴散動力學的實驗裝置照片。在圖11(a)中，使用捕獲抗體將四個四傳感器組選擇性地固定于CEA。在圖11(a)中被圈不的各個傳感器組對應于圖11(b)內(nèi)圖中的匹配曲線。在將所述未反應捕獲抗體洗去之后，將以MNP標簽進行標記的檢測抗體在反應孔內(nèi)進行孵育。圖11(b)示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的信號隨時間的變化圖。在向左上角的孔加入可溶的CEA抗原時，有可能在空間和時間上將CEA蛋白經(jīng)過所述孔的移動可視化。圖12示出了包含并聯(lián)和串聯(lián)的72組傳感器條GMR傳感器結(jié)構(gòu)的光學顯微圖像。圖12中的插圖示出了 GME傳感器的一個磁性傳感器條的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像，其上具有多個結(jié)合的磁性納米顆粒標簽。圖13示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的描述方程M. 6中各項貢獻的對數(shù)圖，方程M. 6是結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標記抗體數(shù)量的函數(shù)。圖14示出了根據(jù)本發(fā)明實施方案的由Langmuir吸附模型所預測的(虛線)和實驗測得的(實線)抗-EpCAM抗體對表面固定化的EpCAM抗原的結(jié)合曲線圖。發(fā)明詳沭提供了對分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)進行定量地測定的方法。本方法的 實施方案的方面包括制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器包含與分析混合物進行接觸的磁性傳感器，所述分析混合物包含磁性標記的分子以產(chǎn)生可檢測的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實時信號；以及由所述實時信號定量地確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參。還提供了被配制為用于所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。在對本發(fā)明進行更為詳盡的描述之前，應當了解本發(fā)明并不限于所描述的特定實施方案，因此本發(fā)明當然可以變化。還應了解，本文所使用的術(shù)語僅出于描述特定實施方案的目的并且并非意在進行限定，因為本發(fā)明的范圍應僅由所附的權(quán)利要求進行限定。在提供數(shù)值范圍的情況下，應當了解本發(fā)明涵蓋了處于所述范圍的上限和下限之間的各中間數(shù)值以及該規(guī)定范圍中的任意所述或中間數(shù)值，除非上下文進行清楚地另行指明否則下限精確到十分位。這些較小范圍的上限和下限可被獨立地包含于所述較小范圍內(nèi)并且亦被涵蓋于本發(fā)明之內(nèi)，除在規(guī)定范圍被明確排除的任何范圍限制。在所規(guī)定范圍包含這些范圍限制的之一或全部的情況下，不包括這些被包含的范圍限制之一或全部的范圍也包含于本發(fā)明之內(nèi)。特定范圍限制在本文中以數(shù)值方式給出，其前具有術(shù)語“約”。本文所使用的術(shù)語“約”在本文中被用于為其后的精確數(shù)字以及接近或近似所述術(shù)語之后的數(shù)字的數(shù)字提供文字上的支持。在確定數(shù)字是否接近或近似明確提及的數(shù)字時，所述接近或近似的未提及數(shù)字可以是在其所處的上下文中提供了所述明確提及的數(shù)字的實質(zhì)等價物的實質(zhì)等效數(shù)字。除非另行定義，否則本文所使用的全部技術(shù)和科學術(shù)語具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所通常理解的含義。盡管與本文所述類似或等價的任意方法和材料也可被用于本發(fā)明的實施或測試，在此描述了代表性的說明性方法和材料。本說明所引用的全部出版物和專利以引用的方式并入本文，正如各個出版物或?qū)＠惶囟ㄇ覀€別地表明通過引用的方式并入，并且其以引用的方式并入本文用以公開和描述與所述出版物通過引用而進行關(guān)聯(lián)的方法和/或材料。任意出版物的引用是對所述出版物在本申報日期之前的公開內(nèi)容的引用并且不應解釋為承認本發(fā)明無權(quán)通過以在先發(fā)明的方式從而先于這些出版物。此外，所提供的出版的日期可與實際出版日期不同，所述實際出版日期可能需要進行獨立證實。應當認識到，本文以及所附的權(quán)利要求書中所使用單數(shù)形式的“一個”、“一種”和“所述”包含了復數(shù)個指示物，除非上下文明確地另行指明。進一步應認識到，所述權(quán)利要求書可被撰寫為排除任意可選的要素。同樣地，本申明意在用作為與權(quán)利要求要素有關(guān)的諸如“唯獨”、“僅”等等這些排它性術(shù)語的使用或“否定”限定的使用的前提基礎。應當了解，出于明了澄清的目的而在不同獨立實施方案內(nèi)所描述的本發(fā)明的特定特征也可以結(jié)合形式提供于單一實施方案之中。反過來，出于簡要的目的而在單一實施方案內(nèi)所描述本發(fā)明的多種特征也可以分別提供或以任何適當?shù)姆纸M進行提供。所述實施方案的所有組合被明確地包含于本發(fā)明內(nèi)并且在本文公開的方式正如各自每一組合被單獨和明確地進行公開，其程度使這些組合包含了可操作的加工和/或裝置/系統(tǒng)/試劑盒。此夕卜，描述這些可變因素的實施方案中所列的所有亞組合也被本發(fā)明明確地包含并且在本文公開的方式正如各自每一化學群體亞組合被單獨和明確地在本文中被公開。正如本領(lǐng)域的技術(shù)人員在閱讀本發(fā)明后所明了，本文所描述和說明的各個單獨實施方案具有分立的組分和特征，其在不脫離本發(fā)明的范圍或精神的情況下可容易地同任意 其它多個實施方案的特征進行拆分和組合。任何提及的方法均可以所提及的事件為順序或以邏輯上可行的任何其它順序進行實施。為進一步描述本發(fā)明的實施方案，首先將對本方法的實施方案的方面進行更為詳盡的描述。隨后討論了可用于實施本發(fā)明的方法的系統(tǒng)和試劑盒的實施方案。方法根據(jù)上文所總結(jié)，本發(fā)明的實施方案涉及對目標分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)進行定量測定的方法。在某些實施方案中，所述目標結(jié)合相互作用是第一種和第二種分子之間的相互作用，例如第一種和第二種生物分子之間的相互作用。例如，所述第一種和第二種分子之一可以是磁性標記的分子，并且所述第一種和第二種分子之一可以是與所述磁性標記分子特異性結(jié)合的分子?！岸繙y定”意指以數(shù)量方式例如以數(shù)值的方式表達目標結(jié)合動力學參數(shù)?！敖Y(jié)合動力學參數(shù)”意指可測量的結(jié)合動力學因子，其至少部分地定義給定分子相互作用并且可被用于定義其行為。目標結(jié)合動力學參數(shù)包括但不限于，結(jié)合速率常數(shù)(S卩，ka、kon)、解離速率常數(shù)(即，kd、koff)、擴散限制速率常數(shù)(即，kM)、活化能(即，Ea)、傳輸參數(shù)如擴散率，等等。根據(jù)上文所總結(jié)，本發(fā)明的方法可包含下列步驟制備與包含磁性標記的分子的分析混合物進行接觸的磁性傳感器裝置；從磁性傳感器裝置中獲取實時信號；并且由所述實時信號定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。這些步驟均各自進行更為詳盡地描述。制備與包含磁性標記的分子的分析混合物進行接觸的磁性傳感器裝置所述方法的方面包括制備與包含磁性標記的分子的分析混合物進行接觸的磁性傳感器裝置。所述方法包括，制備磁性傳感器與包含目標結(jié)合相互作用的構(gòu)件分子(即，所述目標結(jié)合相互作用的結(jié)合對構(gòu)件)和磁性標記物的組合物(如，分析混合物)接觸的裝置或結(jié)構(gòu)，其中所述磁性標記物可以是所述目標結(jié)合相互作用的構(gòu)件分子之一的部分或結(jié)構(gòu)域，或是不同分子的組分，如，與所述目標結(jié)合相互作用的兩種構(gòu)件分子之一特異結(jié)合的第三種分子。在與所述磁性傳感器進行接觸的組合物或分析混合物中，所述磁性標記物可以與所述結(jié)合對構(gòu)件之一穩(wěn)定地結(jié)合例如共價或非共價結(jié)合以產(chǎn)生磁性標記的分子。如將下文進一步所描述的，例如在所述結(jié)合對構(gòu)件彼此何時接觸方面和或所述磁性傳感器方面、與裝置相關(guān)的所述結(jié)合對構(gòu)件的配置方面，制備與包含磁性標記的分子的分析混合物進行接觸的磁性傳感器裝置的步驟可包含多種不同的過程亞組合。結(jié)合對根據(jù)本文所述的方法，用于進行定量動力學分析的給定結(jié)合相互作用可由分子的結(jié)合對組成，諸如第一種和第二種生物分子。分子結(jié)合對可根據(jù)所述目標結(jié)合相互作用而廣為變動。目標結(jié)合相互作用包括所述結(jié)合對分子之間的任意相互作用，其中所述結(jié)合相互作用以所述分子結(jié)合對在所述結(jié)合相互作用的環(huán)境條件下所具有的特異性而進行。目標結(jié)合相互作用的實例包括但不限于核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、蛋白質(zhì)-核酸相互作用、酶-底物相互作用以及受體-配體相互作用如抗體-抗原相互作用和受體-激動劑或拮抗劑相互作用。具有目標分子結(jié)合相互作用的分子的實例包括但不限于生物聚合物和小分子，所述小分子可以是有機或無機小分子?！吧锞酆衔铩笔且环N或多種類型的重復單元的聚 合物。生物聚合物可見于生物系統(tǒng)中(盡管它們可以通過合成而制備)并且可包含肽、聚核苷酸和多糖，以及這樣一些化合物，其包含氨基酸類似物或非氨基酸基團，或核苷酸類似物或非核苷酸基團或由以上這些所構(gòu)成。同樣，生物聚合物包括常規(guī)骨架被非天然存在的或合成的骨架所取代的聚核苷酸，并且包括一個或多個常規(guī)堿基被能夠參與沃森-克里克(Watson-Crick)型氫鍵相互作用的基團(天然的或合成的)所取代的核酸(或合成的或天然存在的類似物)。例如，“生物聚合物”可包括DNA (包括cDNA)、RNA、寡核苷酸和PNA以及根據(jù)美國專利第5，948，902號及其引用參考中的描述其它聚核苷酸。“生物單體”指能夠與相同的或其它生物單體連接以形成生物聚合物的單一單元(例如，具有兩個連接基團的單一氨基酸或核苷酸，所述連接基團中的一個或兩個可具有可去除的保護基團)。本文所使用的術(shù)語“肽”在本文中指通過一個氨基酸的a -羧基基團與另一個基團的a-氨基基團之間的酰胺形成而產(chǎn)生的任意聚合物化合物。所述術(shù)語“寡肽”在本文中指具有少于約10個至20個殘基即氨基酸單體單元的肽。本文所使用的術(shù)語“多肽”在本文中指具有多于約10個至20個殘基的肽。本文使用的術(shù)語“蛋白質(zhì)”指具有多于約50個殘基的特定序列的多肽并且包括D和L形式、經(jīng)修飾的形式等等。本文所使用的術(shù)語“多肽”和“蛋白質(zhì)”可互換使用。本文所使用的術(shù)語“核酸”在本文中指由核苷酸構(gòu)成的聚合物，所述核苷酸的例子如脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或可與天然存在的核酸以序列特異性的方式雜交的合成制備的化合物(如，美國專利第5，948，902號及其引用參考中所述的PNA)，所述雜交方式類似于兩種天然存在的核酸的雜交，例如，可參與沃森-克里克堿基配對相互作用。核酸可為任意長度，如2個堿基或更長、10個堿基或更長、100個堿基或更長、500個堿基或更長、1000個堿基或更長，包括10，000個堿基或更長。本文使用的術(shù)語“聚核苷酸”指由長度一般多于約100個核苷酸的核苷酸單體構(gòu)成的單鏈或雙鏈聚合物。聚核苷酸包含單鏈或多鏈結(jié)構(gòu)，其中所述鏈中的一個或多個可以完全或可以不完全與另一個對齊。本文所使用的術(shù)語“核糖核酸”和“RNA”在本文中指由核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物。本文所使用的術(shù)語“脫氧核糖核酸”和“DNA”在本文中指由脫氧核糖核苷酸構(gòu)成的聚合物。本文所使用的術(shù)語“寡核苷酸”在本文中表示單鏈核苷酸多聚體，其長約10個至約200個核苷酸，諸如長約25個至約175個核苷酸，包括長約50個至約160個核苷酸，如長度為150個核苷酸。
在一些情況下，所述分子結(jié)合對是配體和受體，其中給定的受體或配體可以是或可以不是生物聚合物。本文所使用的術(shù)語“配體”在本文中指能夠與目標化合物共價地或以其它化學方式進行結(jié)合的部分。配體可以是天然存在的或人造的。配體的實例包括但不限于，細胞膜受體的激動劑和拮抗劑、毒素和毒液、病毒表位、激素、阿片劑、留體類、肽、酶底物、輔因子、藥物、血凝素、糖類、寡核苷酸、核酸、寡糖、蛋白質(zhì)等等。
本文所使用的術(shù)語“受體”在本文中指對配體具有親和性的部分。受體可以是天然存在的或人造的。它們可以其未改變的狀態(tài)或作為與其它物種的聚集體形式被使用。受體可共價地或非共價地、直接地或通過特異性結(jié)合物質(zhì)連接于結(jié)合構(gòu)件。受體的實例包括但不限于，抗體、細胞膜受體、與特異性抗原決定基具有反應性的單克隆抗體和抗血清、病毒、細胞、藥物、聚核苷酸、核酸、肽、輔因子、血凝素、糖類、多糖、細胞膜、細胞器等等。受體在本領(lǐng)域中有時被稱為抗配體。在本文使用術(shù)語受體時在含義上無差別。當兩個分子通過分子識別進行結(jié)合以形成復合體時，形成了“配體受體對”。磁性傳感器裝置目標磁性傳感器裝置是響應于與所述傳感器表面結(jié)合的磁性標記而產(chǎn)生電信號的裝置。目標磁性傳感器裝置包括但不限于磁阻傳感器裝置，包括巨磁阻(GMR)裝置。目標GMR裝置包括但不限于自旋閥檢測器，以及磁性隧道結(jié)(MTJ)檢測器。自旋閥檢測器在一些情況下，所述磁性傳感器是自旋閥檢測器。自旋閥檢測器是由非磁性層如銅間隔開的兩個鐵磁層的金屬多層薄膜結(jié)構(gòu)。一個鐵磁層稱為扎層，其磁化被釘扎于固定方向，而另一鐵磁層被稱為自由層，其磁化可在外加磁場下自由轉(zhuǎn)動。自旋閥的電阻取決于所述自由層的磁化對于所述扎層的磁化的相對取向。當所述兩個磁化方向平行時，所述電阻最低，當反向平行時，所述電阻最高。電阻的相對變化被稱為磁阻(MR)比率。在一些情況下，自旋閥的MR比率可在小磁場例如約IOOOe中達到高于約10%。因此，自旋閥可以用作檢測結(jié)合于所述傳感器表面的磁性標記的分子的感應元件。在某些實施方案中，自旋閥磁阻(MR)比率為約I %至約20%，諸如約3%至約15%，包括約5%至約12%。因此，在某些實施方案中，自旋閥可以以窄帶寬(即，約IHz或更低)或使用鎖定檢測(lock-in detection)對約IOnm大小的單一磁性標記物進行檢測。在這些情況下，通過狹化所述噪音帶寬甚至可為單納米顆粒檢測獲得充分的信噪比(SNR)。自旋閥檢測器可使用面內(nèi)模式實施(參見，例如Li等Appl.Phys. ,93卷(10)7557(2003))。在其它實施方案中，當在所述檢測系統(tǒng)中可檢測到AC擾動場(ticklingfield)導致的電磁干擾(EMI)時可使用垂直模式。所述EMI信號傾向于以所述AC擾動場的頻率f為中心，因此其可通過在頻率2f下進行的鎖定檢測而基本被消除或降低。此外，在一些情況下，可以使用2橋電路(2-bridge circuit)來基本去除殘余EMI?？梢允褂镁哂刑幱趦蓚€不同頻率下的AC調(diào)制傳感電流和AC擾動場的其它信號采集和處理方法(例如 S-JHan, H. Yu, B. Murmann, N. Pourmand 和 S. X. Wang, IEEE International Solid-StateCircuits Conference (ISSCC) Dig. Tech. Papers, San Francisco Marriott, CA, USA,2007年 2 月 11-15)。在某些實施方案中，除所述自旋閥自身的幾何特征和偏置磁場之外，來自所述自旋閥檢測器的由所述磁性標記物所引起的信號還依賴于所述磁性標記物和所述自旋閥的自由層之間的距離。由單磁性標記物產(chǎn)生的檢測器電壓信號隨著所述顆粒中心與所述自旋閥自由層的中平面之間的距離的增加而降低。在某些實施方案中，自旋閥的自由層位于扎層的頂部從而為磁性標記物的檢測提供便利，這是因為來自磁性顆粒的感應磁場隨著所述傳感器和該顆粒之間的距離而單調(diào)遞減。對包括保護所述自旋閥的保護層的厚度在內(nèi)的所述磁性標記物和所述自由層的頂面之間距離的最小化可以為磁性顆粒的檢測提供便利。在某些實施方案中，自旋閥傳感器可以包括在一個或多個檢測器表面上的鈍化層。在一些實施方案中，檢測器結(jié)合了鈍化薄(例如，60nm或更薄,諸如50nm或更薄,包括40nm或更薄、30nm或更薄、20nm或更薄或者IOnm或更薄)層(例如,在檢測器被用于具有50nm或更低的平均直徑的磁性納米顆粒標簽的實施方案中)。在某些實施方案中，可使用較大的微米尺度的磁性顆粒。在一些情況下，適用于本文公開的檢測器的鈍化薄層可具有介于約Inm與約IOnm之間的厚度,諸如介于約Inm與約5nm之間的厚度,包括介于約Inm與約3nm之間的厚度。在某些實施方案中，適用于本文公開的檢測器的鈍化薄層可具有介于約IOnm與約50nm之間的厚度，諸如介于約20nm與約40nm之間的厚度，包括介于約25nm與約35nm之間的厚度。鈍化層可包括但不限于，Ta、Au或它們的氧化物、它們的組合，等等。涉及自旋閥檢測器及它們的應用的方案的進一步細節(jié)被提供于美國專利公開號第2005/0100930號和第2009/0104707號；其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。磁性隧道結(jié)檢測器在某些實施方案中，所述磁性傳感器是磁性隧道結(jié)(MTJ)檢測器。MTJ檢測器以類似于自旋閥檢測器的方式構(gòu)建，區(qū)別在于磁性間隔層被替換成絕緣層(如，絕緣隧道阻擋層)如氧化鋁或MgO，通過該絕緣層所述感應電流垂直于薄膜平面流動。兩鐵磁電極之間的電子隧穿由兩鐵磁電極的相對磁化控制，即在其平行之時隧穿電流高并且在其反向平行時隧穿電流低。在某些實施方案中，MTJ檢測器包含底電極、布置在隧道阻擋層任一側(cè)的磁性多層以及頂電極。在一些情況下，MTJ檢測器具有超過200%的磁阻比率(S. Ikeda,J. Hayakawa, Y. M. Lee, F. Matsukura, Y. Ohno, T. Hanyu 和 H. Ohno, IEEE Transactions onElectron Devices，卷54，第5期，991-1001 (2007))和大裝置磁阻，其產(chǎn)生了較高的輸出電壓信號。在某些實施方案中，MTJ檢測器具有雙層頂電極。第一層可以是金屬層(如，金層)，其中該層可在某些情況下具有60nm或更低的厚度,諸如50nm或更低,包括40nm或更低、30nm或更低、20nm或更低或者IOnm或更低。第二層可以是導電金屬，例如銅、招、鈕、鈀合金、鈀氧化物、鉬、鉬合金、鉬氧化物、釕、釕合金、氧化釕、銀、銀合金、銀氧化物、錫、錫合金、錫氧化物、鈦、鈦合金、鈦氧化物、這些物質(zhì)的組合，等等。在一些情況下，第二層的孔略小于MTJ的大小。在某些實施方案中，所述傳感器被配置為在使用期間使結(jié)合的磁性標記物與所述自由磁性層的頂表面之間的距離介于5nm與IOOnm之間，諸如介于5nm與50nm之間，包括介于5nm與30nm之間，諸如介于5nm與20nm之間，包括介于5nm與IOnm之間。在一些情況下，這種布置為降低或基本防止頂電極中的電流聚集提供便利(參見，例如vande Veerdonk, R. J. M.等，Appl. Phys. Lett. ,71 :2839 (1997)),該現(xiàn)象可在僅使用薄金電極的情況下出現(xiàn)。 除所述感應電流垂直于所述薄膜平面流動之外，MTJ檢測器可與自旋閥檢測器類似地運行，以所述外加調(diào)制場的面內(nèi)模式或垂直模式均可。根據(jù)上文涉及自旋閥檢測器的討論，在某些實施方案中，外加調(diào)制場的垂直模式可被用于降低EMI，并且類似地，薄鈍化層也適用于MTJ檢測器。此外，MTJ檢測器上的薄金第一頂電極還可為電導、鈍化以及特定生物分子探針的吸附提供便利。在某些實施方案中，在相同的檢測器寬度和顆粒-檢測器距離下，MTJ檢測器可給出比自旋閥檢測器更大的信號。例如，對于具有0. 2iim乘0. 2iim結(jié)面積和IkOhm- u m2的電阻-面積乘積，以250%的MR在250mV的偏壓和Hb = 350e, Ht = IOOOe rms下運行的MTJ檢測器，來自直徑Ilnm的中心距離所述自由層面心為35nm的單Co納米顆粒的電壓信號可為約200 y V。在一些情況下，該電壓比類似大小的自旋閥檢測器的電壓高出一個或更多的數(shù)量級。涉及MTJ檢測器及它們的應用的方案的進一步細節(jié)被提供于美國專利公開號第 2005/0100930號和第2009/0104707號；其公開內(nèi)容以引用的方式并入本文。磁性傳感器裝置設置磁性傳感器裝置可具有多種不同的設置，例如對傳感器的設置，無論傳感器被設置用于分批還是穿流應用等等。同樣，提供所述裝置的磁性傳感器以與目標分子結(jié)合相互作用的結(jié)合構(gòu)件和磁性標記物的混合物任何設置均可被使用。因此，磁性傳感器裝置的設置可包括但不限于井設置(其中所述傳感器與諸如井這樣的液體盛容結(jié)構(gòu)的底部或壁連接)；穿流設置，例如，其中所述傳感器與具有流體輸入和輸出的液流池(flow cell)的壁連接；等等。在某些實施方案中，本發(fā)明的磁性傳感器裝置包含基板表面，其在所述基板表面上顯示兩種或更多種不同磁性傳感器。在某些實施方案中，所述磁性傳感器包含具有磁性傳感器陣列的基板表面?！瓣嚵小卑蓪ぶ穮^(qū)域例如空間可尋址區(qū)域的任何二維或基本上二維(以及三維)的布置。當在所述陣列上具有定位于特定預設位置(即，地址)的多個傳感器時，陣列是“可尋址的”。陣列特征(即，傳感器)可通過中間間隔而隔離。任意給定的基板可攜帶設置于所述基板前表面的一個、兩個、四個或更多個陣列。根據(jù)用途，任何或全部所述陣列可感應相同或彼此不同的目標并且各陣列可包含多個不同的磁性傳感器。陣列可包含一個或多個，包括兩個或更多個、四個或更多個、8個或更多個、10個或更多個、50個或更多個，或者100個或更多個、1000個或更多個、10，000個或更多個或者100，000個或更多個磁性傳感器。例如，64個磁性傳感器可被布置到8X8的陣列中。在某些實施方案中，所述磁性傳感器可被布置到陣列中，所述陣列具有IOcm2或更小的面積，或者5cm2或更小的面積，例如Icm2或更小的面積，包括50mm2或更小的面積、20mm2或更小的面積，諸如IOmm2或更小的面積，或者甚至更小的面積。例如，磁性傳感器可具有介于IOiimX IOiim與200 UmX 200 um之間的面積，包括IOOumX 100 u m或更低的面積，諸如_mX910iim或更低，例如50 ii mX50 ii m或更低。在某些實施方案中，磁性傳感器可包括多個線性磁阻段。例如，磁性傳感器可包括4個或更多個，例如8個或更多個，包括12個或更多個，或者16個或更多個，例如32個或更多個，例如64個或更多個，或者72個或更多個，或者128個或更多個線性磁阻段。所述磁阻段可各自寬度為IOOOnm或更低,例如寬度為750nm或更低,或者寬度為500nm或更低,例如寬度為250nm或更低。在一些情況下，所述磁阻段可各自厚度為50nm或更低，例如厚度為40nm或更低,包括厚度為30nm或更低,或者厚度為20nm或更低,例如厚度為IOnm或更低。所述磁阻段可各自長度為IOOOnm或更低，或者長度為750nm或更低，或者長度為500nm或更低，或者長度為250nm或更低,例如長度為IOOnm或更低,或者長度為50nm或更低。
所述磁阻段可以串聯(lián)方式連在一起，或者所述磁阻段可以并聯(lián)方式連在一起。在一些情況下，所述磁阻段以串聯(lián)和并聯(lián)的方式連接。在這些情況下，兩個或更多個磁阻段可以并聯(lián)方式連在一起，并且兩組或更多組這些并聯(lián)連接的磁阻段可以串聯(lián)方式連在一起。圖12中示出了包含以串聯(lián)和并聯(lián)方式連接的磁阻段的磁性傳感器的實例。在某些實施方案中，給定裝置的磁性傳感器中的至少一些或全部具有在與傳感器表面穩(wěn)定結(jié)合的結(jié)合對構(gòu)件。所述結(jié)合對構(gòu)件可根據(jù)所實施的特定分析的性質(zhì)而有所不同。同樣，所述結(jié)合對構(gòu)件可以是與目標分子結(jié)合相互作用中的分子特異性地結(jié)合的捕獲探針，或是參與目標分子結(jié)合相互作用的分子，例如與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子?！胺€(wěn)定結(jié)合”指的是在應用條件下所述結(jié)合對構(gòu)件和傳感器表面以超過瞬時的時間保持相對于彼此的空間位置，所述應用條件的例子如所述分析條件。同樣，所述結(jié)合對構(gòu)件和 傳感器表面可非共價或共價地彼此穩(wěn)定結(jié)合。非共價結(jié)合的實例包括非特異性吸附、基于靜電(如，離子、離子對相互作用)、疏水相互作用、氫鍵相互作用的結(jié)合、通過與所述支持物表面共價連接的特異性結(jié)合對構(gòu)件所進行的特異性結(jié)合，等等。共價結(jié)合的實例包括結(jié)合對構(gòu)件與存在于所述傳感器表面的官能團如-OH之間所形成的共價鍵，其中所述官能團可以是天然存在的或是作為被引入的連接群體中的一員而存在。因此，所述結(jié)合對構(gòu)件可被吸附、物理吸附、化學吸附或共價連接于所述磁性傳感器表面。在給定裝置包含兩個或更多個磁性傳感器的情況下，各傳感器可具有與其表面結(jié)合的相同或不同的結(jié)合對構(gòu)件。因此，這些裝置的傳感器表面可存在與所述磁性標記的分子結(jié)合的不同的捕獲探針或分子，從而使各個磁性傳感器特異性地結(jié)合于不同的分子。這類裝置還可包含不具有任何結(jié)合對構(gòu)件的傳感器(例如，在這些空白傳感器可作為參比或?qū)φ针娦盘杹碓吹那闆r下)。在多傳感器裝置中，所述磁性傳感器之間可存在不攜帶任何分析物特異性探針的區(qū)域。當這些傳感器間區(qū)域存在時，其可具有各種大小和設置。在一些情況下，這些傳感器間區(qū)域可被配置為降低或防止不同傳感器間的流體運動，例如在所述傳感器間區(qū)域包含疏水材料和/或流體屏障(諸如屏壁)的情況下。在某些實施方案中，所述裝置的基板，例如可攜帶不同傳感器的一個或多個陣列的基板，一般被成形為矩形固體(盡管可能是其它形狀)，其長度為Imm或更大和150mm或更小，諸如Imm或更大和IOOmm或更小，例如50mm或更小、IOmm或更??；寬度為Imm或更大和150mm或更小，諸如IOOmm或更小，包括50mm或更小，或者IOmm或更??；以及厚度為0. Olmm或更大和5. Omm或更小，例如0. Imm或更大和2mm或更小，包括0. 2mm或更大和
I.5mm或更小，例如0. 5mm或更大和I. 5mm或更小?？纱嬖陔娮油ㄓ嵲鐚щ婓w，其被配置為將傳感器與“芯片夕卜”組件電耦接，所述“芯片外”組件諸如裝置組件，例如處理器、顯示器，等等。根據(jù)下文更為詳盡的描述，給定的磁性傳感器裝置除如上文所述的傳感器結(jié)構(gòu)(如，陣列)外可包含多種組件。另外的裝置組件可包括但不限于，信號處理組件、數(shù)據(jù)顯示組件(如，圖形用戶界面)；數(shù)據(jù)輸入和輸出裝置、電源、流體處理組件等等。磁性標記物在所述方法的實施方案中，可使用任意便利的磁性標記物。磁性標記物是在與磁性傳感器充分結(jié)合時可通過所述磁性傳感器檢測出并且導致所述磁性傳感器輸出信號的標記部分。在標記物的中心與所述傳感器的表面之間的距離為200nm或更近，諸如IOOnm或更近，包括50nm或更近的情況下，目標磁性標記物可充分地結(jié)合于磁性傳感器在某些實施方案中，所述磁性標記物是納米顆粒。在特定實施方案的實施中有用的納米顆粒是磁性(如，鐵磁性)膠體材料和顆粒。所述磁性納米顆?？梢允浅槾鸥叽啪卮判约{米顆粒，或者包含兩層或更多層反鐵磁性偶聯(lián)的高磁矩鐵磁物的合成反鐵磁納米顆粒。這兩種類型的納米顆粒均在缺乏磁場的情況下表現(xiàn)出“非磁性”并且基本不聚團。根據(jù)某些實施方案，適用的可磁化納米顆粒包含一種或多種材料，例如但不限于，順磁、超順磁、鐵磁和亞鐵磁材料，以及它們的組合。在某些實施方案中，所述磁性納米顆粒(本文亦稱為磁性標簽)具有低殘磁以使其在溶液中不聚團。具有低殘磁的磁性納米顆粒的實例包括超順磁顆粒和反鐵磁顆粒。在某些情況下，所述磁性標簽在約IOOOe的磁場下具有可檢測的磁矩。在一些情況下，所述磁性標簽的大小與所述靶生物分子的大小是可比較的，從而使所述磁性標簽不干擾目標分子間的結(jié)合相互作用。在某些實施方案中，所述磁性標簽在形狀上是基本均一的并且在生物環(huán)境中具有化學穩(wěn)定性，其可輔助它們在分析條件下的應用。在一些情況下，所述磁性標簽是生物相容的，即水可溶并且經(jīng)功能化從而使它們易于結(jié)合于目標生物分子，例如特異性結(jié)合于靶分析物的受體。在某些實施方案中，所述磁性納米顆粒是高磁矩磁性納米顆粒，諸如Co、Fe或CoFe納米晶體，其在室溫下可以是超順磁的。所述磁性納米顆粒可通過化學方法進行制備，例如但不限于，適當溶液中的鹽還原或化合物分解。這些磁性納米顆粒的實例包括但不限于 S. Sun 和 C. B. Murray, J. Appl. Phys. ,85 :4325(1999) ；C. B. Murray 等，MRS Bulletin,26 985 (2001)；以及 S. Sun, H. Zeng, D. B. Robinson, S. Raoux, P. M. Rice, S. X. Wang 和 G. Li,J. Am. Chem. Soc. , 126, 273-279 (2004)所描述的納米顆粒。在某些實施方案中，所述磁性納米顆粒可以受控的大小(如，約5-12nm)被合成，具有單分散性并且使用油酸進行穩(wěn)定化。適用于本文的磁性納米顆粒包括但不限于，Co、Co合金、鐵氧體、氮化鈷、氧化鈷、Co-Pel、Co-Pt、鐵、鐵合金、Fe-Au, Fe-Cr, Fe-N, Fe304、Fe-Pd, Fe-Pt, Fe-Zr-Nb-B, Mn-N,Nd-Fe-B、Nd-Fe-B-Nb-Cu、Ni、Ni合金，等等。在一些實施方案中，金薄層被鍍在磁性核芯之上，或者聚L-賴氨酸包埋的玻璃表面可被連接于磁性核芯。適當?shù)募{米顆粒可購自，例如Nanoprobes, Inc. (Northbrook,IL)和 Reade Advanced Materials(Providence, RI)。在一些情況下，磁性納米標簽可通過物理方法而不是化學方法來制備(參見，例如 ff. Hu, R. J. Wilson, A. Koh, A. Fu, A. Z. Faranesh, C. M. Earhart, S. J. Osterfeld, S. -J. Han,L. Xu, S. Guccione, R. Sinclair 和 S. X. Wang,Advanced Materials,20,1479-1483(2008))，并且其適用于對待檢測的所述靶生物分子進行標記。所述磁性標簽可包含兩個或更多個鐵磁層，諸如FexCcvx,其中X介于0. 5與0. 7之間，或者如基于FexCcvx的合金。在一些情況下，F(xiàn)exCcvx具有24. 5k高斯的飽和磁化。這些鐵磁層可被非磁性間隔層所隔離，所述非磁性間隔層諸如Ru、Cr、Au或其合金。在某些情況下，所述間隔層包含以反鐵磁方式耦接的鐵磁層，從而使所產(chǎn)生的顆粒的凈殘磁為零或接近于零。在某些實施方案中，所述反鐵磁結(jié)合可通過RKKY交換相互作用(參見，例如S. S. P. Parkin等，Phys. Rev. Lett.,64(19) 2304(1990))和靜磁相互作用(J. C. Slonczewski 等，IEEE Trans. Magn. , 24(3)2045(1988))而實現(xiàn)。在一些情況下，所述反鐵磁耦合強度使得所述顆?？杀籌OOOe的外部磁場飽和(所有層的磁化變成平行)。在一些情況下，所述反鐵磁耦合強度依賴于所述間隔層的層厚和合金組成。在某些實施方案中，為促進所述納米顆粒的生物偶聯(lián)，金覆蓋(或功能類似物或等同材料的覆蓋)被層疊于反鐵磁材料層之上從而使所述納米顆粒可以通過金-巰基或其它便利的連接而被偶聯(lián)于生物分子。表面活性劑可被用于所述納米顆粒，從而使所述納米顆粒可以成為水溶性的。就化學穩(wěn)定性而言，所述納米顆粒的邊緣還可以用Au或其它惰性層鈍化。任何便利的方案均可被用于制備本文所述的納米顆粒。例如，所述納米顆粒的層可包括沉積在具有基本光滑表面的基板或釋放層上的納米尺度的鐵磁層和間隔層。在一些情況下，通過壓印(imprinting)、蝕刻、自組裝等等可形成遮蔽層(mask layer)。隨后,可將所述遮蔽層和其它的不需要的層去除并完全清除掉。隨后可去除所述釋放層，升出為所述遮蔽層的負像(negative image)的納米顆粒。所述顆?？呻S后與表面活性劑和生物分子接觸。在一些情況下，所述基板可在完全清除和進行化學機械拋光(CMP)后重復使用。在其它的實施方案中，所述納米顆?？梢允褂孟麥p制備法(substractivefabrication method)進行制備。在該情況下,所述層被直接沉積在釋放層之上并隨后沉積遮蔽層。通過所述遮蔽層蝕刻所述層并且最終從所述基板上釋放。這些納米顆粒產(chǎn)生于所述遮蔽層的正像(positive image),其與在所述添加制備法中情況相反。在某些實施方案中，適用于本發(fā)明的磁性納米顆粒的大小與目標分子結(jié)合相互作用的生物分子的大小是可比較的，從而使所述納米顆粒不干擾目標結(jié)合相互作用。因此，在一些實施方案中所述磁性納米顆粒的大小為亞微米尺度，例如介于5nm與250nm之間(平均直徑)，諸如介于5nm與150nm之間，包括介于5nm與20nm之間。例如，具有5nm、6nm、7nm、8nm、9nm、10nm、llnm、12nm、13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、25nm、30nm、35nm、40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、70nm、80nm、90nm、lOOnm、I10nm、120nm、130nm、140nm、150nm和300nm的平均直徑的磁性納米顆粒以及具有介于這些數(shù)值任意二者之間的平均直徑的納米顆粒適用于本文。此外，除球形外，適用于本文的磁性納米顆?？梢员怀尚螢槠瑺?、棒狀、線圈、纖維等等。在一些實施方案中，所述磁性標記物具膠體穩(wěn)定性，例如，納米顆粒組合物可以穩(wěn)定膠體的形式存在。膠體穩(wěn)定指的是所述納米顆粒被均勻分散于溶液之中從而使所述納米顆?；静痪蹐F。在某些實施方案中，為防止聚簇，所述納米顆粒在零外加場下可不具有凈磁矩(或具極小磁矩)。所有大小的反鐵磁顆粒在零場下均可具零磁矩。與之相反，對于鐵磁顆粒，其大小可低于“超順磁極限”，其在某些情況下是約20nm或更低，諸如約15nm或更低，包括約IOnm或更低。在某些實施方案中，可使用大晶圓(wafer)和標準真空薄膜沉積工藝而大量制備所述合成納米顆粒。例如，使用6英寸晶圓,假定各顆粒在所述晶圓上占據(jù)60nm乘60nm的方形的情況下，可在約5X IO12顆粒每次運行的速度下制備30-nm直徑的納米顆粒。、
在一些情況下，給定的目標結(jié)合相互作用的分子和磁性標記物被穩(wěn)定地結(jié)合于彼此?！胺€(wěn)定結(jié)合”指的是在應用條件如分析條件下所述生物分子和磁性標記物以超過瞬時的時間保持將相對于彼此的空間位置。同樣，所述生物分子和磁性標記物可非共價或共價地彼此穩(wěn)定結(jié)合。非共價結(jié)合的實例包括非特異性吸附、基于靜電(如，離子、離子對相互作用)、疏水相互作用、氫鍵相互作用的結(jié)合、通過與所述支持物表面共價連接的特異性結(jié)合對構(gòu)件所進行的特異性結(jié)合，等等。共價結(jié)合的實例包括所述生物分子與存在于所述標記物表面的功能基團如-OH之間所形成的共價鍵，其中所述功能基團可以是天然存在的或是以引入的連接基團的構(gòu)件的形式存在。分析混合物制備可使用任意數(shù)量的不同方案制造包含與分析混合物接觸的磁性傳感器的磁性傳感器裝置，所述分析混合物包含磁性標記的分子。例如，與所述磁性標記的分子特異性結(jié)合的第一種分子可被結(jié)合于所述傳感器表面的捕獲探針，并且隨后與磁性標記的分子(如，可被磁性標記的第二種分子)接觸。在這些情況下的方法可包括提供具有磁性傳感器的磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器展示出與所述第一種分子特異結(jié)合的捕獲探針，所述第一 種分析還與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合；并且隨后使所述磁性傳感器與所述第一種分子和所述磁性標記的分子接觸。所述接觸可包含依次地向所述磁性傳感器涂覆第一種分子，所述第一種分子與表面結(jié)合并且能夠與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合，并且隨后涂覆所述磁性標記的分子。或者，可以在與傳感器接觸之前將與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的第一種分子和所述磁性標記的分子合并以形成復合體，并且可使所產(chǎn)生的復合體與所述傳感器上的捕獲探針結(jié)合(如，在所述第一種分子和所述捕獲探針之間的結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學是研究目標的情況下)。在這些情況下，所述接觸包含制備反應混合物，所述混合物包含與所述磁性標記的分子特異性結(jié)合的第一種分子以及所述磁性標記的分子，并且隨后將所述反應混合物涂覆于所述磁性傳感器。在另一個實施方案中，與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的第一種分子被首先定位于所述傳感器上，并且隨后與磁性標記的第二種分子接觸。在這些情況下，所述方法包括提供具有磁性傳感器的磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器展示出所述第一種分子(無中間捕獲探針)，并且隨后使所述磁性傳感器與磁性標記的分子接觸。圖1(a)和1(b)提供了可分別被應用于對抗體/分析物相互作用和核酸雜交相互作用的結(jié)合動力學分析的分析方案的示意圖。在圖1(a)中，所用的方案是夾心分析方案，該方案中與GMR傳感器表面穩(wěn)定結(jié)合的捕獲抗體被結(jié)合于分析物，所述分析物隨后被結(jié)合于與磁性標簽相連接的檢測抗體。在圖1(b)中，所用的方案是DNA夾心分析，該方案中捕獲DNA被結(jié)合于GMR傳感器表面,IE DNA與所述捕獲DNA雜交,并且結(jié)合于磁性標簽的檢測DNA與所述靶DNA雜交。在制備根據(jù)圖1(a)和I (b)所示的方案的裝置中，所關(guān)注的可以是所述捕獲結(jié)合構(gòu)件(如，捕獲抗體或捕獲DNA)和所述靶構(gòu)件(如，分析物或靶DNA)之間的相互作用的結(jié)合動力學。在這些實施方案中，所述靶和標記的構(gòu)件被首先在結(jié)合條件下彼此接觸，并且所產(chǎn)生的復合體與所述傳感器表面接觸?；蛘?，在制備根據(jù)圖1(a)和1(b)所示的方案的裝置中，所關(guān)注的可以是標記的結(jié)合構(gòu)件(如，標記的抗體或標記的DNA)和所述靶構(gòu)件(如，分析物或靶DNA)之間的相互作用的結(jié)合動力學。在這些實施方案中，所述靶和捕獲構(gòu)件首先在結(jié)合條件下彼此接觸，并且所產(chǎn)生的結(jié)合于傳感器表面的復合體與標記的構(gòu)件接觸。上述接觸(包括涂覆)步驟在可發(fā)生目標結(jié)合相互作用的條件下進行。盡管接觸的溫度可有所變化，但在一些情況下所述溫度在TC至95°C的范圍，諸如5°C至60°C的范圍，并且包括20°C至40°C的范圍。所述分析的各種組分可存在與水性介質(zhì)中，所述介質(zhì)可包含或不包含其它的組分，諸如鹽、緩沖劑，等等。在一些情況下，接觸在嚴苛條件下進行。嚴苛條件特征可在于比所述探針靶二聯(lián)體的融解溫度低15°C至35°C如20°C至30°C的溫度范圍，所述融解溫度取決于多種參數(shù)，例如，溫度、緩沖組合物、探針和靶的大小、探針和靶的濃度，等等。同樣地，所述雜交的溫度可在約55°C至70°C的范圍，通常在約60°C至68°C的范圍。在變性劑存在的情況下，所述溫度可在約35°C至約45°C的范圍，通常在37°C至42°C 的范圍。嚴苛雜交條件特征可在于存在雜交緩沖液，其中所述緩沖液特征在于以下的特征中的一個或多個(a)具有高鹽濃度，如3至6XSSC(或具有類似濃度的其它鹽類)；(b)去污劑的存在，諸如 SDS (0. I M 20% )、TritonX 100(0. 01 至 1% )、monidet NP40 (0. 01 至5% )等等；(c)其它添加劑，如EDTA (如，0. I至I PM)、四甲基氯化銨；(d)加速劑，如PEG、硫酸葡聚糖(5至10% )、CTAB、SDS等等；(e)變性劑，如甲酰胺、脲等；等等。嚴苛條件是在其中嚴苛性與上文所述的特定條件至少相同的條件。與傳感器表面接觸的樣品可以是簡單樣品或復雜樣品?！皢螛悠贰敝傅氖前鼋Y(jié)合相互作用的一個或多個構(gòu)件的樣品并且除所述溶劑之外的其它分子種類即使有也是少數(shù)的?！皬碗s樣品”指的是包含目標結(jié)合相互作用的一個或多個構(gòu)件并且還包含眾多不感興趣的不同蛋白質(zhì)或其它分子的樣品。在某些實施方案中，所述復雜樣品是血樣，其為血液或其級分，例如血清。在某些實施方案中，所述復雜樣品是血清樣品。在某些實施方案中，在本發(fā)明的方法中進行分析的復雜樣品是包含10種或更多種，諸如20種或更多種，包括100種或更多種，例如IO3種或更多種、IO4種或更多種(諸如15，000種；20，000種甚或25，000種或更多)相區(qū)分的(即，不同的)分子實體的復合樣品，所述分子實體在分子結(jié)構(gòu)方面相互不同。從所述磁性傳感器中獲取實時信號在制備包含與分析混合物(所述分析混合物包含目標結(jié)合相互作用的結(jié)合構(gòu)件和磁性標記物，例如根據(jù)上文所述)接觸的磁性傳感器的裝置之后，所述方法的方面包括通過所述磁性傳感器獲取實時信號。同樣地，某些實施方案包括通過所述裝置獲取實時信號。因此，可觀測到與目標結(jié)合相互作用的發(fā)生相關(guān)聯(lián)的信號的實時演化。所述實時信號由給定的目標時間期間所獲得的兩個或更多個數(shù)據(jù)點組成，其中在某些實施方案中所獲得的信號是在給定的目標時間期間連續(xù)地獲得的數(shù)據(jù)點的連續(xù)集合(例如，以軌跡的形式)。目標時間期間可變動，其在一些情況下在I秒至10小時的范圍，諸如在10秒至I小時的范圍并且包括I分鐘至15分鐘的范圍。所述信號中的數(shù)據(jù)點的數(shù)量也可變動，其中在一些情況下，數(shù)據(jù)點的數(shù)量足以在所述實時信號的時間段上提供數(shù)據(jù)的連續(xù)延伸(continuousstretch)。在一些實施方案中，當所述分析系統(tǒng)處于所述“濕”條件下時觀測所述信號，即，在包含分析成分(例如，所述結(jié)合構(gòu)件和磁性標記物)的溶液仍處于與所述傳感器表面的接觸的情況下。由此，無須洗去全部非結(jié)合或無關(guān)分子。該“濕”檢測是可行的，這是因為所述磁性標簽納米顆粒(例如,如本文它處所述的具有150nm或更小的直徑)所產(chǎn)生的磁場隨著與所述納米顆粒的距離的增加而迅速降低。因此，與所捕獲的結(jié)合構(gòu)件結(jié)合的標記物的傳感器處的磁場超過了來自溶液中的未結(jié)合的磁性標記物的磁場，所述非結(jié)合磁性標記物不僅與所述檢測器的距離較遠而且處于布朗運動之中。本文所使用的術(shù)語“鄰近檢測”指的是所結(jié)合的納米顆粒的傳感器的主導性。根據(jù)所述“鄰近檢測”設計，處于所述傳感器表面的特異結(jié)合的磁性標記的偶聯(lián)物可在不洗去溶液中的非特異磁性納米標簽的情況下被定量。對于給定的目標結(jié)合相互作用，分析可包含獲得單結(jié)合對構(gòu)件濃度或多個結(jié)合對濃度的實時信號，諸如2個或更多個、3個或更多個、5個或更多個、10個或更多個、100個或更多個、甚或1，000個或更多個不同的濃度。根據(jù)需要，給定的分析可使具有相同捕獲探針濃度的相同傳感器與多個不同的結(jié)合對構(gòu)件濃度接觸，或以相反的方式進行接觸，或以捕獲探針和結(jié)合對構(gòu)件的不同濃度組合進行接觸。 通過所述實時信號定量確定結(jié)合動力學參數(shù)根據(jù)上文所總結(jié)，在獲得所述實時信號之后，所述方法可包括通過所述實時信號定量確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。換言之，所述實時信號被用于定量確定所述目標結(jié)合動力學參數(shù)，從而目標結(jié)合動力學參數(shù)獲得自所述實時信號。在一些情況下，所述目標結(jié)合動力學參數(shù)通過使用擬合算法處理所述實時信號而進行定量確定。擬合算法指的是一套法則，其通過將方程與實時信號或獲自給定分析信號擬合，所述給定分析例如上文所述分析，從而確定目標結(jié)合動力學參數(shù)。可使用任意便利的擬合算法。在一些實施方案中，二室模型被用于擬合所述實時數(shù)據(jù)。所關(guān)注的二室模型假定溶液中的磁性標記的結(jié)合分子通過傳輸過程(擴散或流動)接近表面結(jié)合的結(jié)合配對物如被捕獲的第一種生物分子，并且隨后通過結(jié)合和解離的化學過程與表面結(jié)合的結(jié)合配對物結(jié)合。在這些情況下，模型中的二室是主體區(qū)室和表面區(qū)室。圖2提供了一些實施方案中使用的二室反應-擴散模型的示意圖，其中標記的分子(以標記的抗體演示)通過傳輸過程向所述傳感器表面移動并且隨后通過結(jié)合流動而結(jié)合和釋放。在一些情況下，磁性標記分子的濃度被假定在各個區(qū)室中是均一的并且僅僅處于所述表面區(qū)室(Cs)中的磁性標記的分子將與所述傳感器表面的結(jié)合位點反應并且處于所述主體區(qū)室(Ctl)中的磁性標記的分子將向所述表面進行擴散。在一些情況下，所使用的二室模型并不假定發(fā)生“快速混合”。該系統(tǒng)的支配方程寫作
權(quán)利要求
1.一種定量地測定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的方法，所述方法包括 制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器包含與分析混合物接觸的磁性傳感器，所述分析混合物包含磁性標記的分子以產(chǎn)生可檢測的分子結(jié)合相互作用； 從所述磁性傳感器中獲取實時信號；以及 由所述實時信號定量確定所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)CO、解離速率常數(shù)(kd)與擴散限制速率常數(shù)(kM)中的至少一個。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述磁性傳感器包含特異地與所述磁性標記的分子結(jié)合的分子，并且所述接觸包括將所述磁性標記的分子涂覆于所述磁性傳感器。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述磁性傳感器包含捕獲探針，所述捕獲探針特異地結(jié)合于與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸包括將與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子和所述磁性標記的分子相繼地涂覆于所述磁性傳感器。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述磁性傳感器包含捕獲探針，所述捕獲探針特異地結(jié)合于與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子，并且所述接觸擴制備包含與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子和所述磁性標記的分子的反應混合物，并且隨后將所述反應混合物涂覆于所述磁性傳感器。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述分子結(jié)合相互作用選自核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用和蛋白質(zhì)-核酸相互作用。
7.一種定量測定兩種或更多種不同分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的方法，其中各個不同分子結(jié)合相互作用包括不同的磁性標記的分子，所述方法包括 制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器裝置包含兩個或更多個不同的磁性傳感器，各個磁性傳感器與包含磁性標記的分子的分析混合物從而產(chǎn)生兩種或更多種不同的分子結(jié)合相互作用； 從各磁性傳感器中獲取實時信號；以及 由所述實時信號定量確定所述兩種或更多種不同的分子結(jié)合相互作用中每一種的結(jié)合動力學參數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述結(jié)合動力學參數(shù)是結(jié)合速率常數(shù)(ka)、解離速率常數(shù)(kd)與擴散限制速率常數(shù)(kM)中的至少一個。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中所述結(jié)合相互作用選自核酸雜交相互作用、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用、受體-配體相互作用、酶-底物相互作用和蛋白質(zhì)-核酸相互作用。
10.一種磁性傳感器裝置，其包含 被配置為檢測磁性標記的分子的磁性傳感器；以及 被配置為從所述磁性傳感器中獲得實時信號并且由所述實時信號定量確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的處理器。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的磁性傳感器裝置，其中所述結(jié)合動力學參數(shù)是所述分子結(jié)合相互作用的結(jié)合速率常數(shù)CO、解離速率常數(shù)(kd)與擴散限制速率常數(shù)(kM)中的至少一個。
12.根據(jù)權(quán)利要求10所述的磁性傳感器裝置，其中所述磁性傳感器包含以串聯(lián)和并聯(lián)相連的四個或更多個感應區(qū)域。
13.根據(jù)權(quán)利要求10所述的磁性傳感器裝置，其中所述裝置包含1000個或更多個不同的磁性傳感器。
14.根據(jù)權(quán)利要求10所述的磁性傳感器裝置，其中所述裝置進一步包含所述磁性標記的分子和與所述磁性標記的分子特異地結(jié)合的分子。
15.—種試劑盒，其包含 (a)磁性標記物；和 (b)以下組成中的至少一種 (i)計算機可讀的媒介，其上儲存有計算機程序，當計算機執(zhí)行所述程序時，所述程序操控計算機由獲自磁性傳感器的實時信號定量地確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)；以及 (ii)具有用于獲得所述計算機程序的地址的物理基板。
全文摘要
本發(fā)明提供了定量地測定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)的方法。本方法的實施方案的方面包括制備磁性傳感器裝置，所述磁性傳感器裝置包含與分析混合物接觸的磁性傳感器，所述分析混合物包含磁性標記的分子以產(chǎn)生可檢測的分子結(jié)合相互作用；從所述磁性傳感器中獲取實時信號；以及由所述實時信號定量確定分子結(jié)合相互作用的結(jié)合動力學參數(shù)。還提供了被配置為用于所述方法的系統(tǒng)和試劑盒。
文檔編號G01N33/53GK102652259SQ201180004836
公開日2012年8月29日 申請日期2011年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月12日
發(fā)明者徐亮, 漢述仁, 王善祥, 理查德·S·加斯特, 羅伯特·威爾遜 申請人:小利蘭·斯坦福大學托管委員會