專利名稱：一次性芯片型流動室與利用其的細胞分選儀的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種流式細胞儀等具有生物粒子分析功能的裝置或細胞分選儀等具有流動室分離功能的裝置，用該裝置實現(xiàn)新功能的測定方法，以及一次性流動室芯片。
背景技術：
流式細胞儀通常被廣泛用于鑒別各種類型的細胞及生物學粒子?，F(xiàn)有的流式細胞儀通常采用石英制成，具有光學上透明的流動室，所述流動室形成有流道，以使能夠形成通過其并應被一個一個地識別的細胞流。該流道中流動的細胞流利用同心包圍該細胞流的鞘液，從而集中于流道的中央部流動。該流道的中央部被激光束照射，細胞通過該照射區(qū)域時，產(chǎn)生依賴于細胞大小、形狀、折射率的光散射。該激光的波長通過與熒光色素種類的配合來決定，以用來用熒光檢測由熒光色素進行特異性染色的細胞。像這樣，通過對每個細胞，除散射光之外，還利用多個光檢測器按照不同波長檢測熒光，從而能夠以多個角度分析 細胞。上述流式細胞儀的技術記載于專利文獻I中。并且，關于平板狀的流動室記載于特開平第2003-302330 (專利文獻10)及美國專利第7105355號(專利文獻11)中。利用一次性芯片的流式細胞儀記載于專利第4358888號(專利文獻14)中。下面對細胞分選方法的公知實例進行敘述。美國專利第3710933號(專利文獻I)及美國專利第3826364號(專利文獻2)中記載的方法為現(xiàn)有一般產(chǎn)品中所用的分離方法，從用于形成液滴的噴嘴中將樣品液作為液滴向空氣中吐出，通過電場，將包含分離對象細胞的液滴以液滴單位進行分離的方法。特開昭第64-3541(專利文獻3)公開了如下方法使鞘流在流動室中流動的樣品液的周圍流動，通過對樣品液施加電場，從而使帶電的粒子從樣品流向鞘流的方向移動，并分離檢測。特開平1-170853號(專利文獻4)中記載了如下方法對在流動室中流動的粒子施加壓力脈沖，將粒子分離到流動室內(nèi)非平穩(wěn)流動的流道中。國際公開號為W098/10267號(專利文獻5 )中公開了如下技術對在流動室中周圍被鞘流擠壓流動的微粒施加場，使微粒流發(fā)生偏移并進行分離。國際公開號為W02004/101731號(專利文獻6)中公開了如下方法利用設置于流動室中流道兩側(cè)的凝膠電極，將液體中帶電的細胞用電場進行分離。美國專利第6808075號(專利文獻7)中公開了如下方式通過垂直形成彎液面的氣泡閥來對粒子流施加壓力脈沖，使流發(fā)生偏移并分離。W02006/076195號(專利文獻8)公開了一種以水滴單位射出并回收到容器中的方法，所述水滴單位含有以同專利文獻5 —樣施加物理沖擊脈沖為目的的粒子。美國專利第4756427號(專利文獻9)中記載了如下方法測定被鞘流擠壓的樣品液流中的粒子，在判斷為目標微粒的情況下，利用壓電原件，通過脈沖流將其導入到其它流道，進行分離。專利文獻12中記載的細胞分離方法，其是通過在油內(nèi)形成含有細胞的液滴并使其流動，從而通過靜電場，使力作用于含有目標細胞的液滴的方法。專利文獻13中采取了以下方法在流動室中的流道上形成細胞分選用的支流道，利用壓電原件產(chǎn)生脈沖流，將所需的細胞引入到分選流道中?，F(xiàn)有技術文獻
專利文獻專利文獻I :美 國專利第3710933號專利文獻2 :美國專利第3826364號專利文獻3 :特開昭64-3541號公報專利文獻4 :特開平1-170853號公報專利文獻5 :國際公開號W098/10267專利文獻6 :國際公開號W02004/101731專利文獻7 :美國專利第6808075號專利文獻8 :國際公開號TO2006/076195專利文獻9 :美國專利第4756427號專利文獻10 :特開平2003-302330號公報專利文獻11 :美國專利第7105355號專利文獻12 W02009/021215專利文獻13 :特開昭61-137062號公報專利文獻14 :專利4358888

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術問題(I.送液系統(tǒng)的問題)現(xiàn)有的細胞分選儀，其送液系統(tǒng)存在生物危害方面的問題。即，這是因為其為以下結(jié)構(gòu)，發(fā)生外部異物向測量樣品內(nèi)的混入及測量樣品向外部擴散。即，不能簡單地更換試樣液的貯液室、送液泵及具有流動室的送液系統(tǒng)，現(xiàn)有的流式細胞儀，為了降低殘留，在每次測量不同的樣品時必須進行洗凈。將粒子分離功能附加到流式細胞儀上，這種細胞分選儀也同樣存在這一問題。作為解決該問題的方法之一，是使流動室能夠一次性使用。為了能夠做成一次性的，流動室適合使用如載玻片那樣的平板狀結(jié)構(gòu)。即，因為該結(jié)構(gòu)能夠通過射出成型等容易地形成流道樣式，且能夠廉價批量生產(chǎn)。在使用平板狀流動室的情況下，適合使用將照射激光從表面垂直入射的方法。但是，在檢測向平板面內(nèi)側(cè)方向的散射光即側(cè)方散射光方面存在問題。檢測側(cè)方散射光的意義在于獲得細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)的信息，對于通常的流式細胞儀來說是必須具備的功能。通常的流式細胞儀的流動室，其流動室的橫截面一般為正方形，對檢測與激光照射方向垂直的方向的散射光沒有問題，且可與前方散射光同時檢測。但是，使用平板型流動室的情況下，由于側(cè)方散射光的方向上存在流動室基板，因此流動室的平板結(jié)構(gòu)本身成為測量的障礙。作為解決這一問題的方法，專利文獻11記載有以下方法。在流動室的流道側(cè)面設置光纖，將流道內(nèi)發(fā)出的光導出至光檢測器。但是，這種情況下，由于光纖連接到流動室，因此不適合每次檢測都更換流動室，因此不能適用于一次性用途的流動室。作為本發(fā)明人之前的發(fā)明，專利文獻14的利用一次性芯片型流動室的流式細胞儀中，不包括檢測側(cè)方散射光的功能。(2.流動室的問題)此外，如果不能以廉價制備流動室，則難以成為一次性產(chǎn)品。為了以廉價制備，用透明樹脂制備為宜。但是，樹脂在波長小于500nm的短波長區(qū)域，存在很小的光吸收帶并發(fā)出熒光，因此成為檢測的背景噪聲。即，適合一次性的由透明樹脂制備的流動室的情況下，本身的熒光成為檢測的障礙。(3.細胞分離方法的問題)對細胞分選的問題進行敘述。作為第一問題，存在生物危害對策方面的問題。專利文獻I或?qū)＠墨I2中所述的利用噴嘴來吐出液滴，通過電場，將包含分離對象細胞的液滴以液滴單位進行分離的方法(噴氣方式)，在生物危害對策方面存在問題。即，樣品為被病原性病毒或細菌污染的細胞的情況下，具有將非常危險的物質(zhì)作為氣溶膠擴散到大氣中的風險。作為解決第一問題的方法，考慮了將氣溶膠密閉在流動室內(nèi)，而不使其擴散到大氣中，在此狀態(tài)下進行分離的方法。作為這種方法，公開有以下幾種技術。專利文獻3公開了一種鞘流在流動池中流動的樣品液的周圍流動，通過對樣品液施加電場，利用電場使帶電粒子從樣品流向鞘流方向移動來進行分離檢測的方法。專利文獻4公開了一種對在流動室中流動的粒子，施加由壓電原件產(chǎn)生的壓力脈沖，將粒子分離到流動室中的非平 穩(wěn)流動的流道的方法，但是，在該方法中，為了避免分離的粒子返回原流道，需要形成空氣穩(wěn)流等，存在控制復雜的問題。專利文獻5中公開了一種使鞘流在流動室內(nèi)流動的樣品液的周圍流動，擠壓樣品液流，對樣品液中的微粒施加電場或磁場等場，從而使微粒流發(fā)生偏移來進行分離的技術。在該方法中，使用電場作為場的情況下，相當于上述專利文獻3中的內(nèi)容。這種利用電場的方法，與專利文獻6中的方法相同，即使采用一些方法來防止因電分解產(chǎn)生氣泡，細胞所具有的電荷也會被周圍電解質(zhì)中所含的離子屏蔽，降低作用于粒子的力，因此對于電解質(zhì)中的分離并不實用。專利文獻7中公開了一種在芯片內(nèi)的細胞分離技術。其是通過從側(cè)面的壓力使一個微粒流偏移，并在下游進行分離的方法。但是，為了施加壓力，需要彎液面的往返運動，由于在來回往返中會產(chǎn)生逆方向流，因此，需要在等到粒子足夠遠后將彎液面位置回復到原位置。專利文獻8公開了如下方法，其同專利文獻4 一樣，通過施加物理沖擊脈沖,將包含目標細胞的區(qū)域以水滴單位射出，并回收到容器中。上述內(nèi)容在一次性流動室芯片內(nèi)不能實現(xiàn)，存在與其它樣品間的污染。專利文獻9的方法不適用于一次性芯片。專利文獻12的方法，其是通過在油內(nèi)形成包含細胞的液滴并流動，對包含目標細胞的帶電液滴作用靜電力，從而進行分離的方法。這種情況下，具有以下優(yōu)點，在油內(nèi)不存在屏蔽靜電力的離子，但是在高粘性的油中，在分選比細胞大的液滴時，具有速度慢的缺點。如專利文獻13記載的那樣，利用壓電原件產(chǎn)生脈沖流使細胞分離到支流道中的方法，該方法的流動室與壓電的連接也沒有以一次性作為前提。如果將壓電原件組裝到流動室的情況下，流動室的價格會變得昂貴，因此不適用于一次性芯片。(4.應對多個待測樣品的流式細胞儀的問題)下面，對應對多個待測樣品的流式細胞儀的問題進行敘述。通常的流式細胞儀采用以下方法作為應對多個待測樣品的方法將96孔板自動放置在XYZ載置臺上，并依次進行檢測。這種方法，由于輪流使用送液系統(tǒng)，因此會產(chǎn)生殘留及待測樣品間的交叉污染。因此想到了在形成多個流道的芯片中，以低廉的運營成本，在短時間內(nèi)檢測多個待測樣品的方法。這種情況下，如上所述的那樣，側(cè)方散射光的檢測成為難點。在形成多個流道的情況下，如專利文獻11中所記載的方法那樣，想到了將光纖插入流道的側(cè)面，通過光纖將信號光導入檢測器中，檢測側(cè)方散射的方法，但是包含光纖的一次性芯片并不實用。(5.利用一次性芯片檢測準確濃度的問題)
下面，在利用一次性芯片的檢測中，對測量樣品的準確濃度進行檢測的情況下的問題進行敘述。由于細胞因重力而沉降，樣品液的細胞濃度，有底面附近的密度隨時間增大的現(xiàn)象。盡管存在這種現(xiàn) 象但為了檢測準確濃度，需要檢測全部的樣品液。這種情況下存在以下問題例如，作為已知例的專利文獻14中所記載的芯片，當放入樣品液進行檢測時，在樣品液剛消失時，會產(chǎn)生氣泡，在細胞的檢測數(shù)據(jù)中會混入氣泡數(shù)據(jù)。這種氣泡的產(chǎn)生，成為檢測細胞的準確個數(shù)的障礙。(6.數(shù)據(jù)分析的問題)下面，對流式細胞儀的數(shù)據(jù)分析方面的問題進行敘述。流式細胞儀的多色分析一般進行熒光校正。但是，在該熒光校正中，從分布于檢測波長不同的多個檢測器間的多個信號強度中，每個熒光標簽校正一個信號強度，因此在測量前需要使用測定用樣品進行裝置調(diào)節(jié)。因此，測定用樣品為了獲得測常數(shù)據(jù)和調(diào)節(jié)裝置，需要僅熒光色的數(shù)量并單獨進行染色的樣品。并且，熒光檢測器至少需要三個以上，即，具有三種以上顏色。在這種狀況下，可以用二維圖表顯示二維數(shù)據(jù)，但在現(xiàn)有的流式細胞儀中存在三維數(shù)據(jù)的分析和顯示方面的問題。即，用多個二維顯示或可旋轉(zhuǎn)顯示的三維顯示來進行，不能實現(xiàn)可立即理解的顯示。解決技術問題的技術手段本發(fā)明鑒于上述情況，提供一種使用以下一次性芯片型的流動室來分析識別生物粒子并進行分離的裝置，以及一次性流動室。[I] 一種粒子分離裝置，其具有流動室，在平板基板內(nèi)形成流道；光照射裝置，對流經(jīng)上述流道的樣品液中的微粒照射光；檢測裝置，檢測在照射上述光時由上述微粒產(chǎn)生的散射光或熒光，基于它們的信號強度對上述微粒進行識別，檢測目標微粒；定壓泵以及與定壓泵連接的電磁閥，上述定壓泵對在上述流動室的上述流道中流動的上述樣品液中的上述微粒施加壓力脈沖；以及，控制部，基于來自上述檢測裝置的信號，控制上述電磁閥的動作，其特征在于，上述流動室具有上述樣品液的導入用流道以及設置在其兩側(cè)的一對鞘液導入用流道、合流流道、光照射區(qū)域以及一對對置的分支流道；上述合流流道，是上述一對鞘液導入用流道合流到所述樣品液的導入用流道而成，在該合流流道內(nèi)，鞘液夾著上述樣品液，在其兩側(cè)流動；上述光照射區(qū)域位于上述合流流道上；上述一對對置的分支流道，在與上述光照射區(qū)域相比的下游處連接到上述合流流道上；在上述一對對置的分支流道中的一個流道上連接通常為關閉狀態(tài)的第一電磁閥和負壓的定壓泵；在上述一對對置的分支流道中的另一個流道上連接通常為關閉狀態(tài)的第二電磁閥與正壓的定壓泵；上述檢測裝置對上述微粒通過上述光照射區(qū)域時所產(chǎn)生的光信號進行檢測；上述控制部基于來自上述檢測裝置的上述光信號，判斷上述微粒是否為應分離的目標微粒，在判斷為是應分離的目標微粒的情況下，在該微粒通過與上述一對對置的分支流道連接的上述合流流道區(qū)域中，對上述第一及第二電磁閥提供只是短時間作為開啟狀態(tài)的信號，對從上述對置的一對分支流道通過上述區(qū)域中的上述目標微粒施加推(PUSH)及拉(PULL)的壓力，由此改變上述目標微粒流，從而分離上述目標微粒。[2]如上述[I]中記載的微粒分離裝置，其特征在于，上述控制部，在判斷上述微粒為應分離的目標微粒的情況下，在該微粒通過上述一對對置的分支流道所連接的所述合流流道區(qū)域中，對上述第電磁閥提供只是短時間作為開啟狀態(tài)的信號；據(jù)此，對存在于上述對置的分支流道間的上述合流流道的上述區(qū)域中的上述目標微粒，施加推及拉的壓力，由此改變上述目標微粒流，將上述目標微粒收入“拉”側(cè)的上述分支流道，從而分離上述目標微粒。[3]如上述[I]中記載的微粒分離裝置，其特征在于， 上述流動室還具有一對追加的分支流道，其在比與上述一對對置的分支流道連接的上述合流流道區(qū)域更下游處，從上述合流流道上分支；上述控制部，在判斷上述微粒為應分離的目標微粒的情況下，在該微粒通過最初的上述一對分支流道相對且與上述最初的分支流道連接的上述合流流道的上述區(qū)域中，對上述電磁閥提供只是短時間作為開啟狀態(tài)的信號，據(jù)此，對存在于上述對置的上述最初的分支流道間的上述合流流道的上述區(qū)域中的上述目標微粒施加推及拉的壓力，改變上述目標微粒流，將上述目標微粒分離到下游的上述追加分支流路中。[4] 一種平板狀的流動室裝置，其用于在流道內(nèi)流動樣品液的狀態(tài)下，分離包含在樣品液中的微粒，上述流動室的結(jié)構(gòu)如下在透明基板中形成有流道，在上述流道的上游側(cè)與下游側(cè)的基板上部分別形成有與上述流道進行流體連接(fluidly connected)的忙液室，其特征在于，上述流動室具有形成于透明基板上的上述樣品液的導入用流道和設置在其兩側(cè)的一對鞘液導入用流道、合流流道以及對置的一對分支流道；上述合流流道，是上述樣品液的導入用流道與設置在其兩側(cè)的上述一對鞘液導入用流道合流而成的，上述鞘液夾著上述樣品液，在其兩側(cè)流動；上述一對對置的分支流道，其連接在上述合流流道的側(cè)面；上述一對對置的分支流道具有能夠與外部泵氣密連接的端口。[5] 一種應對多個待測樣品的流式細胞儀，其用于將包含生物粒子的樣品液在流動室中的流道內(nèi)流動的狀態(tài)下，對樣品液照射光，檢測由包含在樣品液中的樣品粒子所產(chǎn)生的光，其特征在于，其具有載置臺，載置流動室；光照射裝置；檢測裝置，檢測上述生物粒子；以及，控制部，控制上述各部的動作，上述流動室為平板狀，在透明的平板基板上形成有多個樣品液貯液室及多個鞘液貯液室、多個廢液貯液室及多個回收樣品液貯液室，以及與這些貯液室分別流體連接的多個流道；各上述樣品液貯液室在各上述鞘液貯液室內(nèi)隔開形成，以避免各自液體相混合；各上述樣品液液室上連接有各樣品液用流道；各上述鞘液貯液室上連接有一對鞘液用流道；各上述樣品液流道的側(cè)面上連接有上述一對鞘液用流道；通過在各上述樣品液流道上連接上述一對鞘液用流道，從而形成從上述樣品液流的左右合流鞘流的流道，合流后的流道以平行的等間距形成，最下游連接到形成于流動室 上的上述廢液貯液室及上述回收樣品貯液室上；在多個上述流道的每一個上，利用使只能照射一個流道大小的光束依次以步進重復(step and repeat)方式照射光或流動室移動,來檢測多個樣品。[6]如[5]中記載的應對多個待測樣品的流式細胞儀，其特征在于，通過使上述流動室的上述透明平板基板的上述流道側(cè)面方向的兩端傾斜，從而使從各上述流道內(nèi)產(chǎn)生的側(cè)方散射光在兩端全反射，并進行檢測。[7] 一種流式細胞儀，其特征在于，其具有照射光源和熒光測定裝置，上述熒光測定裝置的結(jié)構(gòu)為檢測多個波長區(qū)域的熒光；在分析包含多個熒光分子的細胞時，具有將由光照射產(chǎn)生的波長不同的兩種熒光強度的比，對每個細胞導出分布并進行顯示的功能；還具有根據(jù)其值來評價包含在細胞中的多個熒光分子的豐度的功能。[8] 一種檢測液體中微粒的裝置，其特征在于，其具有流動室，在平板基板內(nèi)形成流道；照射光源，其在流動室中將樣品液中的微粒與鞘液一起在上述流道中流動的狀態(tài)下，對樣品液中的微粒照射光；檢測裝置，檢測在照射上述光時由上述微粒產(chǎn)生的散射光或熒光，基于它們的信號強度對上述微粒進行識別，檢測目標微粒；以及，控制、分析部，控制上述各部，基于來自上述檢測裝置的信息，分析上述微粒；利用表示在上述樣品液完全流完的時刻所產(chǎn)生的氣泡的信號，通過探測上述樣品液檢測的終點，對包含在全部上述樣品液中的粒子數(shù)進行定量。[9] 一種生物粒子分析裝置，其特征在于，其具有照射光源和光測定裝置，上述光測定裝置的結(jié)構(gòu)為在多個波長區(qū)域中檢測通過光照射而由每個粒子產(chǎn)生的光；上述生物粒子分析裝置具有以下功能，對每個粒子，利用與粒子的測定項目相對應的多個信號強度間的運算來求出指數(shù)，基于該指數(shù)的值來分析粒子特性。[10]如上述[9]中記載的生物粒子分析裝置，其特征在于，其具有運算裝置，上述運算裝置在對同時使用透過細胞膜的染色劑與不透過細胞膜的染色劑染色的細胞或細菌進行存活判斷的測定分析的情況下，將由光照射產(chǎn)生的波長不同的兩種熒光信號強度的比作為指數(shù)，基于該指數(shù)的值，判定是死細胞還是活細胞。[11] 一種生物粒子分析裝置，其特征在于，其具有照射光源和光測定裝置，上述光測定裝置的結(jié)構(gòu)為在多個波長區(qū)域檢測通過光照射而由每個微粒產(chǎn)生的光，對每個粒子，導出用多個信號強度間的運算式定義的指數(shù)，能夠選擇該指數(shù)作為數(shù)據(jù)顯示圖表的軸。
發(fā)明效果根據(jù)本發(fā)明，能夠滿足無殘留及無交叉污染的條件，實現(xiàn)I)細胞分選儀、2)能夠檢測側(cè)方散射光的流式細胞儀、3)準確檢測細胞密度、4)不需要熒光校正的多重染色分析等。


圖1A)為表示在流道內(nèi)通過脈沖流進行細胞分選的情況下的問題的附圖。B)為表示根據(jù)本發(fā)明解決上述問題的原理的附圖。 圖2a)為表不本發(fā)明的細胞分選儀的一個例子的附圖，表不電磁閥關閉(OFF)的狀態(tài)。b)為表示本發(fā)明的細胞分選儀的一個例子的附圖，表示電磁閥開啟(ON)的狀態(tài)。圖3a)為表示本發(fā)明的細胞分選儀的第二實施方式的附圖，表示電磁閥關閉的狀態(tài)。b)為表示本發(fā)明的細胞分選儀的第二實施方式的附圖，表示電磁閥開啟的狀態(tài)。圖4為表示使用本發(fā)明的一次性芯片型流動室且用于進行細胞分離的流動室結(jié)構(gòu)、電磁閥及定壓泵的附圖。圖5為表示使用本發(fā)明的一次性芯片型流動室且用于進行細胞分離的流動室、光學系統(tǒng)及控制系統(tǒng)的附圖。圖6為表示本發(fā)明的一次性芯片型的應對多個待測樣品的流動室的結(jié)構(gòu)的示意圖。圖7為表示使用本發(fā)明的一次性芯片型的應對多個待測樣品的流動室的側(cè)方散射檢測光學系統(tǒng)的附圖。圖8為表示使用本發(fā)明的一次性芯片型的應對多個待測樣品的流動室的側(cè)方散射檢測光學系統(tǒng)與芯片移動之間的關系的附圖。圖9為表示在使用本發(fā)明的一次性芯片型流動室的流式細胞儀中，能夠去除在檢測全部樣品液時產(chǎn)生的氣泡所帶來的影響的附圖。圖IOa)為表示熒光光譜與兩個熒光檢測波長區(qū)域(FL1、FL2)的附圖。b)為模擬表示用FLl與FL2的散布圖上的兩種熒光試劑分子進行標簽的粒子分布的附圖。圖11為表示根據(jù)本發(fā)明的二重染色細胞的分析方法的附圖。以縱軸為FL1/FL2的對數(shù)比來表示(A)圖表中的數(shù)據(jù)時，成為(B)圖表。圖12為對現(xiàn)有細胞的存活判定分析方法進行說明的附圖。圖13為表示將本發(fā)明的多重染色分析方法應用于細胞的存活判定分析中的例子的結(jié)果示意圖。圖14為基于本發(fā)明的根據(jù)指數(shù)來判定存活的多維信息顯示例。圖15為基于本發(fā)明的根據(jù)指數(shù)的其它多維信息顯示例。
具體實施例方式I.粒子分離裝置本發(fā)明的一個實施方式提供一種微粒分離裝置。該粒子分離裝置典型地具有i)流動室，在平板基板內(nèi)形成流道；ii)光照射裝置，對在上述流道中流動的樣品液中的微粒照射光；iii)檢測裝置，檢測在照射光時由粒子產(chǎn)生的散射光或熒光，基于它們的信號強度對上述微粒進行識別，檢測目標微粒；iv)定壓泵以及與其連接的電磁閥，上述定壓泵用于對在上述流動室的流道中流動的樣品液中的微粒施加壓力脈沖；V)控制部，基于來自檢測裝置的信號，控制電磁閥的動作；典型地，上述流動室具有a)樣品液導入用流道和設置在其兩側(cè)的一對鞘液導入用流道；b)合流流道，使上述一對鞘液導入用流道合流到樣品液導入用流道而成(在合流流道內(nèi)，鞘液夾著上述樣品液，在其兩側(cè)流動);c)光照射區(qū)域，位于上述合流流道上； d) 一對對置的分支流道，在與光照射區(qū)域相比的下游處，(幾乎成直角地)連接于上述合流流道上。典型地，在上述一對對置的分支流道的一個流道上連接通常為關閉狀態(tài)的第一電磁閥和負壓的定壓泵；在上述一對對置的分支流道的另一個流道上連接通常為關閉狀態(tài)的第二電磁閥和正壓的定壓泵。典型地，上述檢測裝置對上述粒子通過光照射區(qū)域時所產(chǎn)生的光信號進行檢測。典型地，上述控制部基于來自上述檢測裝置的上述光信號，判斷上述微粒是否為應分離的目標微粒，如果判斷為是應分離的目標微粒的情況下，在該微粒通過與上述一對對置的分支流道連接的上述合流流道的區(qū)域中，對上述第一及第二電磁閥提供僅短時間呈開啟狀態(tài)的信號，對從上述對置的一對分支流道通過上述區(qū)域的上述目標微粒施加推(PUSH)及拉(PULL)的壓力。這樣一來，通過改變上述目標微粒流，從而能夠?qū)⒛繕宋⒘钠渌⒘Ｖ蟹蛛x出來?；蛘咭部梢允?，在本發(fā)明的微粒分離裝置中，上述控制部，在判斷上述微粒為應分離的目標微粒的情況下，在該微粒通過與上述一對對置的分支流道連接的合流流道區(qū)域中，對上述電磁閥提供只是短時間作為開啟狀態(tài)的信號；據(jù)此，對存在于上述對置的分支流道間的合流流道區(qū)域中的目標微粒施加推及拉的壓力，改變上述目標微粒流，將目標微粒收入“拉”側(cè)的分支流道。本發(fā)明的微粒分離裝置，其流動室還可以具有一對追加的分支流道，所述一對追加的分支流道是在與一對對置的分支流道連接的合流流道區(qū)域相比更下游處，從合流流道分支出的。并且，利用上述控制部判斷微粒為應分離的目標微粒的情況下，在該微粒通過最初一對分支流道相對且最初的分支流道連接的合流流道的上述區(qū)域中，對上述電磁閥提供只是短時間作為開啟狀態(tài)的信號，據(jù)此，對存在于對置的最初的分支流道間的合流流道區(qū)域中的目標微粒施加推及拉的壓力，改變目標微粒流，將目標微粒分離到下游的追加的分支流路中，從而能夠分離微粒。2.平板狀流動室裝置在本發(fā)明的其它實施方式中，提供一種平板狀的流動室裝置，其用于在將樣品液在流道內(nèi)流動的狀態(tài)，分離包含在樣品液中的微粒。該流動室裝置，典型地具有如下結(jié)構(gòu)在透明基板中形成有流道，在該流道的上游側(cè)與下游側(cè)的基板上分別形成與上述流道進行流體連接(fluidly connected)的忙液室。更具體地，該流動室裝置，其具有形成于透明基板上的
i)樣品液導入用流道和設置在其兩側(cè)的一對鞘液導入用流道；ii)合流流道，是上述樣品液的導入用流道與設置在其兩側(cè)的上述一對鞘液導入用流道合流而成，鞘液夾著上述樣品液，在其兩側(cè)流動；iii)對置的一對分支流道，(幾乎成直角地)連接于上述合流流道的側(cè)面。iv)上述一對分支流道具有能夠與外部泵進行氣密連接的端口。流動室結(jié)構(gòu)還可以是具有一對追加的分支流道，所述一對追加的分支流道是在與上述分支流道連接的上述合流流道區(qū)域相比更下游處，從上述合流流道分支出的。3.應對多個待測樣品的流式細胞儀。在本發(fā)明的再一個實施方式中，提供一種應對多個待測樣品的流式細胞儀，其用于將包含生物粒子的樣品液在流動室的流道內(nèi)流動的狀態(tài)下，對樣品液照射光，檢測由包含在樣品液中的樣品粒子所產(chǎn)生的光。該流式細胞儀典型地具有
·
Ii)載置臺，載置流動室；ii)光照射裝置；iii)檢測裝置，檢測生物粒子；iv)控制部，控制上述各部的動作。上述流動室也可以是平板狀。進一步地，上述流動室也可以在透明的平板基板上形成有多個樣品液貯液室及多個鞘液貯液室、多個廢液貯液室及多個回收樣品液貯液室，以及與這些貯液室分別流體連接的多個流道。進一步地，各上述樣品液貯液室也可以在各上述鞘液貯液室內(nèi)隔開形成，以避免各自液體相混合。進一步地，各上述樣品液貯液室上也可以連接各樣品液用流道；進一步地，各上述鞘液貯液室上也可以連接一對鞘液用流道。進一步地，各上述樣品液流道的側(cè)面上也可以連接上述一對鞘液用流道。也可以采用以下結(jié)構(gòu)，通過在各樣品液流道上連接上述一對鞘液用流道，從而形成從上述樣品液流的左右合流鞘流的流道，合流后的流道以平行的等間距形成，最下游連接到形成于流動室上的上述廢液貯液室及上述回收樣品貯液室上。根據(jù)本發(fā)明的應對多個待測樣品的流式細胞儀，在多個上述流道的每一個上，利用使只能照射一個流道大小的光束依次以步進重復(step and repeat)方式照射光或流動室移動，來檢測多個樣品。在本發(fā)明的應對多個待測樣品的流式細胞儀中，也可以通過使上述流動室的上述透明平板基板的上述流道側(cè)面方向的兩端傾斜，從而使從各上述流道內(nèi)產(chǎn)生的側(cè)方散射光在兩端全反射，并導入檢測系統(tǒng)進行檢測。4.其它流式細胞儀在本發(fā)明的另一個實施方式中，提供一種流式細胞儀，其特征在于，在分析包含多個熒光分子的細胞時，具有如下功能將由光照射產(chǎn)生的波長不同的兩種熒光強度的比，對每個細胞顯示分布；根據(jù)其值來評價包含在細胞中的多個熒光分子的豐度。此外，在另一個實施方式中，提供一種生物粒子分析裝置，其特征在于，在對同時使用透過細胞膜的染色劑與不透過細胞膜的染色劑染色的細胞或細菌進行評價時，對于由激光照射產(chǎn)生的波長不同的兩種熒光信號強度的比，根據(jù)其相對于之前設定的基準值的大小關系，來判定是死細胞還是活細胞。這些流式細胞儀或生物粒子分析裝置，典型地至少具有激光照射光源和熒光測定裝置，所述熒光測定裝置的構(gòu)成為檢測多個波長區(qū)域的熒光。下面，參照附圖，對本發(fā)明的更具體的實施方式進行說明，但本發(fā)明的范圍并不限定于這些實施方式。I)細胞分離方法及裝置。使用圖I詳細說明實現(xiàn)一次性芯片內(nèi)的細胞分離的本發(fā)明的細胞分離方法及裝置。圖I (A)圖示了在從細胞分選流道100施加壓力的情況下，該壓力引起的液流，所述細胞分選流道100為在側(cè)面連接到細胞流動的主流道上。在與流道中的壓力相比足夠低的負壓的情況下，液流被拉入(“拉(PULL)”狀態(tài))。在與流道中的壓力相比足夠高的情況下，液流被推出(“推(PUSH)”狀態(tài))。目標細胞在主流道中流動并橫穿分選流道的瞬間，施加拉或推的壓力時，僅移動目標細胞是不可能的。即，在利用壓力僅將特定的細胞分離到分離流道的情況下，由于力會波及到大范圍的液體，使分離的空間分辨率變差。
作為解決上述問題的方法，如圖I (B)中所示，在主流道的側(cè)面對置設置用于推和用于拉的分選流道，通常，主流道和分選流道之間不存在液流，但僅在應分離的目標細胞通過對置區(qū)域內(nèi)的時間，產(chǎn)生推的壓力和拉的壓力。這種情況下，使推的流量與拉的流量幾乎相同，將來自分選流道的壓力影響主流道流體的區(qū)域大致限定在分選流道寬度上。該方法如圖2所示。在圖2中，包含細胞的樣品溶液在形成于流動室內(nèi)的流道I中流動，不包含細胞的鞘液在流道2中流動，通過合流，樣品液以擰細的狀態(tài)流動。在該樣品流動的流道的側(cè)面對置連接有兩個分支流道4-1、4-2。流道4-1為用于拉的流道，流道4-2為用于推的流道。在流道4-1上連接有儲存目標細胞的貯液室5、電磁閥7-1及氣缸泵8-1。氣缸泵8-1保持與流道I相比足夠低的一定的壓力，另一方面，在推的流道上連接有電磁閥7-2與氣缸泵8-2。氣缸泵8-2保持與流道I相比足夠高的一定的壓力。包含在樣品液中的細胞通過激光照射區(qū)域3時，由細胞產(chǎn)生散射光及熒光。用光檢測器檢測上述光，對其信號強度進行定量化，并與預先設定的所需細胞的信號條件進行比較。通過信號處理線路判定該細胞是否為所需細胞，如果是所需細胞的情況下，在該細胞通過分支流道的時間里，產(chǎn)生觸發(fā)信號，根據(jù)該觸發(fā)信號，使電磁閥7-1與7-2僅短時間呈開啟狀態(tài)。在開啟狀態(tài)期間，從流道4-2向主流道提供與從主流道向分支流道4-1流入的流量相同的流量，從而限定流道4-1與流道4-2之間的分選流，防止細胞分離的空間分辨率比流道4-1的寬度差。在上述方式中，作為產(chǎn)生脈沖壓力的方法，通過連接定壓泵與電磁閥，來獨立控制分選力與分選產(chǎn)生時間長短。由于定壓泵不產(chǎn)生氣溶膠，因此適合用于生物危害。圖3為基于推&拉的流速比流道27的流速慢，不能夠放入分選貯液室5的情況下進行分離的方法。圖3a)表示電磁閥為關閉(OFF)的情況。在下游側(cè)與流道1、2對稱地形成流道11、23、24。為了達到在層流上的流體力學效果，鞘液分離到流道23、24中，樣品液I回收至流道11。圖3b)表示電磁閥開啟(ON)的情況。這種情況下，目標細胞因來自分選流道4-1、4-2的壓力而產(chǎn)生的液流中，位置稍微從流道4-1偏移，并在流道27中流動。在下游側(cè)，通過該偏移，目標細胞分離到流道23中。根據(jù)需要，為了避免細胞或細菌流入電磁閥，設置過濾器，從而能夠起到防止由流動室外部向流道內(nèi)混入細菌或細胞，防止樣品向流動室外部散失的作用。下面，使用圖4及圖5，對實現(xiàn)一次性芯片內(nèi)的細胞分離的實施方式進行說明。
圖4表不在一次性芯片型流動室上連接氣缸泵和電磁閥的狀態(tài)。一次性芯片的結(jié)構(gòu)是在作為現(xiàn)有發(fā)明的專利文獻14中記載的基礎上，對稱增加了圖2所示的分選用流道4-1和流道4-2和各自的分選貯液室5-1、5-2。一次性芯片型流動室用透明樹脂制成。作為樹脂的種類，可以使用聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、環(huán)烯烴共聚物(C0C)、甲基戊烯聚合物等。尤其在使用波長為350nm至410nm左右的UV波長區(qū)域的激光作為照射光源的情況下，作為流動室的原料適合使用甲基戊烯聚合物。作為將分選貯液室也設置在流道4-2上的對稱結(jié)構(gòu)，連接電磁閥與氣缸泵。對稱結(jié)構(gòu)是為了在電磁閥開啟時，在同一時間，將相同的壓力施加到流道27上。
圖5進一步表示了光學系統(tǒng)與控制系統(tǒng)電路間的連接關系。芯片的截面圖為圖4的BB截面。如圖4所示，通過對芯片的上游側(cè)施加氣壓，樣品液與鞘液同時流入流道27，對比對置的分選流道4-1、4-2的區(qū)域稍上游的主流道的中央部照射激光52。細胞在通過該照射區(qū)域的瞬間，以脈沖形式產(chǎn)生散射光和突光。散射光根據(jù)二向色鏡(dichroic mirror)54和帶通濾波器57，選擇與照射激光相同的波長，用檢測器61檢測。在檢測器61的前面設置遮光板60，消除激光透射光。熒光根據(jù)二向色鏡55、56與帶通濾波器58、59，用比照射激光長的波長，分割成多個波長區(qū)域，分別用不同的檢測器62、63檢測。各檢測脈沖信號擴增并利用AD轉(zhuǎn)換電路64數(shù)字化，利用微型計算機69判斷多個檢測信號是否滿足預先設定的分離條件，在滿足的情況下，在一定延遲時間后，將觸發(fā)信號輸出到電磁閥驅(qū)動66。將該延遲時間調(diào)整為細胞從激光照射區(qū)域流到分選流道4-1、4-2的區(qū)域為止的時間。收到觸發(fā)信號的電磁閥驅(qū)動66,向電磁閥7-1、7_2輸出僅開啟一定時間的信號。將流道4-1和流道4-2的寬度設為相等的W，將細胞流經(jīng)流道27的流速設為V，則閥為開啟狀態(tài)的時間長短優(yōu)選設定為W/V (秒)。電磁閥開啟時，目標細胞流入分選貯液室5。主流道與分選流道之間的液流，在閥7-1與閥7-2為關閉狀態(tài)下不發(fā)生，因此一旦收入分選貯液室5中的目標細胞在該處中被穩(wěn)定地保存。如圖4所示，在芯片上游側(cè)的貯液室20的內(nèi)部，雖然圖中沒有示出，但其通過定壓泵施加了一定的氣壓。貯液室20的內(nèi)部具有樣品液貯液室10，在其內(nèi)側(cè)加入樣品液，在其外側(cè)加入鞘液。作為鞘液，優(yōu)選使用磷酸鹽緩沖液(PBS)。利用共通的氣壓，樣品液I與其左右的鞘液2向下游流動，待3條流道合流后，以樣品液被鞘液擰細的狀態(tài)在流道27中流動。流道27的寬度為80 μ m，深度為50 μ m。合流后的樣品液寬度約為流道寬度的1/10。流道27具有從側(cè)面對置的流道4-1、4-2，該流道與貯液室5連接。將波長為488nm的激光52照射到比該對置區(qū)域更上游側(cè)僅數(shù)百μ m處的流道27的中央部。上述光束大小為長度為50 μ m、寬度為20 μ m的橢圓。細胞在通過該照射區(qū)域的瞬間，以脈沖形式產(chǎn)生散射光和熒光。散射光利用二向色鏡54和帶通濾波器57，選擇與照射激光相同的波長，用檢測器61檢測。在檢測器61的前面設置遮光板60，消除激光透射光。熒光利用二向色鏡55、56和帶通濾波器58、59，用比照射激光長的波長，分割成多個波長區(qū)域，分別用不同的檢測器62、63檢測。各檢測脈沖信號擴增并利用AD轉(zhuǎn)換電路64數(shù)字化，利用微型計算機69判斷多個檢測信號是否滿足預先設定的分離條件，在滿足的情況下，在一定延遲時間后，將觸發(fā)信號輸出到電磁閥驅(qū)動66。使該延遲時間與細胞從激光照射區(qū)域流到分選流道4-1、4-2的區(qū)域為止的時間相同。收到觸發(fā)信號的電磁閥驅(qū)動66,向電磁閥7-1、7_2輸出僅開啟一定時間的信號。將流道4-1和4-2的區(qū)域設為相等的W，將細胞流經(jīng)流道27的流速設為V，則閥為開啟狀態(tài)的時間長短優(yōu)選設定為W/V (秒)。電磁閥開啟時，目標細胞進入分選貯液室5-1。主流道與分選流道之間的液流，在閥7-1與閥7-2為關閉狀態(tài)下不發(fā)生，因此一旦進入分選貯液室5-1中的目標細胞在該處被穩(wěn)定保存。此外，如圖4所示的流動室，由于其下游側(cè)形成有分離流道11、23、24，目標細胞根據(jù)由分選流道4-1和4-2導致的壓力，移動量不足以進入分選貯液室5-1的情況下，在下游側(cè)向流道23中分離。因此，如圖4所示的流動室的結(jié)構(gòu)為，在流道27的流速快的情況下，向流道23分離，在流速慢的情況下，對于分離到分選貯液室5-1中的流速，實現(xiàn)兩階段邊際寬的分離。2)作為解決一次性芯片應對多個待測樣品方面的側(cè)方散射檢測問題的方法的本發(fā)明的細胞分離方法及裝置下面，使用圖6和圖7，對使用一次性芯片型多流道流動室的流式細胞儀的實施例進行說明。為了在無污染及殘留為零的條件下檢測多個待測樣品，如圖6所示，在一個芯片上形成8條樣品流道，分別連接樣品液貯液室31。為了避免在貯液室30中混合而分隔成的 8個小室37為鞘液貯液室。在各小室內(nèi)設置樣品液貯液室。各小室具有兩個鞘液貯液室與鞘液流道連接的端口。鞘液流和樣品液流，其通過按照順序?qū)Ω餍∈沂┘託鈮?，來控制連接到各個小室的樣品液與鞘液的液流，通過僅對進行測定的樣品液流入的小室施加壓力，從而消除因樣品液或鞘液的不必要的液流而產(chǎn)生的消耗。流道截面的大小與圖4的流道截面大小相同。測量時的壓力設定為從IOkPa至20kPa之間的值，除了測量時以外的壓力，設定為與下游部相同的大氣壓。在各個小室的內(nèi)部共通的氣壓施加到鞘液與樣品液上，向下游側(cè)擠出。鞘液由鞘液端口 32與基板內(nèi)流道連接，與樣品液從左右合流而流到下游側(cè)。圖7表示該芯片的截面圖與測定光學系統(tǒng)。測定光學系統(tǒng)中利用透鏡51的檢測光學系統(tǒng)幾乎與圖5相同，但增加了對流道進行圖像觀察的光學系統(tǒng)。其為1%反射鏡、成像用透鏡81和相機82。包含激光的照射光學系統(tǒng)與檢測光學系統(tǒng)為固定狀態(tài)，采取移動搭載了芯片的自動載置臺來對8條流道進行測定的方式。在8條流道的芯片中，由于是通過射出成型制備的，因此從制備上流道間的限制來看，將8條份的移動距離設為5mm。載置臺的移動，通過圖像識別將激光的照射位置調(diào)節(jié)到第一端的Nol流道上。然后，用一定壓力對與Nol流道連接的上游貯液室加壓，僅使樣品液在Nol流道中流動，開始檢測。Nol流道的檢測結(jié)束后，向連接于Nol上的上游貯液室的加壓設為0，使其為大氣壓。然后移動載置臺，使激光照射位置調(diào)節(jié)到No2流道上，對連接在No2流道上的貯液室加壓，開始檢測。直至NoS流道依次重復上述操作。測定中的側(cè)方散射光，將平面基板的端面在約為45度的斜面上向下反射，入射到設置于下側(cè)的由透明樹脂形成的導光塊45上，經(jīng)由連接在導光塊上的光纖，利用帶通濾波器43，用光檢測器44僅檢測與照射激光相同波長的光。在兩端的導光塊集光后檢測得到的側(cè)方散射信號，進行求和檢測。圖7表示兩端的測定散射光用兩個檢測器進行檢測，變?yōu)樾盘柡髾z測總和的方法。與此相對，也可以使連接在兩端導光塊上的光纖接合到一個檢測器上進行檢測。導光塊45的寬度，由于在8條流道的芯片中，需要比8條份的移動距離大，因此設定為10mm。如上所述，實現(xiàn)了以下裝置，在一次性芯片型的8流道芯片中，用一個芯片連續(xù)檢測8個待測樣品的前方散射、側(cè)方散射和多個熒光信號檢測。如圖6所示，在一個透明的平面基板上形成有多個流道，連接在上游側(cè)貯液室30與下游側(cè)貯液室34上。為了避免貯液室在各流道間樣品液相混合，貯液室為每個流道隔開的結(jié)構(gòu)。圖7表示該芯片的截面圖與測定光學系統(tǒng)。測定光學系統(tǒng)中利用透鏡51的檢測光學系統(tǒng)幾乎與圖5相同，但增加了對流道進行圖像觀察的光學系統(tǒng)。其為1%反射鏡、成像用透鏡81與相機82。在此，通過圖像識別來掌握流道與激光照射位置的關系，反饋給載置臺的移動，從而能夠自動調(diào)節(jié)激光位置與流道的位置。激光與檢測光學系統(tǒng)為固定狀態(tài)，在自動載置臺上，通過步進重復掃描依次照射芯片的各流道的中心區(qū)域。側(cè)方散射光將平面基板的端面在約為45度的斜面上向下反射，入射到設置于下側(cè)的由透明樹脂形成的導光塊45上，經(jīng)由連接在導光塊上的光纖，利用帶通濾波器43，僅透射與照射激光相同波長的光，并用光檢測器44檢測。圖8a)表示多個流道中，激光照射左端的流道中心的情況下，芯片與兩端導光塊間的位置關系。圖8b)表示多個流道中，激光照射右端的流道中心的情況下，芯片與兩端導光塊間的位置關系。將導光塊的掃描方向的寬度設為比掃描范圍的距離大的值，以使在任何情況下，在兩端反射的側(cè)方散射光均入射到導光塊上。進一步地，將在兩端導光塊上集光檢測到的側(cè)方散射信號進行加法運算，從而降低檢測到的側(cè)方散射光的檢測靈敏度對各流道的依賴性。作為求和的方法，也可以將連接于兩端導光塊上的光纖直接接合到一個檢測器 上。3)作為準確檢測測定樣品液中所包含的粒子濃度的方法的本發(fā)明的細胞分離方法及裝置下面，使用圖6與圖9，對準確檢測溶液中粒子濃度的方法的實施例進行說明。為了準確測定濃度，對投入到樣品液貯液室中的樣品液量全部進行檢測，用計數(shù)的細胞除以液量。因此，采取以下方法，在包含氣泡的狀態(tài)下測定樣品液的總量，測定后將氣泡從數(shù)據(jù) 中去除，從而準確檢測細胞濃度。圖6中的樣品液貯液室31的容量為100 μ L。因此，將包含細胞的50 μ L樣品液加入樣品液貯液室31中，測定時間設為6分鐘，流量設為10 μ L/min。于是，約5分鐘時樣品液消失，約I分鐘為包含氣泡的檢測。圖9a)為測定被稱為MCF-7的來自乳癌的細胞，但由于測定了樣品液整體而含有氣泡。氣泡是在樣品液消失后，被樣品貯液室擠壓的空氣在流道內(nèi)形成的，并通過測定區(qū)域，使檢測數(shù)增大。比細胞大的分布(前方散射信號FS大)在樣品溶液消失后,產(chǎn)生圖9a)的A分布。測定后，從測常數(shù)據(jù)中去除檢測時刻后的數(shù)據(jù)時，可知能夠在保留細胞分布或細胞以外的異物的狀態(tài)下去除A分布。這是由于A分布為在測量的后半段，來自于樣品液消失時刻之后所產(chǎn)生的氣泡的分布。進一步地，能夠判斷與A分布一同被去除的分布為來自氣泡的分布。在一次性芯片中，流道連接于樣品液液室的下側(cè)。在樣品液液室中加入100微升，檢測全部的該樣品液，設定粒子的計數(shù)為10000個，則應該能夠?qū)С隽Ｗ拥臐舛葹?00000個/毫升。但是，這在現(xiàn)有方法中是不可能的。即，從樣品液消失后，馬上以高頻率產(chǎn)生表示與粒子不同分布的氣泡，該氣泡分布成為對粒子計數(shù)的障礙。在通常的流式細胞儀中，由于一般是從上方在樣品液容器中吸出樣品液的方式，因此不進行樣品液總量的檢測，也不能進行。因此，為了用一次性芯片來準確檢測濃度，下面對不受氣泡影響的檢測樣品液總量的方法進行敘述。由于氣泡是在樣品液消失之后產(chǎn)生，因此將檢測時間從最后數(shù)據(jù)起按時間回溯，從檢測到的數(shù)據(jù)中去除，從而能夠獲得去除了氣泡分布的僅為粒子的數(shù)據(jù)。用作為本發(fā)明人的發(fā)明的專利文獻14中記載的芯片檢測全部樣品液而獲得的，包含氣泡分布的數(shù)據(jù)如圖9a)所示。橫軸為前方散射，縱軸為熒光信號強度。圖9b)為從全部數(shù)據(jù)中去除后部分檢測時間的數(shù)據(jù)。可知前方散射光強度大的分布已被去除。關注來自該氣泡的分布中的一個分布，若從檢測的最后開始去除數(shù)據(jù)，直至該分布消失為止，則能夠去除氣泡。由此，能夠測定全部樣品液，能夠求出準確的粒子濃度。4)流式細胞儀的多維數(shù)據(jù)分析方法及其顯示方法和裝置。圖10 (A)表不兩種突光檢測信號FL1、FL2的波長區(qū)域與兩種突光分子A、B的光譜。在將細胞用A和B兩種熒光分子進行熒光染色的情況下，對利用FLl和FL2的熒光信號求出細胞內(nèi)的A分子與B分子的豐度的方法進行說明。熒光檢測信號FLl與FL2之間，存在由熒光光譜的形狀規(guī)定的關系。其為比例一定的關系。例如，熒光光譜A的FLl的檢測波長區(qū)域的面積設為Al，F(xiàn)L2的檢測波長區(qū)域的面積設為A2，則FLl與FL2的檢測信號強度比為A1/A2。即，用數(shù)學式表達如下。FL1/FL2=A1/A2(I) 若變形為對數(shù)圖表，則為LogFLl=LogFL2+Log(A1/A2)(2)同樣地，熒光光譜B的情況下的FL1/FL2，其信號強度比為B1/B2。即，F(xiàn)L1/FL2=B1/B2(3)若變形為對數(shù)圖表，則為LogFLl=LogFL2+Log(B1/B2)(4)因此，在檢測用熒光分子A進行了熒光染色的細胞的情況下，F(xiàn)Ll與FL2的對數(shù)軸的散布圖，為如圖10 (B)中黑圈所示的線性分布。同樣地，在用熒光分子A進行了熒光染色的細胞的情況下，為白圈所示的線性分布。這樣一來，在散布圖中，熒光光譜不同的粒子，其縱軸的截距值分布于不同的直線上。下面，考慮熒光分子A與熒光分子B兩者均存在的情況。將各自的數(shù)分別設為X和1，則信號強度FLl與FL2如下式5和式6所示。FLl=Alx+Bly(5)FL2=A2x+B2y(6)根據(jù)式5和式6得出下式。LogFLl=LogFL2+Log[(Alx+Bly)/(A2x+B2y)] (7)如圖11 (A)所示，該式表示存在于式2與式3所示的兩條直線間的直線，根據(jù)x和y的比例，其位置會改變。取式5與式6的比，進行變形，則從FL1/FL2求出x/y，得到下式。x/y=[(B1/B2)-(FL1/FL2)]/[(FL1/FL2)-(A1/A2)](B2/A2) (8)式8的右邊第一項，B1/B2為用100%B進行染色的樣品數(shù)據(jù)求得的常數(shù)，A1/A2為用100%A進行染色的樣品數(shù)據(jù)求得的常數(shù)，F(xiàn)L1/FL2為樣品的測定數(shù)據(jù)。第2項，是以相同分子數(shù)的A和B分別進行染色的樣品的FL2比例求得的常數(shù)。因此，對于每個檢測出的細胞，能夠求出x/y的值。如圖11 (B)所示，將縱軸表示為FL1/FL2的對數(shù)比例，則該軸的值為依賴于x/y的分布。作為圖11 (B)的橫軸，通過采用表示細胞大小的前方散射信號強度(FS),能夠同時表不x/y信息與細胞大小信息。橫軸也可以取FS意外的信號。本發(fā)明中，如該FL1/FL2那樣，將成為分析重要的量的數(shù)據(jù)作為分析的指數(shù)(index)，表示為圖表的軸，從而實現(xiàn)將多維信息匯總成一維信息并進行表示，以及通過對該指數(shù)設定閾值來實現(xiàn)定量判定。下面，對上述數(shù)據(jù)分析的實施例進行說明。圖12中表示在使用透過生物膜的核染色劑SYT09和不透過生物膜的核染色劑PI兩種核染色劑并分析存活判定的情況下的現(xiàn)有分析方法。與此相對，本發(fā)明定義了用于存活判定的指數(shù)，以用該指數(shù)設定的閾值為基礎自動進行存活判定。用圖12和圖13對該方法進行說明。FLl的波長區(qū)域約為500nm至550nm，F(xiàn)L2的波長區(qū)域為570nm至610nm。如圖12的分布所示， 現(xiàn)有的存活(LIVE) &死亡(DEAD)分析區(qū)分為存活分布(僅用SYT09染色的分布)與死亡分布(用SYT09與PI兩者進行染色的分布)。這種區(qū)分方法依賴于人的圖像識別。因此，本發(fā)明中，為了自動判定存活和死亡，制作了定量指數(shù)，在該指數(shù)上設定判定的閾值，作為區(qū)分存活與死亡的方法。具體地，為了分析細胞的存活&死亡，用透過細胞膜的核染色劑SYT09與不透過細胞膜的核染色劑PI兩種染色劑，用如下草案進行染色。準備在ImL的PBS中加入了 I. 5 μ L 3. 34mM的SYT09與I. 5 μ L 30mM的PI的染色溶液，從該溶液中取2 μ L加入到200 μ L的樣品液中，在黑暗條件下進行20分鐘染色反應。圖12為通過上述處理，將稱為MCF-7的細胞進行染色并測量的結(jié)果。在該散布圖中，存活分布為僅用SYT09進行染色的細胞的分布，表示一個線性分布。另一方面，死亡分布由于利用細胞膜的破損而也被PI染色，因此為雙重染色狀態(tài)。在該分布中，SYT09的染色量與PI的染色量之間的比例幾乎一定。因此，死亡分布的位置與存活分布的位置相比向下方偏離，呈直線分布。下面如公式9所示，在考慮FL1/FL2時，其值的對數(shù)表示直線的縱軸截距。因此，F(xiàn)L1/FL2的對數(shù)，在比較存活分布的值與死亡分布的值時，存活分布的值變大。圖13為用上述方法調(diào)查抗菌劑對綠膿菌的效果的圖表。其為使抗菌劑混入一定時間后，用SYT09和PI染色20分鐘，測定FL1/FL2的柱狀圖分布。在不混入抗菌劑的情況下，表示單一峰的分布，但如果混入抗菌劑，則產(chǎn)生小值的分布，如果提提高抗菌劑的濃度，則可得到小值的分布比例變大的結(jié)果。圖13中用虛線表示的值為存活判定的閾值，其為通過預先分別測定100%活菌和100%死菌獲得的分布界限來設定的值，以該閾值為基準，能夠自動進行存活判定。因此，可知FL1/FL2作為自動判定存活的指數(shù)是有效的。若將上述內(nèi)容用公式進行說明時，如下所示。如公式9所示，在考慮FL1/FL2時，如變形為公式10可知，該值的對數(shù)表示圖12中圖表直線的縱軸截距。因此，隨著FL1/FL2從存活變化為死亡，能夠推測到值會變小，因此適合作為存活分析的指數(shù)。FL1/FL2= Δ(9)LogFLl=LogFL2+Log Δ (10)圖14為相對于目前用作存活分析的圖12的散布圖，將同一測定結(jié)果用使用了本發(fā)明的存活判定指數(shù)的散布圖進行表示。將縱軸設為FL1/FL2，進一步地，將橫軸設為表示細胞大小的前方側(cè)散射強度信號FS，從而實現(xiàn)了將細胞的存活信息與細胞大小信息在一個二維散布圖中進行表達。在該圖14的散布圖中，對于測定樣品MCF-7細胞，表示出死亡細胞的大小小于存活細胞的大小的結(jié)果。如上上述，作為流式細胞儀的多維數(shù)據(jù)的表示方法，根據(jù)測定目的，采用由信號強度間的運算式定義的指數(shù)作為圖表顯示的軸，從而能夠增加用二維散布圖表達的信息量。圖15為對細胞的兩種表面標記，一個用FITC熒光標記抗體染色，另一個用PE熒光標記抗體染色的樣品的測定數(shù)據(jù)中，用PE/ (FITC+PE)作為縱軸，用FS作為橫軸的表示例。在此，PE及FITC為熒光校正后的熒光量，是與各自的熒光分子數(shù)成比例的量。該指數(shù)是作為表示兩種表面標記的表達比例的量來進行定義的，圖15為在一張圖表中表不兩種表面標記的表達比率對細胞大小依賴性的表示例。根據(jù)該指數(shù)的值，能夠?qū)γ總€細胞分析關于各個細胞的表達比例的過量和不足。此外，作為用來評價檢測的細胞是一個細胞還是多個聚集的細胞的指數(shù)，可以定義(信號脈沖面積)/(信號脈沖時間長短)等。白細胞等浮游類細胞以單一細胞狀態(tài)流動，但血液中的癌細胞等不限于以單一狀態(tài)在血液中循環(huán)。在這種評價中，與是否聚集無關，需要評價細胞數(shù)。該指數(shù)在分析是否聚凝中發(fā)揮作用。如上上述，這種通過多個信號之間的運算，定義適合分析內(nèi)容的指數(shù)，用該指數(shù)的值定量評價各個細胞的特性的方法具有很多優(yōu)點。作為其優(yōu)點有通過將多維信息匯總為一個指數(shù)，能夠用一個二維散布圖表達基于三種以上信號的信息；通過預先對該指數(shù)設定判定閾值，實現(xiàn)對各個細胞的定量判定。該方法在定量醫(yī)療診斷中有效。工業(yè)實用性
本發(fā)明適合用作無殘留、無交叉污染的I)細胞分選儀、2)能夠檢測側(cè)方散射光的流式細胞儀、3)準確檢測細胞密度的裝置、4)不需要熒光校正的多重染色分析裝置，以及使用這些裝置的細胞分離、分析方法等。附圖標記說明I…樣品液流道2…鞘液流道3…照射光4-1…分選流道(“拉”側(cè))4-2…分選流道(“推”測)5…分選貯液室6…過濾器7-1、7-2…電磁閥8-1…負壓定壓泵8-2…正壓定壓泵9-1…分離對象細胞9-2…非分離對象細胞10…樣品液貯液室11…回收樣品液貯液室20…鞘液貯液室22…鞘液用端口23…鞘液回收端口24…鞘液回收端口25…芯片用基板27…流道31…樣品液貯液室32…鞘液用端口
34…廢液貯液室35…回收樣品液貯液室36…樣品液37…鞘液貯液室39-1、39-2…側(cè)方散射檢測用反射面40…激光束掃描區(qū)域41···流道50…激光光源51···物鏡·52…激光53…被分選流道4-1與4-2夾著的區(qū)域。54、55、56 …二向色鏡57、58、59…帶通濾波器60…透射激光遮斷用空間過濾器61...光電二極管62、63…光電倍增管64…AD轉(zhuǎn)換器69…AD轉(zhuǎn)換器70···鍵盤71···顯示裝置
權(quán)利要求
1.ー種微粒分離裝置，其具有 流動室，在平板基板內(nèi)形成流道； 光照射裝置，對流經(jīng)所述流道的樣品液中的微粒照射光； 檢測裝置，檢測在照射所述光時由所述微粒產(chǎn)生的散射光或熒光，基于它們的信號強度對所述微粒進行識別，檢測目標微粒； 定壓泵以及與其連接的電磁閥，所述定壓泵對在所述流動室的所述流道中流動的所述樣品液中的所述微粒施加壓カ脈沖；以及， 控制部，基于來自所述檢測裝置的信號，控制所述電磁閥的動作，其特征在干， 所述流動室具有所述樣品液的導入用流道以及設置在其兩側(cè)的ー對鞘液導入用流道、合流流道、光照射區(qū)域以及ー對對置的分支流道； 所述合流流道，是所述ー對鞘液導入用流道合流到所述樣品液的導入用流道而成，在該合流流道內(nèi)，鞘液夾著上述樣品液，在其兩側(cè)流動； 所述光照射區(qū)域位于所述合流流道上； 所述ー對對置的分支流道，在與所述光照射區(qū)域相比的下游處，連接于所述合流流道上； 在所述ー對對置的分支流道中的一個流道上連接通常為關閉狀態(tài)的第一電磁閥和負壓的定壓泵； 在所述ー對對置的分支流道的另ー個流道上連接通常為關閉狀態(tài)的第二電磁閥和正壓的定壓泵； 所述檢測裝置對所述微粒通過所述光照射區(qū)域時所產(chǎn)生的光信號進行檢測； 所述控制部基于來自所述檢測裝置的所述光信號，判斷所述微粒是否為應分離的目標微粒，在判斷為是應分離的目標微粒的情況下，在該微粒通過與所述ー對對置的分支流道連接的所述合流流道區(qū)域吋，對所述第一及第ニ電磁閥提供只是短時間作為開啟狀態(tài)的信號，對從所述對置的ー對分支流道通過所述區(qū)域時的所述目標微粒施加推(PUSH)及拉(PULL)的壓力，改變所述目標微粒流，從而分離所述目標微粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微粒分離裝置，其特征在干， 所述控制部，在判斷所述微粒為應分離的目標微粒的情況下，在該微粒通過與所述ー對對置的分支流道連接的所述合流流道區(qū)域吋，對所述電磁閥提供只是短時間作為開啟狀態(tài)的信號； 據(jù)此，對存在于所述對置的分支流道間的所述合流流道的所述區(qū)域中的所述目標微粒施加推及拉的壓力，改變所述目標微粒流，將所述目標微粒收入“拉”側(cè)的所述分支流道，從而分離所述目標微粒。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的微粒分離裝置，其特征在干， 所述流動室還具有ー對追加分支流道，其是在比所述ー對對置的分支流道連接的所述合流流道區(qū)域更下游處，從所述合流流道上分支出的； 所述控制部，在判斷所述微粒為應分離的目標微粒的情況下，在該微粒通過最初的所述ー對分支流道相對且所述最初的分支流道連接的所述合流流道的所述區(qū)域中，對所述電磁閥提供只是短時間作為開啟狀態(tài)的信號， 據(jù)此，對存在于所述對置的所述最初的分支流道間的所述合流流道的所述區(qū)域中的所述目標微粒施加推及拉的壓力，改變所述目標微粒流，將所述目標微粒分離到下游的所述追加分支流路中。
4.一種平板狀的流動室裝置，用于在流道內(nèi)流動樣品液的狀態(tài)下，分離包含在樣品溶液中的粒子，其特征在于，； 所述流動室的結(jié)構(gòu)如下在透明基板中形成有流道，在所述流道的上游側(cè)與下游側(cè)的基板上部分別形成有與所述流道進行流體連接(fluidly connected)的忙液室； 所述流動室具有形成于透明基板上的所述樣品液的導入用流道和設置在其兩側(cè)的一對鞘液導入用流道、合流流道以及對置的一對分支流道； 所述合流流道，是所述所述樣品液的導入用流道與設置在其兩側(cè)的所述一對鞘液導入用流道合流而成，所述鞘液夾著上述樣品液，在其兩側(cè)流動； 所述一對對置的分支流道，其連接于所述合流流道的側(cè)面； 所述一對對置的分支流道具有能夠與外部泵進行氣密連接的端口。
5.一種應對多個待測樣品的流式細胞儀，其用于將包含生物粒子的樣品液在流動室中的流道內(nèi)流動的狀態(tài)下，對樣品液照射光，檢測由包含在該樣品液中的樣品粒子所產(chǎn)生的光，其特征在于，其具有 載置臺，載置流動室； 光照射裝置； 檢測裝置，檢測所述生物粒子；以及， 控制部，控制所述各部的動作， 所述流動室為平板狀，在透明的平板基板上形成有多個樣品液貯液室及多個鞘液貯液室、多個廢液貯液室及多個回收樣品液貯液室，以及與這些貯液室分別流體連接的多個流道； 各所述樣品液貯液室在各所述鞘液貯液室內(nèi)隔開形成，以避免各自液體相混合； 各所述樣品液貯液室上連接有各樣品液用流道； 各所述鞘液貯液室上連接有一對用于鞘液用流道； 各所述樣品液流道的側(cè)面連接有所述一對鞘液用流道； 通過在各所述樣品液流道上連接所述一對鞘液用流道，從而形成從所述樣品液的左右合流鞘流的流道，合流后的流道以平行的等間距形成，最下游連接到形成在流動室上的所述廢液液室及所述回收樣品液室上； 在多個所述流道的每一個上，利用使只能照射一個流道大小的光束依次以步進重復(step and repeat)方式照射光或流動室移動,來檢測多個樣品。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應對多個待測樣品的流式細胞儀，其特征在于，通過使所述流動室的所述透明平板基板的所述流道側(cè)面方向的兩端傾斜，從而使由各所述流道內(nèi)產(chǎn)生的側(cè)方散射光在兩端全反射，并進行檢測。
7.一種流式細胞儀，其特征在于，其具有照射光源和熒光測定裝置，所述熒光測定裝置的結(jié)構(gòu)為檢測多個波長區(qū)域的熒光； 在分析包含多個熒光分子的細胞中，具有將由光照射產(chǎn)生的波長不同的兩種熒光強度的比，對每個細胞導出分布并進行顯示的功能； 還具有根據(jù)其值來評價包含在細胞中的多個熒光分子的豐度的功能。
8.一種液體中微粒的檢測裝置，其特征在于，其具有 流動室，在平板基板內(nèi)形成流道； 照射光源，其在流動室中將樣品液中的微粒與鞘液一起在所述流道中流動的狀態(tài)下，對樣品液中的微粒照射光； 檢測裝置，檢測在照射所述光時由所述微粒產(chǎn)生的散射光或熒光，基于它們的信號強度對所述微粒進行識別，檢測目標微粒；以及， 控制、分析部，控制所述各部，基于來自所述檢測裝置的信息，分析所述粒子， 利用表示在所述樣品液完全流完的時刻所產(chǎn)生的氣泡的信號，通過探測所述樣品液檢測的終點，對包含在全部所述樣品液中的粒子數(shù)進行定量。
9.一種生物粒子分析裝置，其特征在于，其具有照射光源與光測定裝置，所述光測定裝置的結(jié)構(gòu)為在多個波長區(qū)域中檢測通過照射光而由每個微粒產(chǎn)生的光； 所述生物粒子分析裝置具有以下功能，對每個粒子，根據(jù)與粒子的測定項目相對應的多個信號強度間的運算來求得指數(shù)，基于該指數(shù)的值來分析粒子特性。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的生物粒子分析裝置，其特征在于，其具有運算裝置，所述運算裝置在對使用透過細胞膜的染色劑與不透過細胞膜的染色劑同時染色的細胞或細菌進行存活判斷的測定分析的情況下，將由光照射產(chǎn)生的波長不同的兩種熒光信號強度的比作為指數(shù)，基于該指數(shù)的值，判定是死細胞還是活細胞。
11.一種生物粒子分析裝置，其特征在于，其具有照射光源和光測定裝置，所述光測定裝置的結(jié)構(gòu)為在多個波長區(qū)域檢測通過照射光而由每個微粒產(chǎn)生的光， 對每個粒子，導出用多個信號強度間的運算式定義的指數(shù)，能夠選擇該指數(shù)作為數(shù)據(jù)顯示圖表的軸。
全文摘要
本發(fā)明實現(xiàn)無殘留、無交叉污染的細胞分選儀、能夠檢測側(cè)方散射光的流式細胞儀、準確檢測細胞密度、不需要熒光校正的多重染色分析。本發(fā)明提供一種微粒分離裝置，其具有流動室，在平板基板內(nèi)形成流道；光照射裝置，對流經(jīng)流道的樣品液中的微粒照射光；檢測裝置，檢測在照射光時由微粒產(chǎn)生的散射光或熒光，基于它們的信號強度對微粒進行識別，檢測目標微粒；定壓泵以及與定壓泵連接的電磁閥，所述定壓泵對在流動室的流道中流動的樣品液中的微粒施加壓力脈沖；以及，控制裝置，基于來自檢測裝置的信號，控制電磁閥的動作。
文檔編號G01N15/14GK102753955SQ201180006138
公開日2012年10月24日 申請日期2011年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月15日
發(fā)明者武田一男 申請人:芯片生物技術株式會社