專利名稱：血小板檢測用微芯片及使用該微芯片的血小板檢測裝置的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種使用微量血液檢測血液中血小板功能的微芯片及使用該微芯片的檢測裝置。
背景技術(shù)：
(血小板凝集檢測的現(xiàn)有技術(shù)存在的問題)血小板的活化及凝集在動脈中的血栓形成(白色血栓)或初期止血中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。當(dāng)血管受損時，血小板與血管內(nèi)皮細(xì)胞下存在的膠原蛋白直接和間接地結(jié)合。在 血流緩慢的環(huán)境下(低剪切應(yīng)力下)，它們的結(jié)合主要是經(jīng)由諸如GPVI等膠原蛋白受體的直接結(jié)合；而在血流快速的環(huán)境下(高剪切應(yīng)力下)，vWF與膠原蛋白結(jié)合，并且血小板的GPIba受體與vWF結(jié)合,從而導(dǎo)致血小板與膠原蛋白的間接結(jié)合。與膠原蛋白的直接和間接相互作用使血小板活化，并且通過這種刺激，從致密顆粒和a -顆粒釋放諸如ADP和血清素等各種血小板活化物質(zhì)。上述釋放出的血小板活化因子可使血小板自身和周圍的血小板活化。受到活化的血小板使纖維蛋白原受體GPIIb、IIIa經(jīng)歷活化型的結(jié)構(gòu)變化，使血小板對于纖維蛋白原變?yōu)楦哂H和型。通過二聚體纖維蛋白原，活化的血小板彼此順次交聯(lián)，形成血小板凝集。但是，目前測定血小板凝集的裝置多數(shù)為測定通過大量血小板活化試劑的刺激使血小板活化和凝集過程的方法(非專利文獻I)。因此，在與生理性血小板活化條件很不相同的環(huán)境下誘發(fā)血小板活化反應(yīng)，可測定各種受體的先天性功能異常等明顯的功能差異，但是測定更多的生理性的血小板功能卻很困難。PFA-100 (血小板功能分析儀非專利文獻2)是測定孔堵塞的系統(tǒng)，所述孔堵塞是通過與固定化的膠原蛋白接觸、剪切應(yīng)力、與血小板誘導(dǎo)物質(zhì)接觸而引起綜合性的血小板活化的孔堵塞。與目前單獨的由血小板活化誘導(dǎo)物質(zhì)的刺激引起的血小板凝集相比，這是一種更接近生理性環(huán)境的測定系統(tǒng)。但是，無法調(diào)節(jié)數(shù)據(jù)波動以及經(jīng)過孔的血液中含有的誘導(dǎo)物質(zhì)的濃度，因此，無法適宜地測定血栓癥發(fā)病引起的血小板已被活化的患者中發(fā)現(xiàn)的血小板活化誘導(dǎo)物質(zhì)濃度非常低或不存在的情況下誘導(dǎo)的血小板凝集，以及血小板功能異?；颊咧袦y定血小板功能的情況下由極高濃度的血小板誘導(dǎo)物質(zhì)刺激引起的血小板凝集能力。此外，專利文獻I中公開了一種測量血小板功能的方法，其特征在于，使血液經(jīng)過毛細(xì)管內(nèi)部，然后經(jīng)過分隔件的開口部；隨后，測定血栓形成堵塞開口部所需的時間。在該方法中，加入大量血小板活化試劑，在生物體內(nèi)血小板被活化而使血小板數(shù)量減少的情況或血小板數(shù)量正常但血小板功能弱的情況等情況下，很難測定反映生物體狀況的詳細(xì)的血小板功能。專利文獻
專利文獻I :特開2007-298511號公報非專利文獻非專利文獻I :血小板凝集能検查(血小板凝集能力檢測),Thrombosis and Circulation，vol. 12，No. 4，pl7_20，2004非專利文獻2 =PFA-IOO d 6血小板凝集能測定(由PFA-100P測定血小板凝集能力)，Thrombosis and Circula tion, vol. 13, No. 3, p90-94, 200
發(fā)明內(nèi)容
例如，敗血癥、彌散性血管內(nèi)凝血綜合征(DIC)等疾病中，由于血管內(nèi)皮紊亂和血栓形成，血小板處于被活化的狀態(tài)，進一步地，還形成血小板與白細(xì)胞的復(fù)合體等。此外，持續(xù)的血栓形成引起血小板顯著被消耗,盡管生物體內(nèi)有血栓形成,但同時還有出血癥狀。目前的血小板功能檢驗中，難以進行嚴(yán)格反映這種癥狀的檢測。例如，在濁度法中，即使血小板數(shù)量減少，如果對于血小板誘導(dǎo)物質(zhì)的反應(yīng)性依然亢進，則判斷血小板功能亢進(增強)。此外，對于生物體內(nèi)的炎癥反應(yīng)等形成的血栓形成有較大影響的血小板-白細(xì)胞復(fù)合體在用于制成富含血小板的血漿進行離心分離時與紅細(xì)胞共同沉淀，因此，在富含血小板的血漿中不含有該成分。此外，在使用PFA-100的情況下，由于無論血小板功能強的患者還是血小板功能弱的患者均在相同濃度的誘導(dǎo)物質(zhì)下進行測定，因此，無法適當(dāng)?shù)剡M行檢測以確認(rèn)在沒有誘導(dǎo)物質(zhì)或誘導(dǎo)物質(zhì)含量很少的狀態(tài)下引起的自然凝集誘導(dǎo)或確認(rèn)對于給予抗血小板藥物的患者中在誘導(dǎo)物質(zhì)濃度非常高的情況下該藥物的效果。此外，即使通過PFA-100測定時堵塞時間延長的情況下，也難以進行血小板功能弱的情況和血小板功能亢進(生物體內(nèi)受到活化)但血小板數(shù)量少的情況之間的數(shù)據(jù)比較等。鑒于上述情況，本發(fā)明的課題是提供一種在與血流同等環(huán)境下，使用微量血液可高效、正確地評價血小板功能的裝置和方法。為解決上述課題，本發(fā)明提供一種微芯片，其特征在于，所述微芯片是通過血液在流路中流動以誘導(dǎo)血小板凝集而測定血小板功能的微芯片，所述微芯片具有設(shè)置在內(nèi)部的流路，為了與血小板粘附，所述流路中至少局部涂覆有膠原蛋白，多個壁沿著所述流路中血液流動的方向延伸且將所述流路的寬度分隔形成流路分隔部，對所述壁施予表面粗糙度(Ra)變成IOlOOnm的處理。流路分隔壁的位置優(yōu)選在流路上的血小板易粘附面(膠原蛋白涂覆部)存在的位置上沿著血液流動的方向延伸。此外，流路中，流路分隔部以外部分的表面粗糙度優(yōu)選不到10nm。表面粗糙度(Ra)變成IOlOOnm的處理優(yōu)選通過等離子體輻射或紫外線照射進行。此外，血液在流路中以一定速度流動形成血小板凝集塊的同時測定血液流入壓力時，前述微芯片的耐壓性優(yōu)選為80kPa以上。此外，前述微芯片優(yōu)選為在流路分隔部的上游(該流路上以血液流動方向為基準(zhǔn)的該血栓形成誘導(dǎo)部的上游)進一步設(shè)置有防雜質(zhì)流入部。另外，本發(fā)明為提供含有前述任意微芯片的血小板功能檢測裝置。前述血小板功能檢測裝置優(yōu)選進一步裝配有用于收容血液的容器、用于將血液從所述容器輸液至微芯片內(nèi)的流路的輸液泵以及測定施加于所述泵的壓力的壓力傳感器。另外，前述血小板功能檢測裝置優(yōu)選裝配有廢液儲存部，所述廢液儲存部位于微芯片內(nèi)部的膠原蛋白涂覆部的下游(該流路上以血液流動方向為基準(zhǔn)的膠原蛋白覆蓋部的下游)，用于儲存經(jīng)過膠原蛋白涂覆部的血液廢液。另外，本發(fā)明提供一種血小板功能檢測方法，其特征在于，通過使血液經(jīng)過前述任意的微芯片或前述任意的血小板功能檢測裝置的流路，在流路分隔部和膠原蛋白涂覆部中引起血小板凝集的同時，測定所述血液流向所述流路的流入壓力，由此檢測血小板的功能。本發(fā)明的權(quán)利要求I中所述的血小板功能用微芯片，在微芯片內(nèi)部流路的局部，設(shè)置有膠原蛋白涂覆部和配備有流路分隔壁的流路分隔部，所述流路分隔壁沿著所述流路中血液流動的方向延伸且將所述流路的寬度進行多個分隔。對所述壁施予表面粗糙度(Ra)變成IOlOOnm的處理，由于進行了上述處理，膠原蛋白上形成的血小板凝集塊在流路分隔部得以穩(wěn)定化，進一步引起強烈的、穩(wěn)定的壓力上升，提高數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性。通過引起強烈的壓力上升，可評價血小板凝集塊的堅固性或脆弱性及其穩(wěn)定性(持續(xù)性)?！ぁけ景l(fā)明的權(quán)利要求2中所述的血小板功能用微芯片，由于表面粗糙度(Ra)變成IOlOOnm的處理通過等離子體輻射或紫外線照射進行，不僅是流路分隔壁表面的物理性質(zhì)(表面粗糙度)還有化學(xué)性質(zhì)(羥基、亞氨基、酰胺基等官能團的引入)都可處于適于血小板凝集的狀態(tài)。本發(fā)明的權(quán)利要求3中所述的血小板功能用微芯片，由于流路中，流路分隔部以外部分的表面粗糙度不到10nm，在血小板易粘附面(膠原蛋白涂覆部)和流路分隔部特異性地促使血小板凝集塊的形成，可特異性地分析血小板凝集塊的形成。本發(fā)明的權(quán)利要求4中所述的血小板功能用微芯片，由于血液在流路中以一定速度流動形成血小板凝集塊的同時測定血液的流入壓力時，耐壓性為SOkPa以上，可進行靈敏度更高的測定。本發(fā)明的權(quán)利要求5中所述的血小板功能用微芯片，由于流路分隔部的上游設(shè)置有防雜質(zhì)流入部，不易產(chǎn)生由樣品中的雜質(zhì)引起的測定誤差而可以進行正確的測定。本發(fā)明的權(quán)利要求6中所述的血小板功能檢測裝置，由于裝配有權(quán)利要求廣5中任意一項所述的血小板功能用微芯片，可高效地促進血小板凝集，在短時間內(nèi)高靈敏地測定血小板功能。本發(fā)明的權(quán)利要求7中所述的血小板功能檢測裝置，由于裝配有用于收容血液的容器、用于將血液從所述容器輸液至微芯片內(nèi)的流路的輸液泵以及測定施加于所述泵的壓力的壓力傳感器，因此，優(yōu)選可通過流入血液的壓力定量地評價血小板功能。本發(fā)明的權(quán)利要求8中所述的血小板功能檢測裝置，由于裝配有廢液儲存部，所述廢液儲存部位于微芯片內(nèi)部的膠原蛋白涂覆部的下游，用于儲存經(jīng)過膠原蛋白涂覆部的血液廢液，因此，沒有必要吸除血液廢液，可簡便地進行檢測。本發(fā)明的權(quán)利要求9中所述的血小板功能檢測方法，由于通過使血液經(jīng)過前述任意微芯片或前述任意血小板功能檢測裝置的流路，在流路分隔部和膠原蛋白涂覆部中引起血小板凝集的同時，測定該血液流向流路的流入壓力，由此檢測血小板的功能，因此，可高效地促進血小板凝集，在短時間內(nèi)高靈敏地測定血小板功能。


圖I表示本發(fā)明的血小板檢測用微芯片的第一實施方式的示意圖。圖2表示本發(fā)明的血小板檢測裝置的第一實施方式的示意圖。圖3表示本發(fā)明的血小板檢測用微芯片的第二實施方式的示意圖。圖4表示使用具有流路分隔部經(jīng)等離子體處理的微芯片(A)(試驗例I)、經(jīng)紫外線處理的微芯片(B)(試驗例2)或未經(jīng)處理的微芯片(C)(比較例I)的血小板檢測裝置來檢測流入血液的壓力的結(jié)果示意圖。圖5表示使用具有流路分隔壁經(jīng)等離子體處理的微芯片的血小板檢測裝置來測定阿司匹林的血小板凝集效果的結(jié)果示意圖(試驗例3)。縱軸表示壓力(kPa)，橫軸表示時間(分鐘)。從給予阿司匹林的受試者采集的血液(給予阿司匹林)和未給藥的同一受試者采 集的血液(對照)以9 ii L/分鐘和27 u L/分鐘的流速流動進行評價。圖6表示使用具有流路分隔壁未經(jīng)等離子體處理的微芯片的血小板檢測裝置來測定阿司匹林的血小板凝集效果的結(jié)果示意圖(比較例2)。縱軸表示壓力(kPa)，橫軸表示時間(分鐘)。從給予阿司匹林的受試者采集的血液(給予阿司匹林)和未給藥的同一受試者采集的血液(對照)以9 ii L/分鐘和27 u L/分鐘的流速流動進行評價。
具體實施例方式首先，參照圖對本發(fā)明的血小板檢測用微芯片和血小板檢測裝置進行說明。但是，本發(fā)明的血小板檢測用微芯片和血小板檢測裝置不限于下述方式。此外，本發(fā)明中的“血液”包括全血和富含血小板的血漿。圖I為顯示本發(fā)明微芯片的第一實施方式的概念圖。以下，基于圖I進行說明。圖I (A)為第一基板100表面的平面圖，其中在表面上刻有構(gòu)成微芯片I的流路101的溝槽。該溝槽的橫截面形狀可為凹字狀、U字狀、V字狀等任意形狀。由于血小板凝集塊很脆，為測定壓力上升，優(yōu)選溝槽的深度為lOymlOO 以下。優(yōu)選溝槽的寬度為10 u nT3mm0此外，構(gòu)成流路101的溝槽的第一端部(流入口一側(cè)的端部)和第二端部(排出口一側(cè)的端部)之間的部分，設(shè)置有沿血液流動方向延伸的多個流路分隔壁102，該流路的寬度被多個分隔形成流路分隔部103。此外，優(yōu)選流路分隔壁102之間的間隔為200 u m以下。如果寬度在200 U m以下，在形成血小板凝集塊的區(qū)域，即使在高血流、高剪切應(yīng)力下，該凝集塊也不被血流沖走而能使內(nèi)部壓力上升。此外，流路分隔部103中，流路101的寬度優(yōu)選被流路分隔壁102分隔為5個以上。即，如果流路的寬度分隔為5個流路以上，可使各分隔流路的堵塞平均化，容易得到波動較小的數(shù)據(jù)。此外，只要能將流路101的寬度進行多個分隔，流路分隔壁102的形狀則無特殊限制。為了提高與血小板凝集塊的粘附性，對流路分隔壁102施予表面粗糙度(中心線平均粗糙度Ra)變成IOlOOnm的處理。特別是由于血小板的大小為f 2 y m左右，因此，優(yōu)選引入IOlOOnm的粗糙度，可以不損壞分隔流路的形狀，提高血小板凝集塊的粘附性。優(yōu)選通過等離子體或紫外線照射等進行該處理。
認(rèn)為血小板凝集塊對流路分隔壁的粘附性與流路分隔壁表面的物理性質(zhì)(表面粗糙度)和表面的化學(xué)性質(zhì)(羥基、亞氨基、酰胺基等官能團的引入)兩方面有關(guān)。通過等離子體或紫外線照射處理不僅能使表面粗糙度增大，還能在流路分隔壁表面引入官能團。作為等離子體處理，可列舉常壓等離子體、真空等離子體、電暈處理等；作為紫外線處理可列舉使用準(zhǔn)分子激光、汞燈等進行處理。特別是對于常壓等離子體，由于裝置便宜可連續(xù)進行等離子體處理，因此優(yōu)選。等離子體對流路分隔部進行特異性的輻射，由于可促進在血小板易粘附面(膠原蛋白涂覆部)和位于其附近的流路分隔部特異性地形成血小板凝集塊，對血小板凝集塊的形成進行特異性的分析，因此優(yōu)選。健康正常人的血液以一定速度經(jīng)過微芯片的流路，在流路分隔部形成血小板凝集塊時，血液的流入壓力上升至約80kPa。因此，優(yōu)選微芯片的耐壓性為SOkPa以上。流路分隔部103的上游(即，流路分隔壁102和第一端部(流入口一側(cè)端部)之間的部分)在流路的寬度方向上以規(guī)定間隔設(shè)置有多個柱狀體104，這形成防雜質(zhì)流入部105。柱狀體之間的間隔(空隙的長度)為可使血液通過但不能使雜質(zhì)通過的長度為宜，優(yōu)選為10^200umo對柱狀體的形狀沒有特殊限制，可列舉圓柱、多角柱等。圖I (B)為第二基板110的平面圖，其上刻有構(gòu)成微芯片I的流入口 106和排出口 107的通孔。構(gòu)成流入口 106的通孔和構(gòu)成排出口 107的通孔的位置分別為疊置第一基板100時對應(yīng)于第一基板100上的流路101的第一端部的位置和流路101的第二端部的位置。此外，第二基板110的內(nèi)表面與第一基板100疊置時，覆蓋第一基板100上的流路分隔壁102的位置上涂布膠原蛋白，由此形成血小板易粘附面108 (膠原蛋白涂覆部)。具體來說，如圖I (C)所示形態(tài)，為了安全起見，將膠原蛋白大范圍地涂覆在覆蓋流路分隔壁102的位置上。此外，血小板易粘附面(膠原蛋白涂覆部)也可遍及流路的全長。圖I (C)為微芯片I的平面圖，其中，使第一基板100的溝槽與第二基板110的膠原蛋白涂覆部朝向內(nèi)側(cè)，將第一基板100與第二基板110疊置。虛線所示為流路101在微芯片I內(nèi)部的存在位置。此外，本發(fā)明微芯片的第二實施方式中，如圖3所示，如圖I第二基板中對應(yīng)于流路的第二端部的位置設(shè)置有通孔來取代排出口，第二基板210中對應(yīng)于流路201的第二端部設(shè)置有連續(xù)的溝槽，通過與第一基板200貼合，也可作為儲存經(jīng)過血小板易粘附面208(膠原蛋白涂覆部)的血液廢液的廢液儲存部207。由于廢液儲存部207的容積大于試驗中使用的血液量，因此沒有必要如第一實施方式中用泵等將血液廢液從排出口吸出，因而可更簡便地進行檢測。此外，廢液儲存部207上設(shè)置有通孔，該孔也可作為空氣孔209。此外，如果在對應(yīng)于微芯片2的表面的空氣孔209的位置上設(shè)置有血液吸收材料，即使在血液樣品的量較多的情況下，血液廢液也不會飛濺到微芯片外。作為血液吸收材料，可貼附例如海綿或布等。此外，也可在空氣孔209上連接排出管，用于吸除血液廢液。本發(fā)明的微芯片中，血小板易粘附面使用涂布的膠原蛋白，也可含有膠原蛋白和組織凝血激酶。血小板易粘附面是以不會隨血流流出這樣的高粘附強度將膠原蛋白涂布于血小板易粘附面108、208。膠原蛋白的涂覆通過例如特開平05-260950號公報或Blood. 1995年4月I日，85
(7):1826-35中記載的那樣，將膠原蛋白溶解于酸性溶液，再將該溶液涂布于賦予親水性的、玻璃或聚苯乙烯等基板的規(guī)定位置上，然后洗滌和干燥基板等方法，可以高粘附強度簡便地進行涂覆。在將要涂覆于疏水性樹脂等的情況下，在樹脂表面進行親水化處理之后，將膠原蛋白溶液涂布于所需區(qū)域，自然干燥或減壓干燥，可得到涂層。在使用塑料作為基質(zhì)材料的情況下，對表面進行親水化處理后，用吸液管或注射器等分配器將膠原蛋白溶液涂布于所需區(qū)域，通過自然干燥或減壓干燥，可容易地涂覆膠原蛋白或含有組織凝血激酶的膠原蛋白。微芯片的材質(zhì)優(yōu)選為金屬、玻璃或塑料、硅樹脂等。此外，從用于血液觀測(特別是圖像分析)的觀點來看，優(yōu)選透明的材質(zhì)。進一步地，從形成回路的觀點來 看，優(yōu)選塑料，特別優(yōu)選透明的塑料。材質(zhì)為PDMS (聚二甲基硅氧烷)等硅樹脂制成的情況下，由于基板之間的粘著性優(yōu)異，使得甚至通過按壓就可以將第一基板與第二基板疊置，而無需使用粘合劑等進行粘合，但是，在向微芯片的內(nèi)部施加高壓時，優(yōu)選使用粘合劑。此外，通過使用聚(丙烯酸2-甲氧基乙基酯KPMEA)還可簡便且有效地在非預(yù)期的區(qū)域抑制血液凝固。此外，微芯片的基板上設(shè)置的溝槽或孔可由刀具或激光束刻成，但在微芯片材質(zhì)為塑料的情況下，可通過注射成型來形成。由于通過注射成型來形成可高效地制造穩(wěn)定品質(zhì)的微芯片，因此優(yōu)選。對使用本實施方式的微芯片I的血小板功能檢測的一個例子基于圖I (C)進行說明。在第一流入口 106上連接有未圖示的導(dǎo)管，通過導(dǎo)管連接有未圖示的血液儲存器(血液收容部)及輸液泵。此外，通過連接的泵，將該泵內(nèi)的液體注入儲存器，將該儲存器中的血液注入微芯片I的流路中。輸液泵的液體為礦物油或生理鹽水等比血液比重小的液體，通過輸液泵將該液體導(dǎo)入預(yù)先填充血液的儲存器中，該液體層疊在血液上，通過泵將該液體壓出，可使血液導(dǎo)入流路中。通過測定該液體的流入壓力可間接地測定血液流向流路的流入壓力。此外，也可在儲存器預(yù)先填充的血液中混合血小板活化試劑。血小板活化試劑可以干燥或液體狀態(tài)預(yù)先置于儲存器內(nèi)，然后與血液混合。血液優(yōu)選進行過抗凝處理。此處，作為抗凝處理使用的抗凝處理劑，可列舉檸檬酸鈉或鉀、草酸鈉或鉀、A⑶(酸性檸檬酸葡萄糖)、乙二胺四乙酸(EDTA)鹽等。上述抗凝處理劑可以作為粉末形式、冷干品形式、水溶液等溶液形式來使用。上述抗凝處理劑中，常用的3. 2%的檸檬酸鈉由于可容易獲得而優(yōu)選。上述情況下，對于9體積血液，優(yōu)選使用I體積的該抗凝處理劑。作為其他的抗凝處理劑，可使用肝素、水蛭素、凝血激酶適配體、玉米來源的胰蛋白酶抑制劑(1977. J. Biol. Chem 252. 8105)等。此外，也可使用多種抗凝處理劑。使用的抗凝處理劑為水蛭素的情況下，與檸檬酸進行抗凝處理的情況相比較，即使沒有血小板活化試劑的處理，也會引起更強烈的血小板凝集，因此適用于剪切應(yīng)力依賴性的血小板功能測定。通過檸檬酸進行抗凝處理血液的情況下，可對血小板活化試劑的刺激依賴性的血小板功能進行準(zhǔn)確測定，適用于抗血小板劑的評價等。作為得到經(jīng)抗凝處理的血液的方法，可在注射器或真空采血管中預(yù)先放置上述的抗凝處理劑再進行采血，此外，采血后迅速向血液中加入抗凝處理劑的方法也可得到經(jīng)抗凝處理的血液。
進一步地，使用含有肝素的真空采血管等采血之后，加入肝素酶和適用于檢測目的的抗凝處理劑，由此通過肝素酶分解肝素，可與適用于測定目的的抗凝處理劑置換。在抗凝處理的血液與血小板活化試劑混合的情況下，作為使用的血小板活化試齊U，可列舉ADP、膠原蛋白、凝血酶、花生四烯酸和瑞斯托菌素等。該情況下，可進行對血小板活性試劑的血小板活化能力的評價。將血小板活化試劑以引起弱血小板活化的濃度與經(jīng)抗凝處理的血液混合?？梢鹑跹“寤罨臐舛葹殪o止?fàn)顟B(tài)下不會引起不可逆的血小板凝集(血小板二次凝集)的濃度，例如，ADP的情況下，這一濃度為0. 001 u M^5 u M ;花生四烯酸的情況下，這一濃度為0. OOlmlTlmM。但是,在血小板功能異常和由于給予抗血小板劑引起的對于上述血小板活化試劑的反應(yīng)性明顯降低的情況下，測定該降低狀態(tài)時，優(yōu)選加入超過上述濃度的血小板活化試劑進行測定。從流入口 106導(dǎo)入并經(jīng)過流路101的血液，經(jīng)過流路分隔部103，產(chǎn)生剪切應(yīng)力，增強血小板活化，在血小板易粘附面(膠原蛋白涂覆部)上粘著積聚。由此，由于血液的流入壓力上升，通過檢測血液的流入壓力可對血液中含有的血小板功能進行評價。此外，觀測經(jīng)過流路分隔部103的血液的流速或性狀，可進行血小板功能檢測。 此外，血液樣品中的雜質(zhì)殘留在防雜質(zhì)流入部105，不會流入流路分隔部103，因此不會妨礙血小板凝集反應(yīng)。供檢測的血液從設(shè)置在流路101終端的排出口 107排出。然后，對使用微芯片I的本發(fā)明的血小板檢測裝置進行說明。圖2為本發(fā)明的血小板檢測裝置的第一實施方式的血小板檢測裝置A的示意圖，所述血小板檢測裝置由透明基板構(gòu)成的微芯片I而組裝。以下，基于圖2對第一實施方式進行說明。微芯片I的流入口 106連接有倒置的容納經(jīng)抗凝處理的血液的儲存器109 (血液收容部)，該儲存器109連接有供給礦物油的輸液泵111。輸液泵111連接有未圖示的壓力傳感器。這樣，礦物油從輸液泵111壓入儲存器109內(nèi)，層疊在血液上，將血液壓出到微芯片I的流路101內(nèi)。血液經(jīng)過流路101,到達具有血小板易粘附面108的流路分隔部103。另一方面，血液樣品中的雜質(zhì)殘留在防雜質(zhì)流入部105。通過輸液泵111上連接的壓力傳感器測定流入壓力可定量檢測血小板功能。此夕卜，通過攝像機113觀察在流路分隔部103中的血小板活化(血小板的粘著、凝集等)或伴隨上述情況的毛細(xì)管堵塞，可進行血小板功能檢測。進一步地，通過測定血液經(jīng)過流路101的經(jīng)過時間或經(jīng)過量，可進行血小板功能檢測。攝像機113連接有圖像分析裝置115，通過該裝置可將血小板活化的狀態(tài)成像。將通過拍攝內(nèi)部血小板活化的視覺評價及通過壓力上升對血小板活化的定量檢測組合使用，對患者血液的狀態(tài)進行綜合判斷是非常重要的。例如，在DIC等病變中，血小板在生物體內(nèi)已經(jīng)受到活化的同時血小板消耗而顯著減少的情況下，壓力上升或堵塞時間延遲。即使在上述情況下，通過攝像機拍攝內(nèi)部也可從檢測剛開始后立即確認(rèn)血小板向血小板易粘附面(膠原蛋白涂覆部)的粘著和凝集的上升等，可綜合判斷患者血小板的狀態(tài)。攝像機113也可沿著流路101的血流方向移動。此外，通過奎納克林等對血小板進行熒光標(biāo)記后分析血小板，該情況下，通過分析圖像因發(fā)射熒光的單位面積的亮度進行觀測，由此使觀測結(jié)果數(shù)值化，可獲得作為數(shù)據(jù)的觀測結(jié)果。此外，將微芯片I置于平臺狀的加熱器11 2上，通過加熱器112加熱至37°C，可在近似于生物體內(nèi)的條件下進行測定。經(jīng)過流路分隔部103的血液混合液可從排出口 107經(jīng)排出管114平穩(wěn)排出。實施例以下，通過列舉具體的實施例對本發(fā)明進行進一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明不限于下述實施例。(微芯片和血小板功能檢測裝置的制造)準(zhǔn)備兩塊透明基板圖I (A)所示的第一基板100和圖I (B)所示的第二基板110(株式會社U ★二 >制造的注射成型產(chǎn)品)。在第一基板100中，流路101的長度為20mm、深度為40 u m、寬度為2mm ;對于流路分隔部103，長度I. 5mm、寬度40 y m、高度40 y m的流路分隔壁102以40 y m為間隔等間隔設(shè)置，這部分形成流路分隔部103。進一步地，距離第一端部7. 5mm的位置以lOOym為間隔設(shè)置有13根直徑為50 ii m的圓柱，形成防雜質(zhì)流入部105。此外，將流路分隔部103置于々二 ” ^株式會社PS-601SW型常壓等離子體輻射表面改性裝置中，輻射探頭設(shè)置在3. 5mm的高度，使用傳送裝置(12. 5mm/秒)進行4次等離子體輻射處理；以及通過七 >特殊光源株式會社制造的PL2002N-18型光表面處理裝置在距離紫外燈30mm的位置進行5分鐘的紫外線照射。將未處理、等離子體處理后、紫外線照射處理后,通過Zygo社制造的NewView6200型非接觸表面形狀測定儀分析各自的梳狀區(qū)域的平滑性，結(jié)果如表I所示。表I
~PV~Ra
處理前20. 75 27&2
等離子體處理后 181.21 35. 56~
紫外線照射后105.28 102~PV :0. 14X0. 105mm中最大與最小的差值(單位nm)Ra :距離平均的高度偏離(平均分6 ^高怒^解離)/測定點數(shù)(單位nm)通過以上等離子體處理、UV照射處理可形成IOlOOnm水平上的表面粗糙度。此外，下述的實驗中，使用流路分隔部經(jīng)如下處理的微芯片進行等離子體處理的微芯片、紫外線照射處理的微芯片及未處理的微芯片。第二基板100中，流入口 106和排出口 107所形成的孔為內(nèi)徑2mm、深2mm的圓形橫截面的通孔。此外，在第二基板110與第一基板100的流路分隔部103重合的位置上，涂布0. 75mg/mL的I型膠原蛋白(新田七’十 >制造)，再經(jīng)真空干燥，得到血小板易粘附面108。使構(gòu)成第一基板100的流路101的溝槽的開口面與第二基板110的具有血小板易粘附面108的面相對，通過硅烷偶聯(lián)劑，在60°C進行3小時的熱壓貼合，制成圖I (C)所示的微芯片I。如圖2，將制造的微芯片I置于平臺狀的加熱器112(加熱至37°C)上，微芯片I的流入口 106與儲存器109連接，儲存器109通過導(dǎo)管與泵111連接，施加于泵的壓力用未圖示的壓力傳感器進行測定。排出口與排出管114連接，完成分析后的血液可由此排出。此夕卜，在微芯片I的流路分隔部103的上方設(shè)置有連接了圖像分析裝置115的攝像機113，由此可觀察到流路分隔部103中血小板活化的狀態(tài)。試驗例I、2和比較例I從健康正常人采集的血液經(jīng)水蛭素(25 y g/mL)進行抗凝處理。該經(jīng)抗凝處理的血液流經(jīng)等離子體處理的微芯片(試驗例I)、紫外線照射的微芯片(試驗例2)和未處理的微芯片(比較例I)的流路。具體而言，儲存器109中填充有經(jīng)抗凝處理的血液，泵111中填充有礦物油，泵111與儲存器109連接，儲存器109的下端與微芯片I的流入口 106連接。以18 ii L/分鐘的流速，從泵111將礦物油向儲存器中注入，層疊在血液上，儲存器內(nèi)的血液 以同樣的流速壓出后注入微芯片1，通過未圖示的壓力傳感器對礦物油的流入壓力(即，血液的流入壓力)分別進行了 3次測定。結(jié)果分別如圖4A、4B和4C所示。相比于流路分隔部未經(jīng)處理的微芯片(圖4C)，經(jīng)等離子體處理的微芯片(圖4A)、紫外線處理的微芯片(圖4B)可促使穩(wěn)定的壓力上升，此外壓力曲線(pattern)的波動小?？赏茰y流路分隔部經(jīng)等離子體處理和紫外線照射處理可成為提高血小板凝集塊粘附性的原因。試驗例3
服用阿司匹林IOOmg前后進行樣本采血，得到的血液經(jīng)水蛭素(25 U g/mL)進行抗凝處理。該經(jīng)抗凝處理的血液流過流路分隔部經(jīng)等離子體處理的微芯片的流路。具體而言，儲存器109中填充有經(jīng)抗凝處理的血液(服用阿司匹林IOOmg前后)，泵111中填充有礦物油，泵111與儲存器109連接，儲存器109的下端與微芯片I的流入口 106連接。以27iiL/分鐘和L/分鐘的流速，從泵111將礦物油向儲存器中注入，層疊在血液上，儲存器內(nèi)的血液以同樣的流速壓出后注入微芯片1，通過未圖示的壓力傳感器測定礦物油的流入壓力(即，血液的流入壓力)。比較例2除了使用流路分隔部未經(jīng)等離子體處理的微芯片以外，與試驗例3進行同樣的操作，測定礦物油的流入壓力。試驗例3和比較例2的結(jié)果分別如圖5和圖6所示。使用流路分隔部未經(jīng)等離子體處理的微芯片的情況下，壓力上升不充分，導(dǎo)致幾乎不能判斷阿司匹林的效果。與此相t匕，使用流路分隔部經(jīng)等離子體處理的微芯片的情況下，可引起低流速下約50kPa的壓力上升、高流速下約SOkPa的壓力上升，可充分判斷阿司匹林的效果。根據(jù)上述內(nèi)容，通過等離子體輻射，可在進一步引起高的壓力上升的高流速條件下進一步分析血小板凝集塊的穩(wěn)定性。發(fā)現(xiàn)具有抗血小板作用的阿司匹林可降低血小板凝集塊的形成速度，而不是降低所形成的血小板凝集塊的穩(wěn)定性。工業(yè)實用性
通過本發(fā)明的微芯片，可使用微量血液檢測血液的血小板功能,可應(yīng)用于醫(yī)療、診斷、檢測、研究等領(lǐng)域。
附圖標(biāo)記說明A :血小板檢測裝置;1、2 :微芯片;100、200 :第一基板;101、201 :流路；102、202 流路分隔壁；103、203 :流路分隔部;104、204 :柱狀體;105、205 :防雜質(zhì)流入部;106、206 流入口 ；107 :排出口 ；207 :廢液儲存部；108、208 :血小板易粘附面(膠原蛋白涂覆部)；109 儲存器:209 :空氣孔(排出口);110、210 :第二基板；111 :泵；112 :加熱器；113 :攝像機；114:排出管；115:圖像分析裝置。
權(quán)利要求
1.一種微芯片，其特征在于，所述微芯片是通過血液在流路中流動以誘導(dǎo)血小板凝集而測定血小板功能的微芯片，所述微芯片具有設(shè)置在內(nèi)部的流路，為了與血小板粘附，所述流路中至少局部涂覆有膠原蛋白，多個壁沿著所述流路中血液流動的方向延伸且將所述流路的寬度分隔形成流路分隔部，對所述壁施予表面粗糙度(Ra)變成IOlOOnm的處理。
2.如權(quán)利要求I所述的微芯片，其中，所述表面粗糙度(Ra)變成IOlOOnm的處理通過等離子體輻射或紫外線照射進行。
3.如權(quán)利要求I或2所述的微芯片，其特征在于，所述流路中，所述流路分隔部以外部分的表面粗糙度不到10nm。
4.如權(quán)利要求廣3中任意一項所述的微芯片，其中，血液在所述流路中以一定速度流動使得形成血小板凝集塊的同時測定血液的流入壓力時，所述微芯片的耐壓性為SOkPa以上。
5.如權(quán)利要求廣4中任意一項所述的微芯片，其特征在于，所述流路分隔部的上游進一步設(shè)置有防雜質(zhì)流入部。
6.一種包含權(quán)利要求廣5中任意一項所述微芯片的血小板功能檢測裝置。
7.如權(quán)利要求6所述的血小板功能檢測裝置，其中，所述血小板功能檢測裝置進一步裝配有 用于收容血液的容器； 用于將血液從所述容器輸液至微芯片內(nèi)的流路的輸液泵；以及 測定施加于所述泵的壓力的壓力傳感器。
8.如權(quán)利要求6或7所述的血小板功能檢測裝置，其中，所述血小板功能檢測裝置裝配有廢液儲存部，所述廢液儲存部位于微芯片內(nèi)部的膠原蛋白涂覆部的下游，用于儲存經(jīng)過所述膠原蛋白涂覆部的血液廢液。
9.一種血小板功能檢測方法，其特征在于，通過使血液經(jīng)過權(quán)利要求I飛中任意一項所述的微芯片或權(quán)利要求61中任意一項所述的血小板功能檢測裝置的流路，在所述流路分隔部和所述膠原蛋白涂覆部中引起血小板凝集的同時，測定所述血液流向所述流路的流入壓力，由此檢測血小板的功能。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供一種微芯片，其特征在于，所述微芯片是通過血液在流路中流動以誘導(dǎo)血小板凝集而測定血小板功能的微芯片，所述微芯片具有設(shè)置在內(nèi)部的流路，為了與血小板粘附，所述流路中至少局部涂覆有膠原蛋白，多個壁沿著所述流路中血液流動的方向延伸且將所述流路的寬度分隔形成流路分隔部，對所述壁施予表面粗糙度(Ra)變成10~200nm的處理。
文檔編號G01N33/49GK102762991SQ201180008579
公開日2012年10月31日 申請日期2011年2月10日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月10日
發(fā)明者和田朋子, 寺田真紀(jì), 深澤征司, 細(xì)川和也, 近藤太郎 申請人:藤森工業(yè)株式會社