專利名稱：在無癥狀患者中基于il-6檢測的全身炎性應(yīng)答綜合征和敗血癥的早期診斷和預(yù)測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在無癥狀患者中，優(yōu)選地在接受手術(shù)介入的患者中使用11-6作為診斷性和預(yù)測性生物標(biāo)志物對全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)或敗血癥的早期診斷和預(yù)測的技術(shù)領(lǐng)域。還提供了相應(yīng)的療法監(jiān)測和死亡率預(yù)測方法、部分的試劑盒。盡管現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有所進(jìn)展，SIRS和敗血癥仍代表在世界范圍內(nèi)頻率增加的常見且災(zāi)難性的綜合征。其屬于重癥護理患者中最常見的死因。 流行病學(xué)評價發(fā)現(xiàn)，可描述定義處于發(fā)展出敗血癥和嚴(yán)重敗血癥的風(fēng)險的患者的大量病況。被描述的風(fēng)險因素是性別(男)、種族(黑)、人種(西班牙裔(Hispanic))、高齡和下述共病(co-morbidities):糖尿病、惡性腫瘤、醇中毒、HIV感染、用免疫抑制性試劑治療(Hodgin KE,Moss M. The epidemiology of Sepsis. Current Pharm Design 2008 ; 14 :1833-1839)。此外，實際的事件，例如導(dǎo)致大面積傷口的大手術(shù)、創(chuàng)傷或燒傷代表了額外的風(fēng)險。沒有感染的SIRS可在例如胰腺炎、休克、局部缺血和多器官損傷等事件中發(fā)生。從1991 年起 American College of Chest Physicians (ACCP)和 Society ofCritical Care Medicine(SCCM)提供了定義對感染的全身炎性應(yīng)答的概念和實踐框架(American College of Chest Physicians/Society of Critical Care MedicineConsensus Conference definitions for sepsis and organ failure and guidelinesfor the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med. 1992Jun ；20(6)864-74)。之前，多種術(shù)語可互換使用，導(dǎo)致很多混亂。該會議的主要貢獻(xiàn)是發(fā)展了對于敗血癥多個階段的統(tǒng)一定義，這可普適地并且統(tǒng)一地應(yīng)用于罹患這些病癥的患者。在出現(xiàn)臨床征兆的時間點時，已經(jīng)開始了 SIRS的發(fā)展和惡化。IL-6屬于gpl30細(xì)胞因子的家族。所有家族成員共享四螺旋蛋白結(jié)構(gòu)，并且它們經(jīng)由含有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體糖蛋白gpl30的至少一個亞單位的受體復(fù)合體施加它們的信號。IL-6首先與IL-6受體(IL-6R)結(jié)合，并且該IL-6/IL-6R復(fù)合體與gpl30結(jié)合，導(dǎo)致同源二聚化以及隨后的Jak/Stat-和Ras/Map/Akt-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的活化(Taga T, KishimotoT. Gpl30and the Interleukin-6 Family of Cytokines. Annu. Rev. Immunol. 1997 ；15 797-819 ；Drucker C, Gewiese J, Malchow S, Scheller J, Rose-John S. Impact ofInterleukin-6 Classic—and Trans-signaling on Liver Damage and Regeneration. JAutimm 2009,印制中)。描述了兩種不同的信號途徑，一種中IL-6與膜結(jié)合的IL-6受體結(jié)合，這導(dǎo)致二聚化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白gpl3的活化。該途徑限于在其表面表達(dá)IL-6受體的細(xì)胞，這僅是一些細(xì)胞群中的情況。然而，存在備選的途徑，其中IL-6與天然存在的可溶IL-6R(sIL-6R)結(jié)合，并且該IL-6/sIL-6R復(fù)合體活化gpl30。以這種方式，缺少膜結(jié)合的IL-6-受體的細(xì)胞可應(yīng)答IL-6。第二種所謂的轉(zhuǎn)信號途徑也影響表達(dá)膜結(jié)合的IL-6受體的細(xì)胞，例如肝細(xì)胞。在該情況中，IL-6轉(zhuǎn)信號的活化可增強IL-6的刺激效果。1988年，提出命名細(xì)胞因子IL-6，因為進(jìn)一步的研究表明，該蛋白不僅在B-細(xì)胞上顯示活性，還在T-細(xì)胞、造血干細(xì)胞、肝細(xì)胞和腦細(xì)胞上顯示活性(Kishimoto T,Hirano T. A New Interleukinwith Pleitropic Activities. Bio Essays 1988Jul ；9(I) :11-15)。已經(jīng)在1989年報道，具有局部急性感染的患者的體液和具有革蘭氏陰性和革蘭氏陽性菌血癥的患者的血清含有升高的水平的生物活性的IL-6。假設(shè)急性感染期間IL-6在血清中的存在提示該細(xì)胞因子可能參與幫助限制組織損傷的局部和全身性事件的級聯(lián)(Helfgott DC, Tatter SB, Santhanam U，Clarick RH, Bhardwaj N, May LT,Sehgal PB. Multiple Forms of IFN-^ 2/IL-6 in Serum and Body Fluids during AcuteBacterial Infection. J Immuology 1989;142:948-953.)。對I⑶(重癥護理單元)接受的已有敗血癥臨床征兆的患者的血清或血漿中IL-6的依序測量顯示出其在評價SIRS(全身炎性應(yīng)答綜合征)、敗血癥和膿毒性休克的嚴(yán)重性以及預(yù)測這些患者的后果中是有用的(Pinsky MR, Vincent JL,Alegre M,Dupont E. SerumCytokine Levels in Human Septic Shock. Relation to Multiple Organ Failure and Mortality. Chest 1993 ; 103 :565-575 ;0da S,Hirasawa H,Shiga H,Nakanishi K,MatsudaK, Nakamura M. Sequential measurements of IL-6 blood levels in patients withSIRS/sepsis. Cytokine 2005 ;29 :169-175 ;Marti L, Cervera C, Filella X, Marin JL,Almela M, Moreno A. Cytokine-release patterns in elderly patients with systemicinflammatory response syndrome. Gerontology. 2007 ；53 (5) :239-44)。Mokart D等(Br J Anaesth. 2005Jun ；94(6) :767-7)公開了基于在接受癌癥手術(shù)的患者中的PCT和IL-6檢測，其中IL-6是在手術(shù)之前的早晨以及手術(shù)后的早晨取樣的，即，以超過至少20小時的時間間隔取樣。基于PCT和IL-6，使用測量來預(yù)測展示出SIRS及手術(shù)后第I天的患者中的敗血癥，即，IL-6水平不允許在手術(shù)后第I天沒有展示出SIRS癥狀的患者中診斷或預(yù)測罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險。Mokart D 等(World J Surgery，2009，33 :558-566)公開了基于 IL-6 和 PCT 的、基于每日一次收集的血樣品鑒定處于發(fā)展出敗血癥的風(fēng)險的患者的方法。總而言之，上述公開內(nèi)容均不允許在SIRS和敗血癥的一般認(rèn)可的臨床征兆和癥狀發(fā)作之前(即，在無癥狀患者中)診斷SIRS和敗血癥，或者預(yù)測罹患或發(fā)展出SIRS和敗血癥的風(fēng)險。因此，需要這樣的診斷方法和治療監(jiān)測方法，它們允許在SIRS的臨床征兆和癥狀發(fā)作之前靈敏且早期地檢測SIRS或敗血癥以及預(yù)測罹患或發(fā)展出SIRS和敗血癥的風(fēng)險。因此，本發(fā)明的目的之一在于提供解決至少一些迄今已知的診斷SIRS和敗血癥的方式的缺點的工具和方法。此外，目的是提供方法和治療檢測方法，其二者允許在臨床癥狀發(fā)作之前早期檢測罹患或發(fā)展出SIRS和敗血癥的風(fēng)險。還有一個目的是提供適于進(jìn)行這些方法的試劑盒和計算機程序。
發(fā)明總結(jié)通過提供權(quán)利要求和下文中定義的主體來完成下述目的中的至少一種。在第一個方面，提供了在無癥狀患者中檢測或診斷全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)或敗血癥、或檢測或診斷發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險的方法，所述方法包括下述步驟a)在來自患者的樣品中測定IL-6或其變體的水平；
b)將步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平與參照水平相比較；c)檢測或診斷SIRS，或者檢測或診斷發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險；其中以短間隔至少兩次分離樣品，并且針對每份樣品重復(fù)步驟a)和b)。還提供了在無癥狀患者中檢測IL-6水平以檢測或診斷發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險的方法，所述方法包括下述步驟a)在來自患者的樣品中測定IL-6或其變體的水平；以及b)將步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平與參照水平相比較；優(yōu)選地基于比較檢測或診斷患者是否處于發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險；其中以短間隔至少兩次分離樣品，并且針對每份樣品重復(fù)步驟a)和b)。還提供了在無癥狀患者中檢測或診斷發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險的方 法，所述患者是選自創(chuàng)傷患者、具有燒傷的患者、接受侵入性治療的患者、接受手術(shù)的患者的患者，所述方法包括下述步驟a)在來自患者的樣品中測定IL-6或其變體的水平；b)將步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平與參照水平相比較；c)檢測或診斷SIRS，或者檢測或診斷發(fā)展出或罹患SIRS的風(fēng)險；其中以短間隔至少兩次分離樣品，并且針對每份樣品重復(fù)步驟a)和b)，優(yōu)選地，在接收患者時分離至少一份樣品，以及在已啟動或終止治療后分離至少一份樣品。例如，如果無癥狀患者將接受侵入性治療，則在手術(shù)介入之前分離至少一份樣品，或者以獲得基線11-6水平，然后在完成侵入性治療之后以短間隔分離至少另一份樣品，以及針對IL-6水平加以分析。優(yōu)選地，使用IL-6或檢測IL-6的工具在無癥狀患者中檢測或診斷發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險，其中以短間隔測定IL-6的水平至少2次。出乎本發(fā)明人意料，本發(fā)明的方法顯示，對IL-6的密篩式連續(xù)測量，優(yōu)選地在治療(例如與導(dǎo)致SIRS或敗血癥的顯著風(fēng)險相關(guān)的療法，例如大手術(shù))前開始，允許在臨床征兆或傳統(tǒng)用于診斷SIRS/敗血癥的實驗室參數(shù)的病理性改變(見例如實施例)發(fā)作前良久就清楚鑒定出處于罹患或發(fā)展出SIRS(包括敗血癥)的風(fēng)險中的無癥狀患者。具體地，本發(fā)明首次描述了無癥狀患者中的IL-6動力學(xué)，其中一些可被鑒定為發(fā)展出SIRS。發(fā)現(xiàn)在展示出支持SIRS和敗血癥診斷的臨床癥狀或征兆之前良久，較之基線水平，IL濃度的大幅上升指示發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的高風(fēng)險。因此，與此前已知的相反，并非分析樣品中IL-6的絕對水平，對罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的風(fēng)險的診斷基本上基于測定IL-6水平隨時間的增加。由于本發(fā)明的方法在出現(xiàn)SIRS和敗血癥的臨床征兆和癥狀之前的早期應(yīng)答性質(zhì)，較之迄今已知的診斷SIRS和敗血癥的方法，現(xiàn)可在較早的時間點啟動合適的治療。因此，成功治療SIRS和預(yù)防SIRS或敗血癥的可能性增加，并且可將患者從SIRS或敗血癥導(dǎo)致的死亡中拯救出來。在本文中使用時，術(shù)語“全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)”是技術(shù)人員通常已知的。該術(shù)語優(yōu)選涵蓋如 ACCP/SCCM Consensus Conference Definitions (1992/2003)定義的 SIRS(見例如 American College of Chest Physicians/Society of Critical CareMedicine Consensus Conference definitions tor sepsis and organ failure andguidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med. 1992Jun ；20 (6) :864-74))。優(yōu)選地,如果患者展示出下述a)至d),優(yōu)選地,下述a)至e)中的至少兩種癥狀，則認(rèn)為患者罹患SIRS a)白血細(xì)胞計數(shù)(WBC) >約 12，000/ U /L 或<約 4000/ U /L，b)體溫 > 約 38 °C 或 < 約 36 °Cc)心率>約90次跳動/分鐘d)呼吸速率>約20次呼吸/分鐘或CO2分壓低于約32mmHg，和e)在計數(shù)的白血細(xì)胞中超過10%的未成熟白血細(xì)胞。白血細(xì)胞計數(shù)通常是通過自動計數(shù)設(shè)備測定的。
當(dāng)考慮到兒童時，用于診斷兒童中SIRS的共有標(biāo)準(zhǔn)被公開于Goldstein等(Pediatr. Crit Care Med 2005，6 (I)，2_8，特別見表2和3)中。在本發(fā)明意義中，無癥狀兒童患者是展示出Goldstein等人(見上文，其通過引用并入本文)中描述的那些癥狀中少于2項、優(yōu)選少于I項的患者。優(yōu)選地，基于在患者樣品中檢測到的高于參照水平的IL-6水平來診斷或檢測罹患或發(fā)展出SIRS的風(fēng)險。在該情況下，優(yōu)選地?zé)o須對展示出上述SIRS癥狀(a)至(e)中至少兩項的患者診斷或檢測罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的風(fēng)險。優(yōu)選地，可僅基于測定到的高于參照水平的IL-6水平，來診斷或檢測罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的風(fēng)險。優(yōu)選地，參照值是通過用在給定的患者中較早測定的IL-6水平(例如基線IL-6水平)乘以本文其它地方定義的因子(例如，至少約50、或者至少約100、或者至少約500或至少大約1000的因子)來測定的。在收集較早的樣品(其優(yōu)選提供基線水平)之后，在從給定的患者中分離的樣品中測定的任何IL-6水平高于參照水平則指示患者處于發(fā)展出或罹患SIRS的高風(fēng)險中。本發(fā)明人令人吃驚地揭示，基于IL-6測定，早期檢測和診斷出罹患或發(fā)展出SIRS的風(fēng)險是可能的，優(yōu)選地，在患者展示出上述SIRS癥狀(a)至(e)中的兩種或更多種之前。當(dāng)患者額外展示出被診斷的感染時，認(rèn)為患者處于發(fā)展出或罹患敗血癥的風(fēng)險。在本文中使用時，上文中針對“SIRS”提到的診斷標(biāo)準(zhǔn)經(jīng)必要修正也適用于“敗血癥”，但是，在敗血癥中，被診斷的感染是必要的額外診斷參數(shù)。用于檢測或診斷感染的方法是本領(lǐng)域通常已知的。作為本發(fā)明的結(jié)果，現(xiàn)可優(yōu)選地基于僅兩個參數(shù)，即，高于參照水平的IL-6的水平和被診斷的感染，來檢測或診斷罹患或發(fā)展出敗血癥的風(fēng)險。在本發(fā)明的意義中，“感染”優(yōu)選是病毒、真菌或細(xì)菌感染，優(yōu)選是與選自大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鏈球菌或銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeroginosa)的細(xì)菌相關(guān)的細(xì)菌感染。感染還可以是通過選自白色念珠菌(Candida albicans)、熱帶念珠菌(Candida tropicalis)或煙曲霉(Aspergillus fumigatus)的真菌的感染?；卺t(yī)師通常已知的測定和標(biāo)準(zhǔn)來診斷感染。優(yōu)選地，基于細(xì)菌培養(yǎng)測定(例如用來自患者的樣品接種的培養(yǎng)基)，或者基于分子診斷方法，來診斷感染。真菌感染例如可基于通常已知的測試測定(例如Septifast)來測定。術(shù)語“患者”在本文中使用時指動物，優(yōu)選是哺乳動物，優(yōu)選是狗、貓、馬、牛，最優(yōu)選是人，優(yōu)選是男性或女性，優(yōu)選是出生前(prenatal)、圍產(chǎn)期(perinatal)、出生后(postnatal)和新生(neonatal)兒童。優(yōu)選地,患者是成人。優(yōu)選地，患者不是出生前、圍產(chǎn)期、出生后的和新生兒童。在本文中使用時，表達(dá)法“無癥狀患者”表示涵蓋不展示出通常被認(rèn)為建立了 SIRS診斷的臨床征兆和癥狀的患者。優(yōu)選地，無癥狀患者展示出少于2種、優(yōu)選地少于I種下述中的癥狀a)白血細(xì)胞計數(shù)(WBC) >約 12，000/ U /L 或<約 4000/ U /L，b)體溫 > 約 38 °C 或 < 約 36 °C，c)心率>約90次跳動/分鐘，d)呼吸速率>約20次呼吸/分鐘或CO2分壓低于約32mmHg，和e)在計數(shù)的白血細(xì)胞中超過10%的未成熟白血細(xì)胞。優(yōu)選地,無癥狀患者包括下述患者,所述患者選自創(chuàng)傷患者、具有燒傷的患者、接 受侵入性治療的患者、接受手術(shù)介入(優(yōu)選地，選自內(nèi)窺鏡介入的手術(shù)介入，或選自CT-掃描或PET-CT掃描的結(jié)果)的患者，或處于發(fā)展出SIRS或敗血癥風(fēng)險的患者，例如達(dá)到下述標(biāo)準(zhǔn)中至少一種的患者-敗血癥的遺傳傾向，-早熟(圍產(chǎn)期或新生)或老年，-性別是男性，-人種是非洲裔美國人，-醫(yī)療共病，包括慢性疾病(例如糖尿病、充血性心力衰竭)，已存在的器官機能障礙(例如肝硬化或腎衰竭)，身體或精神損傷，-之前的臨床介入(例如大手術(shù)、氣管內(nèi)插管、抗生素)，和-社會,宗教或文化因素；上述所有標(biāo)準(zhǔn)均在Marshall JC, " Predisposition to Sepsis "，Anaesthesia，Pain，Intensive Care and Emergency A. P. I. C. E. , Springer Verlag，ISBN88-470-0772-0中被進(jìn)一步詳細(xì)描述。通常已知，當(dāng)實踐本發(fā)明時可優(yōu)選考慮這些因素。任選地，本發(fā)明的無癥狀患者排除IL-6代謝受損的患者，例如其中經(jīng)由內(nèi)臟和腎器官的 IL-6 清除受損的患者(Garibotta 等(Cytokine, 2007, 37, 51-54))。在本發(fā)明的上下文中，“白介素-6(IL_6) ”優(yōu)選表示涵蓋IL-6，如本領(lǐng)域所已知
的那樣。優(yōu)選地，IL-6包括干擾素f22，漿細(xì)胞瘤生長因子、肝細(xì)胞刺激因子和人B-細(xì)
胞刺激因子2(BSF2)。IL-6優(yōu)選是從編碼212個氨基酸的產(chǎn)物、更優(yōu)選地在212個氨基酸的肽的N-末端切割的184個氨基酸的IL-6肽的單個基因產(chǎn)生的蛋白(見Song M，Kellum JA. Interleukin-6. Crit Care Med 2005 ；33 (Suppll2) :463-465 和 212 個氨基酸長的IL-6前體的NCBI序列，檢錄號NP—000591)。優(yōu)選地，IL-6涵蓋不結(jié)合其受體IL-6R的游離IL-6。此外，IL-6還可涵蓋處于IL-6/IL-6R復(fù)合體狀態(tài)中的IL-6(見Taga T，Kishimoto T.Gpl30 and the Interleukin_6Family of Cytokines. Annu. Rev.Immunol. 1997 ；15 :797-819 ；Drucker C，Gewiese J，Malchow S，Scheller J，Rose-JohnS. Impact of Interleukin-6Classic_and Trans-signaling on Liver Damage andRegeneration. J Autimm 2009，印制中) 優(yōu)選地，IL-6是可被或被單克隆抗IL-6抗體M-BE8(如EP0430193中定義的，即，由細(xì)胞系BE-8產(chǎn)生的抗體，或如KLEIN，B.，等1991，Murine anti-interIeukin 6 monoclonal antibody therapy for a patient with plasmacell leukemia，Blood 78,1 198-1204 中定義的)或 M-23C7 結(jié)合的 IL-6 蛋白。優(yōu)選地，IL-6是可被或被用于Elecsys和cobas免疫測定系統(tǒng)(Roche)的Roche的IL測定的抗體結(jié)合的IL-6。術(shù)語IL-6還優(yōu)選地涵蓋前述IL-6的變體，優(yōu)選地是人IL-6的變體。變體涵蓋與特定的參照IL-6分子(優(yōu)選與人IL-6)基本相似的蛋白或肽。術(shù)語基本相似是本領(lǐng)域技術(shù)人員很好理解的。特別地，IL-6變體可以是較之特定的參照IL-6分子的氨基酸序列顯示出至少一個氨基酸交換(優(yōu)選至多約25個，更優(yōu)選至多約15個，更優(yōu)選至多約10個，更優(yōu)選至多約5個，最優(yōu)選至多約3個氨基酸交換)的同工型或等位基因變體。優(yōu)選地，此類IL-6變體具有與特定的參照IL-6分子有至少大約80%，優(yōu)選至少大約85%，更優(yōu)選至少大約90%，最優(yōu)選至少大約95%，最優(yōu)選至少大約98%的序列同一性，優(yōu)選地相對于人IL-6，甚至更優(yōu)選地在人IL-6的全長上。兩條氨基酸序列間的同一性程度可通過本領(lǐng)域公知的算法來測定。優(yōu)選地，同一性程度是通過在比較窗上比較兩條被最優(yōu)比對的序列來測定的，其中，為了最優(yōu)比對，較之不包含添加或缺失的參照序列，在比較窗中的氨基酸序列的片段可包含添加或缺失(例如空位或突出端)。百分比是通過這樣來計算的測定兩條序列中出現(xiàn)相同氨基酸殘基的位置數(shù)目以產(chǎn)生匹配的位置的數(shù)目，用匹配的位置數(shù)目除以比較窗中的位置總數(shù)，并將結(jié)果乘以100，以產(chǎn)生序列同一性百分比。對用于比較 的序列的最優(yōu)比對可通過Smith and Waterman Add. APL. Math. 2 :482 (1981)的局部同源性算法，通過Needleman and Wunsch J. Mol. Biol. 48 :443 (1970)的同源性比對算法，通過Pearson and Lipman Proc. Natl. Acad Sci. (USA) 85 :2444 (1988)的相似性搜索方法，通過這些算法的計算機化實施(Wisconsin Genetics軟件包中的GAP、BESTFIT、BLAST、PASTA和 TFASTA, Genetics Computer Group (GCG), 575Science Dr. , Madison, WI),或通過視覺觀察來進(jìn)行。假定已鑒定了兩條序列用于比較，優(yōu)選使用GAP和BESTFIT來測定它們的最優(yōu)比對以及因此測定同一性程度。優(yōu)選地，針對空位權(quán)重使用5. 00的默認(rèn)值，針對空位權(quán)重長度使用0. 30的默認(rèn)值。上文提到的變體可以是等位基因變體或者任何其它物種特異性同源體、旁系同源體或直向同源體。表達(dá)法變體還涵蓋仍被診斷工具或由針對各自的全長蛋白或肽的配體識別的降解產(chǎn)物，例如蛋白水解降解產(chǎn)物。術(shù)語“變體”還表示覆蓋剪接變體。術(shù)語“變體”還涉及經(jīng)翻譯后修飾的肽，例如糖基化的肽?！白凅w”還是在收集樣品后經(jīng)修飾的肽，例如通過共價或非共價將標(biāo)記(特別是放射活性或熒光標(biāo)記)連結(jié)至肽來修飾的。優(yōu)選地，IL-6變體具有與特定參照肽基本相同的免疫學(xué)和/或生物學(xué)性質(zhì)，優(yōu)選地，與人IL-6相同的免疫學(xué)和/或生物學(xué)性質(zhì)，最優(yōu)選地，與人IL-6相同的生物學(xué)和/或免疫學(xué)性質(zhì)。優(yōu)選地，IL-6變體展示出人IL-6活性的至少大約70%，優(yōu)選至少大約80%，優(yōu)選至少大約90%，優(yōu)選至少大約95%，優(yōu)選至少大約98%。IL-6活性優(yōu)選是IL-6受體結(jié)合活性(JAL Taga T,Kishimoto T. Gp130 and the Interleukin-6 Family of Cytokines.Annu. Rev. Immunol. 1997 ； 15 :797-819 ；Drucker C, Gewiese J, Malchow S, Scheller J,Rose-John S. Impact of Interleukin-6 Classic- and Trans- signaling on LiverDamage and Regeneration. J Autimm 2009,印制中)。優(yōu)選地，IL-6 變體展不出人 IL-6 的至少大約80%、優(yōu)選至少大約90%、優(yōu)選至少大約95%的人IL-6受體結(jié)合活性。根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，測定指示SIRS或敗血癥的至少一種額外標(biāo)志物或參數(shù)，這包括選自炎性標(biāo)志物例如CRP，另外的白介素例如IL-I和/或IL-8，原降鈣素(procalcitonin),白血細(xì)胞計數(shù),體溫,心率,呼吸速率的至少一種參數(shù),和/或?qū)Ω腥?優(yōu)選地，細(xì)菌和/或真菌感染)的診斷。
此外，除了上文明確提到的那些，本發(fā)明的方法還可包括其它步驟。例如，其它步驟可涉及樣品收集、樣品預(yù)處理或?qū)νㄟ^所述方法獲得的結(jié)果加以評價。本發(fā)明的方法還可用于對發(fā)展出或罹患SIRS進(jìn)行監(jiān)測、驗證、亞分類和風(fēng)險評估以及用于治療性監(jiān)測本發(fā)明的疾病。還考慮到，在優(yōu)選的實施方式中，除了步驟a)中提到的兩個之外，還可測定至少一種額外的標(biāo)志物或參數(shù)，優(yōu)選用于獲得除檢測或診斷SIRS或敗血癥之外的額外診斷信息的目的。此類額外參數(shù)可例如是估計的腎小球濾過率、NGAL或肌酸酐水平，這允許額外診斷患者是否罹患受損的腎清除。所述方法可人工進(jìn)行和/或通過自動化輔助進(jìn)行。優(yōu)選地，步驟(a)、(b)和/或(C)和全部或部分通過自動化輔助進(jìn)行，例如通過用于步驟(a)中的測定的合適的機器人或感知裝備或用于步驟(b)和/(c)中的計算機實施的比較來輔助進(jìn)行。術(shù)語“樣品”指體液樣品、分離的細(xì)胞的樣品或來自組織或器官的樣品。體液樣品可通過公知技術(shù)獲得，其優(yōu)選地包括血液、血漿、血清、液體(liquor)或尿的樣品，更優(yōu)選地包括血液、血漿或血清的樣品。體液樣品優(yōu)選通過靜脈穿刺、動脈穿刺或腦室穿刺獲得。組織或器官樣品可通過例如活組織檢查從任何組織或器官獲得。可通過分離技術(shù)(例如離 心或細(xì)胞分選)從體液或組織或器官獲得分離的細(xì)胞。優(yōu)選地,從表達(dá)或產(chǎn)生本文提到的肽的那些細(xì)胞、組織或器官獲得細(xì)胞、組織或器官的樣品。本發(fā)明的方法可涵蓋收集樣品的步驟，這任選地可以是侵入性的步驟?？赏ㄟ^侵入性的步驟，優(yōu)選地，最小侵入性的步驟，例如通過靜脈穿刺，來收集樣品。最小侵入性收集還涵蓋下述情況，其中通過使用針頭(刺血刀(Iancette))來收集樣品，當(dāng)將其應(yīng)用到皮膚、優(yōu)選是手指皮膚時，引起少量血外流，然后可收集血用于測定樣品中標(biāo)志物的量。優(yōu)選地，通過安全常規(guī)流程，優(yōu)選由無須具有高超醫(yī)療訓(xùn)練的人員以侵入性方式或最小侵入性方式收集樣品，并且，樣品收集優(yōu)選地對接受樣品收集的人來說不造成顯著的健康風(fēng)險。優(yōu)選地，本發(fā)明的方法是離體或體外方法。從患者獲得以短間隔分離的樣品。在本文中使用時，“短間隔”涵蓋從大約15分鐘至大約12小時、優(yōu)選從大約15分鐘至大約6小時、優(yōu)選從大約15分鐘至大約3小時、優(yōu)選從大約I小時至大約12小時、優(yōu)選從大約I小時至大約6小時、優(yōu)選從大約I小時至大約3小時的范圍的間隔。更優(yōu)選地，短間隔是大約15分鐘、優(yōu)選大約30分鐘、優(yōu)選大約I小時、優(yōu)選大約2小時、優(yōu)選大約3小時、優(yōu)選大約4小時、優(yōu)選大約5小時、優(yōu)選大約6小時的間隔。優(yōu)選地，在至多大約10天的時間段、優(yōu)選至多大約7天的時間段、優(yōu)選至多大約5天的時間段、優(yōu)選至多大約3天的時間段，從患者分離樣品。取決于患者的病況和病況發(fā)展，還可進(jìn)一步延長樣品的分離和IL-6檢測，例如，如果患者發(fā)展出SIRS或敗血癥，則取樣可延伸至直到SIRS或敗血癥療法已成功完成或者甚至該時間點后數(shù)日。優(yōu)選地，在進(jìn)行治療前取樣至少大約一次、優(yōu)選至少大約兩次，以及在治療后取樣至少一次、優(yōu)選至少大約兩次。優(yōu)選地，治療是上文定義的侵入性治療。例如，在治療進(jìn)行前，獲取一個或兩個IL-6水平。在治療后，在例如3至10天的時間內(nèi)，以規(guī)律間隔(例如3-6小時)取數(shù)次樣品，其中測定IL-6以及優(yōu)選地還有患者的臨床狀態(tài)。術(shù)語“檢測和診斷SIRS”在本文中使用時表示評估、鑒定、評價或分類無癥狀患者是否罹患SIRS，優(yōu)選地，罹患敗血癥。
術(shù)語“檢測和診斷發(fā)展出或罹患SIRS的風(fēng)險”表示涵蓋在無癥狀患者中預(yù)測在未來的界定的時間窗(預(yù)測窗)內(nèi)發(fā)展出或罹患SIRS (包括敗血癥)的風(fēng)險。預(yù)測窗是這樣的間隔，其中受試者將根據(jù)預(yù)測的概率發(fā)展出SIRS或者任選地將死亡。然而，優(yōu)選地，預(yù)測窗是(i)本發(fā)明的方法已進(jìn)行之后或(ii)獲得了其中檢測到的IL-6水平高于參照水平的第一份樣品之后或(iii)接收患者之后或(iv)已獲得/分離IL-6的第一次基線水平之后或(V)已啟動或終止治療(例如侵入性治療)之后或(vi)已分離了用于測定IL-6水平的第一份治療后樣品之后，至多大約20天，優(yōu)選地至多大約10天，優(yōu)選地至多大約7天，優(yōu)選地至多大約5天，優(yōu)選地至多大約5天，優(yōu)選地至多大約4天，優(yōu)選地至多大約3天，優(yōu)選地至多大約2天的間隔。優(yōu)選地，被鑒定為處于發(fā)展出或罹患SIRS的風(fēng)險的患者具有發(fā)展出或罹患SIRS的高概率。優(yōu)選地，高概率是至少大約30%，優(yōu)選至少大約40%，優(yōu)選至少大約50%，優(yōu)選 至少大約60 %，優(yōu)選至少大約70 %，優(yōu)選至少大約80 %，優(yōu)選至少大約90 %，優(yōu)選至少大約95%。任選地，發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的高概率涵蓋100%的概率，即，患者將發(fā)展出或確實罹患SIRS或敗血癥。備選地，患者具有罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的低概率。優(yōu)選地，低概率是至多大約或低于大約30%，優(yōu)選至多大約20%，優(yōu)選至多大約10%，優(yōu)選至多大約5%。任選地，發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的低概率涵蓋0%的概率，S卩，患者將不會發(fā)展出或者并不罹患SIRS或敗血癥。用于測定罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的％風(fēng)險的方法是通常已知的。優(yōu)選地，在上文提到的預(yù)測窗內(nèi)進(jìn)行％風(fēng)險預(yù)測。優(yōu)選地，發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險程度與檢測的IL-6水平高于參照值的程度相關(guān)。優(yōu)選地，在檢測到的IL-6水平低于參照水平的情況下，發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險低。優(yōu)選地，在檢測到的IL-6水平等于或高于參照值的情況下，發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險高。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，此類評估通常不旨在對100%待分析的受試者來說都是正確的。但是該術(shù)語需要評估對于待分析受試者中的統(tǒng)計顯著部分來說有效。一部分是否統(tǒng)計顯著可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用多種公知統(tǒng)計學(xué)評價工具來確定而不費周折，所述評價工具例如，測定置信區(qū)間，P值測定，學(xué)生t-檢驗,Mann-Whitney檢驗等等。細(xì)節(jié)可見Dowdy and Wearden,Statistics for Research, John Wiley & Sons, New York 1983。優(yōu)選的置信區(qū)間是至少90 %，至少95 %，至少97 %，至少98 %或至少99 %。p值優(yōu)選是0. I、0. 05,0. 01,0. 005或0. 0001。優(yōu)選地，本發(fā)明設(shè)想的概率允許預(yù)測對于給定的受試者群體中優(yōu)選至少60%、至少70%、至少80%或至少90%來說是正確的。根據(jù)本發(fā)明測定IL-6或其變體的水平，或任何其它蛋白性的生物標(biāo)志物的水平涉及測量量或濃度，優(yōu)選地，半定量或定量進(jìn)行。測量可直接或間接進(jìn)行。直接測量涉及基于從肽或多肽自身獲得的信號及與樣品中存在的肽分子的數(shù)目直接相關(guān)的信號的強度來測量肽或多肽的量或濃度。例如可通過測量肽或多肽的特異性物理或化學(xué)性質(zhì)的強度值，來獲得此類信號(一些時候在本文中稱為強度信號)。間接測量包括測量從次級組分(即不是肽或多肽自身的組分)或生物讀出系統(tǒng)獲得的信號，例如，可測量的細(xì)胞應(yīng)答、配體、標(biāo)記或酶促反應(yīng)產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明，可通過所有已知的用于測定樣品中肽的量的工具，來實現(xiàn)對IL-6肽或多肽的量的測定。所述工具包括免疫測定設(shè)備和方法，其可在多種夾心式(sandwich)、競爭性或其它測定形式中利用經(jīng)標(biāo)記的分子。所述測定將顯示出指示肽或多肽存在或不存在的信號。此外，信號強度可優(yōu)選地與樣品中存在的多肽的量直接或間接(例如成反比)相關(guān)。其它合適的方法包括測量肽或多肽特異性的物理或化學(xué)性質(zhì)，例如其準(zhǔn)確的分子質(zhì)量或NMR譜。所述方法優(yōu)選包括生物傳感器、與免疫測定偶聯(lián)的光學(xué)設(shè)備、生物芯片、分析設(shè)備例如質(zhì)譜儀、NMR分析儀或色譜設(shè)備。此外，方法包括基于微板ELISA的方法、全自動或機器人免疫測定(例如在Roche' s ElecsysTM分析儀上可獲得)、CBA (酶促鈷結(jié)合測定，例如在Roche-HitachiTM分析儀上可獲得)和乳膠凝聚測定(例如在Roche-HitachiTM分析儀上可獲得)、同質(zhì)和異質(zhì)免疫測定、競爭性和非競爭性免疫測定。優(yōu)選地，測定IL-6肽或多肽的量包括下述步驟(a)將能引發(fā)細(xì)胞應(yīng)答(其強度指示肽或多肽的量)的細(xì)胞與所述肽或多肽接觸足夠的時間段，(b)測量細(xì)胞應(yīng)答。為測量細(xì)胞應(yīng)答，優(yōu)選地，將樣品或經(jīng)處理的樣品添加至細(xì)胞培養(yǎng)物，并且測量內(nèi)部或外部的細(xì)胞應(yīng)答。細(xì)胞應(yīng)答可包括可測量到的報道基因的表達(dá)或者物質(zhì)(例如肽、多肽或小分子)的分泌。表達(dá)或物質(zhì)將生成與肽或多肽的量相關(guān)聯(lián)的強度信號。
測定IL-6肽或多肽的量也優(yōu)選地包括下述步驟測量可從樣品中(優(yōu)選地，選自血液、血清、血漿或液體的樣品中)的肽或多肽獲得的特異性強度信號。如上文所述，此類信號可以是以在對于肽或多肽特異性的質(zhì)譜或NMR譜中觀察到的、對于肽或多肽特異性的m/z變量觀察到的信號強度。測定IL-6肽或多肽的量可優(yōu)選包括下述步驟(a)將肽與特異性配體接觸，(b)(任選地)移除未結(jié)合的配體，(C)測量結(jié)合的配體的量。結(jié)合的配體將生成強度信號。根據(jù)本發(fā)明的結(jié)合包括共價和非共價結(jié)合兩者。根據(jù)本發(fā)明的配體可以是與本文描述的肽或多肽結(jié)合的任何化合物，例如肽、多肽、核酸，或小分子。優(yōu)選的配體包括抗體、核酸、肽或多肽，例如包含11-6肽的結(jié)合結(jié)構(gòu)域的肽或多肽及其片段的受體或結(jié)合搭檔，以及適體，例如核酸或肽適體。制備此類配體的方法是本領(lǐng)域公知的。例如，供應(yīng)商也提供合適的抗體或適體的鑒定和生產(chǎn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟悉開發(fā)具有更高的親和性或特異性的此類配體的衍生物的方法。例如，可向核酸、肽或多肽中引入隨機突變。然后可根據(jù)本領(lǐng)域已知的篩選流程(例如噬菌體展示)以結(jié)合來測試這些衍生物。用于檢測IL-6的工具是本領(lǐng)域中通常已知的，并且優(yōu)選包括抗IL-6抗體，包括多克隆和單克隆抗體及其片段，例如Fv、Fab和F (ab) 2片段，它們能結(jié)合IL-6抗原或半抗原。用于檢測本發(fā)明的IL-6的工具還包括單鏈抗體、嵌合的、人源化雜交抗體，其中表現(xiàn)出想要的抗原特異性的非人供體抗體的氨基酸序列與人受體抗體的序列組合。還包括來自哺乳動物物種的抗IL-6抗體，優(yōu)選地，選自人、大鼠、小鼠、山羊、綿羊、牛和駱駝的抗體。優(yōu)選地，抗IL-6抗體是上文描述的M-BE8或M-23C7抗IL-6抗體，或是與由M-BE8和/或M-23C7抗體識別的IL-6表位結(jié)合的抗體。供體序列將通常至少包括供體的抗原結(jié)合氨基酸殘基，但也可包含供體抗體的其它結(jié)構(gòu)和/或功能相關(guān)的氨基酸殘基?？赏ㄟ^本領(lǐng)域公知的若干方法來制備此類雜交體。優(yōu)選地，配體或試劑與IL-6肽或多肽特異性地結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明的特異性結(jié)合表示配體或試劑應(yīng)當(dāng)基本上不與待分析的樣品中存在的另外的肽、多肽或物質(zhì)結(jié)合(“交叉反應(yīng)”)。優(yōu)選地，特異性結(jié)合的IL-6肽或多肽應(yīng)當(dāng)以比任何其它相關(guān)肽或多肽高至少3倍、更優(yōu)選高至少10倍以及進(jìn)一步更優(yōu)選高至少50倍的親和性結(jié)合。非特異性結(jié)合可以是可忍耐的，如果其仍可被清楚地區(qū)分和測量，例如根據(jù)其在Western雜交印跡上的尺寸，或者通過其在樣品中相對更高的豐度來區(qū)分和測量?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何方法來測量配體的結(jié)合。優(yōu)選地，所述方法是半定量或定量的。合適的方法被描述于下文中。首先，可直接測量配體的結(jié)合，例如通過NMR或表面等離子共振來進(jìn)行。第二，如果配體還用作為目標(biāo)肽或多肽的酶促活性的底物，則可測量酶促反應(yīng)的產(chǎn)物(例如可通過測量被切割的底物的量(例如在Western雜交印跡上)來測量蛋白酶的量)。備選地，配體可自身表現(xiàn)出酶促性質(zhì)，并且可將“配體/肽或多肽”復(fù)合體或被肽或多肽結(jié)合的配體分別與合適的底物接觸，這允許通過生成強度信號來進(jìn)行檢測。為測量酶促反應(yīng)的產(chǎn)物，優(yōu)選地，底物的量是飽和的。還可在反應(yīng)前用可檢測的標(biāo)記對底物進(jìn)行標(biāo)記。優(yōu)選地，將樣品與底物接觸足夠的時間。足夠的時間表示產(chǎn)生可檢測(優(yōu)選可測 量)的量的產(chǎn)物所必需的時間?？蓽y量給定(例如，可檢測到的)量的產(chǎn)物出現(xiàn)所必需的時間代替測量產(chǎn)物的量。第三，可將配體與標(biāo)記共價或非共價偶聯(lián)，這允許對配體的檢測和測量。標(biāo)記可通過直接或間接方法完成。直接標(biāo)記涉及將標(biāo)記直接(共價或非共價)偶聯(lián)至配體。間接標(biāo)記涉及二級配體與第一配體的結(jié)合(共價或非共價)。二級配體應(yīng)當(dāng)與第一配體特異性地結(jié)合。所述二級配體可與合適的標(biāo)記偶聯(lián)和/或可以是與二級配體結(jié)合的三級配體的靶(受體)。二級、三級或者甚至更高級的配體的用途通常被用于增加信號。合適的二級和更高級配體可包括抗體、第二抗體和公知的鏈霉親和素-生物素系統(tǒng)(VectorLaboratories,Inc.)。也可用本領(lǐng)域已知的一種或多種標(biāo)簽來標(biāo)簽化配體或底物。此類標(biāo)簽于是可以是更高級配體的靶。合適的標(biāo)簽包括生物素、地高辛、His標(biāo)簽、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、FLAG、GFP、myc標(biāo)簽、A型流感病毒血球凝集素(HA)、麥芽糖結(jié)合蛋白等等。在肽或多肽的情況下，標(biāo)簽優(yōu)選位于N-末端和/或C-末端。合適的標(biāo)記是可通過合適的檢測方法檢測到的任何標(biāo)記。典型的標(biāo)記包括金顆粒、乳膠珠、9,10-二氫化n丫唳(acridan)酯、魯米諾、釕、酶促活性標(biāo)記、放射活性標(biāo)記、磁性標(biāo)記(例如“磁珠”，包括順磁性和超順磁性標(biāo)記)，和熒光標(biāo)記。酶促活性標(biāo)記包括，例如，辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶、3 -半乳糖苷酶、熒光素酶及其衍生物。用于檢測的合適底物包括二氨基聯(lián)苯胺(DAB)、3，3' _5，5'-四甲基聯(lián)苯胺、NBT-BCIP (4-硝基藍(lán)四唑氯化物和5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽，可作為預(yù)制儲液從 Roche Diagnostics 獲得)、CDP-Star (Amersham Biosciences)、ECF (AmershamBiosciences)。合適的酶-底物組合可造成有顏色的反應(yīng)產(chǎn)物、熒光或化學(xué)發(fā)光，它們可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法來測量(例如使用光敏感膠片或合適的照相系統(tǒng))。關(guān)于測量酶促反應(yīng)，類似地應(yīng)用上文給出的標(biāo)準(zhǔn)。典型的熒光標(biāo)記包括熒光蛋白(例如GFP及其衍生物)、Cy3、Cy5、德克薩斯紅、熒光素和Alexa染料(例如Alexa 568)。其它熒光標(biāo)記例如可從Molecular Probes (Oregon)獲得。還包括了量子點(quantum dots)作為突光標(biāo)記的用途。典型的放射活性標(biāo)記包括35S、125I、32P、33P等等。可通過任何已知并且合適的方法來檢測放射活性標(biāo)記，例如光敏感膠片或磷成像儀。根據(jù)本發(fā)明的合適測量方法還包括沉淀(特別地免疫沉淀)、電化學(xué)發(fā)光(電生成的化學(xué)發(fā)光)、RIA(放射免疫測定)、ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測定)、夾心式酶免疫測試、電化學(xué)發(fā)光夾心式免疫測定(ECLIA)、解離增強的鑭系氟免疫測定(DELFIA)、閃爍臨近測定(SPA)、比濁法、濁度法、乳膠增強的比濁法或濁度法、或固相免疫測試?？蓡为毷褂?，或與上文所述的標(biāo)記或其它檢測方法組合使用本領(lǐng)域已知的其它方法(例如凝膠電泳、2D凝膠電泳、SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) ^Western雜交印跡和質(zhì)譜)。更優(yōu)選地，通過質(zhì)譜方法，優(yōu)選通過同位素稀釋微-HPLC-串聯(lián)質(zhì)譜方法，優(yōu)選通過實施例中和Kobold U等(Clin Chem 2008 ；54 =1584-6)中描述的方法，來測定IL-6的量。
·
還可優(yōu)選地按照下文所述來測定IL-6肽或多肽的量(a)將包含上文指明的針對肽或多肽的配體的固體支持物與包含肽或多肽的樣品接觸，以及(b)測量與支持物結(jié)合的肽或多肽的量。優(yōu)選地選自核酸、肽、多肽、抗體和適體的配體優(yōu)選以固定化的形式存在于固體支持物上。用于生產(chǎn)固體支持物的材料是本領(lǐng)域公知的，并且尤其包括可商購的柱材料、聚苯乙烯珠、乳膠珠、磁珠、膠體金屬顆粒、玻璃和/或硅芯片和表面、硝酸纖維素條帶、膜、片層、duracytes、反應(yīng)槽的孔和壁、塑料管等等。配體或試劑可與很多不同的運載體結(jié)合。公知運載體的實例包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龍、直鏈淀粉、天然和經(jīng)修飾的纖維素、聚丙烯酰胺、瓊脂糖和磁鐵礦。就本發(fā)明的目的而言，運載體的本質(zhì)可以是可溶或不可溶的。用于裝置/固定(fixing/immobilizing)所述配體的合適方法是公知的，其包括但不限于離子、疏水、共價相互作用等等。還可使用“懸浮液陣列”作為根據(jù)本發(fā)明的陣列(Nolan 2002，Trends Biotechnol. 20(1) :9-12)。在此類懸浮液陣列中，運載體(例如微珠或微球)存在于懸浮液中。陣列由可能經(jīng)標(biāo)記，攜帶不同配體的不同微珠或微球構(gòu)成。例如基于固相化學(xué)和光不穩(wěn)定的保護基團的生產(chǎn)此類陣列的方法是通常已知的(US 5，744，305)。術(shù)語“約”在本文中使用時涵蓋相對于特定的值、量、濃度、水平等等而言+和-20%的范圍，例如，“約100”的值指示意為涵蓋100+/-20%的數(shù)值范圍的值，S卩，從80至120的范圍內(nèi)的值。優(yōu)選地，術(shù)語“約”涵蓋相對于特定的值、量、濃度、水平等等而言+和-10%的范圍，最優(yōu)選地，相對于特定的值、量、濃度、水平等等而言+和-5%的范圍。術(shù)語“比較”在本文中使用時涵蓋將待分析的樣品包含的IL-6肽或多肽的水平與本說明書其它地方指出的合適的參照來源的水平相比較。應(yīng)當(dāng)理解，在本文中使用時，比較指對相應(yīng)參數(shù)或值的比較，例如，將絕對量與絕對參照水平相比較，而將濃度與參照濃度相t匕，或者將從測試樣品獲得的強度信號與參照樣品的相同類型的強度信號相比較。本發(fā)明方法的步驟(b)中提到的比較可人工進(jìn)行或計算機輔助進(jìn)行。對于計算機輔助的比較，可通過計算機程序，將測定的水平的值與儲存于數(shù)據(jù)庫中的對應(yīng)于合適的參照的值相比較。計算機程序還可評價比較的結(jié)果，即，自動提供合適的輸出形式的想要的評估?；趯Σ襟Ea)中測定的水平和參照水平的比較，確定患者中SIRS的診斷。因此，如此選擇參照水平使得被比較的水平中的差異或相似性允許將受試者劃分為SIRS或不罹患SIRS。因此，術(shù)語“參照水平”指定義截斷值的量、濃度或值。當(dāng)與展示出低于截斷值的測定的量、水平或參數(shù)值的患者比較時，高于截斷值的量、濃度或參數(shù)值導(dǎo)致不同的診斷。因此，通過將實際測定的IL-6的量、濃度或參數(shù)值與各自的截斷值進(jìn)行比較，能夠診斷或檢測患者發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險。當(dāng)然，可應(yīng)用于個體受試者的參照水平可取決于多種生理參數(shù)例如年齡、性別、亞種群、醇攝入、近來的感染以及本文提到的用于測定多肽或肽的工具而變動?？赏ㄟ^本發(fā)明的方法與測試樣品一起(即，同時或隨后)，從待分析的參照樣品來測定合適的參照水平。在實施例中驗證本發(fā)明的參照水平。如本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解的，此類診斷評估通常不旨在對待鑒定的全部患者(即100%)來說都是正確的。但是該術(shù)語要求能夠鑒定患者中統(tǒng)計上顯著的部分(即，群體研究中的群體)。一部分是否統(tǒng)計顯著可由本領(lǐng)域技術(shù)人員使用多種公知統(tǒng)計學(xué)評價工具來確定而不費周折，所述評價工具例如，測定置信區(qū)間，P值測定，學(xué)生t-檢驗,Mann-Whitney檢驗等等。細(xì)節(jié)可見 Dowdy and Wearden, Statistics for Resea rch, John Wiley & Sons,New York 1983。優(yōu)選的置信區(qū)間是至少90%、至少95%、至少97%、至少98%或至少99%。P值優(yōu)選是0. 1,0. 05,0. 01,0. 005或0. 0001。更優(yōu)選地，通過本發(fā)明的方法可正確地鑒定患者群體中的至少60%、至少70%、至少80%或至少90%。一般而言，為根據(jù)本發(fā)明的各實施方式測定各水平以允許建立想要的診斷，(“閾值”、“參照水平”)，在合適的患者組中測定一種或多種各自的肽的量/水平或量比率。如之前指出的，優(yōu)選通過將在給定患者(優(yōu)選在受試者患者)中較早測定的IL-6水平(例如基線IL-6水平)乘以本文其它地方定義的因子(例如至少大約50或至少大約100、或至少大約500或至少大約1000的因子)來確定參照值。例如，基于回溯性臨床研究，如實施例中描述的那樣，其中對結(jié)果(沒有SIRS對SIRS對敗血癥)進(jìn)行分析并與患者中IL-6水平隨時間的改變相比較，可容易地統(tǒng)計學(xué)核實應(yīng)當(dāng)將受試者患者的基線IL-6水平乘以哪個“因子”，來建立與發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的特定風(fēng)險概率相關(guān)的參照值。優(yōu)選地，參照水平是通過將IL-6基線水平乘以至少大約50的因子、優(yōu)選乘以至少大約100的因子、更優(yōu)選乘以至少大約500的因子、最優(yōu)選乘以至少大約1000的因子來計算的。例如，如果出現(xiàn)在醫(yī)師面前或醫(yī)院的無癥狀患者具有10pg/ml的基線IL-6水平，則計算的參照水平優(yōu)選為500pg/ml (50倍增加)、優(yōu)選lng/ml (100倍增加)、優(yōu)選5ng/ml (500倍增加)或優(yōu)選IOng (1000倍增加)。在此類患者中，在患者接受(例如侵入性)治療(例如重大手術(shù))后檢測的IL-6的水平高于指示的參照水平則表明患者處于發(fā)展出或罹患SIRS的高風(fēng)險中。在本文中使用時，“基線水平”涵蓋至少一種下述IL-6水平，所述水平是在(i)當(dāng)患者出現(xiàn)在醫(yī)師、急救單元、醫(yī)院、重癥護理單元、外科醫(yī)生或麻醉師處時，(ii)療法啟動之前，例如手術(shù)之前，(iii)療法期間，例如手術(shù)期間，和/或Qv)治療完成之后,例如手術(shù)完成之后，獲得的。該術(shù)語還涵蓋在患者接受(例如侵入性)治療后測定的基線水平，例如在治療后大約24小時內(nèi)，優(yōu)選大約15小時內(nèi)，優(yōu)選大約12小時內(nèi)，優(yōu)選大約6小時內(nèi)。備選地，基線水平是通過測定采集的樣品的中位數(shù)或平均IL-6水平來計算的，所述樣品至多但不包括相對所述中位數(shù)或平均IL-6水平而言其中IL-6水平增加了多于大約20倍、多于大約30倍、多于大約50倍、多于大約50倍、多于大約100倍或者多于大約500倍的樣品。可使用有效的分析方法，通過測定各參數(shù)，優(yōu)選通過測量IL-6的水平，來進(jìn)行對罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的風(fēng)險的診斷和檢測。通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的統(tǒng)計學(xué)方法收集并分析獲得的結(jié)果。
任選地，根據(jù)罹患或正處于罹患或發(fā)展出疾病的風(fēng)險的期望概率，來建立參照值。例如，下述可能是有用的選擇將與健康和/或非健康患者集合中第60、70、80、90、95或甚至99百分位數(shù)的基線水平相乘的中位因子，以建立參照水平。用作為閾值的優(yōu)選參照水平可源于正常的上限(ULN)，即在種群中發(fā)現(xiàn)的生理量的上限。針對給定受試者種群的ULN可通過多種公知技術(shù)來測定。合適的技術(shù)可以是測定待在本發(fā)明的方法中測定的肽或多肽的量的種群中的中位數(shù)?？山⒑万炞C診斷標(biāo)志物的參照水平，并且可簡單地將患者樣品中標(biāo)志物的水平與參照水平相比。診斷和/或預(yù)后測試的靈敏性和特異性不僅取決于測試的分析“品質(zhì)”，它們還取決于對構(gòu)成異常結(jié)果的定義。實踐中，一般地，通過將變量的值對其在“正常”和“疾病”群體中的相對頻率作圖，來計算接收者工作特征(Receiver OperatingCharacteristic curves)曲線或“ROC”曲線。對于本發(fā)明的任何特別的參數(shù)而言,具有或沒有疾病的受試者的標(biāo)志物水平分布將可能重疊。在此類情況下，測試并不能以100%的準(zhǔn)確性將正常與疾病絕對區(qū)分開，重疊的區(qū)域表示測試在此處測試無法區(qū)分正常與疾病， 或者罹患或發(fā)展出疾病的高風(fēng)險與低風(fēng)險。選擇閾值(截斷值，參照水平)，高于其(或低于其，取決于標(biāo)志物如何隨疾病改變)時認(rèn)為測試是異常的，低于其時認(rèn)為測試是正常的。ROC曲線下的面積是感知的測量將允許正確鑒定或預(yù)測病況發(fā)作或發(fā)展的風(fēng)險的概率的量度。甚至可在當(dāng)測試結(jié)果不一定給出準(zhǔn)確數(shù)字時使用ROC曲線。只要可對結(jié)果進(jìn)行排序，即可創(chuàng)造ROC曲線。例如，可根據(jù)疾病程度(例如I =低，2 =正常，以及3 =高)或罹患或發(fā)展出疾病的概率(例如I =低，2 =正常，以及3 =高)對“疾病”樣品的測試結(jié)果排序?？蓪⒃撆判蚺c“正?！比后w中的結(jié)果關(guān)聯(lián)，并且創(chuàng)造ROC曲線。這些方法是本領(lǐng)域公知的。見例如 Hanley 等，Radiology 1982 ； 143 :29_36。在某些實施方式中，選擇標(biāo)志物和/或標(biāo)志物小組，以表現(xiàn)出與至少大約70%的特異性、更優(yōu)選至少大約80%的特異性、進(jìn)一步更優(yōu)選至少大約85%的特異性、仍更優(yōu)選至少大約90%的特異性以及最優(yōu)選至少大約95%的特異性組合的至少大約70%的靈敏性、更優(yōu)選至少大約80%的靈敏性、進(jìn)一步更優(yōu)選至少大約85%的靈敏性、仍更優(yōu)選至少大約90%的靈敏性以及最優(yōu)選至少大約95%的靈敏性。在特別優(yōu)選的實施方式中，靈敏性和特異性為至少大約75%、更優(yōu)選至少大約80%、進(jìn)一步更優(yōu)選至少大約85%、仍更優(yōu)選至少大約90%以及最優(yōu)選至少大約95%。在其它實施方式中，使用陽性似然比、陰性似然比或優(yōu)勢比(odds ratio)作為對測試預(yù)測風(fēng)險或診斷疾病的能力的量度。在陽性似然比的情況下，I的值指示在“疾病”和“對照”兩組中的受試者中陽性結(jié)果是等同可能的；高于I的值指示疾病組中更可能有陽性結(jié)果；低于I的值指示對照組中更可能有陽性結(jié)果。在陰性似然比的情況下，I的值指示在“疾病”和“對照”兩組中的受試者中陰性結(jié)果是等同可能的；高于I的值指示測試組中更可能有陰性結(jié)果；低于I的值指示對照組中更可能有陰性結(jié)果。在某些優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)志物和/或標(biāo)志物小組優(yōu)選被選擇為表現(xiàn)出至少大約I. 5或更高或者大約0. 67或更低，更優(yōu)選地，至少大約2或更高或者大約0. 5或更低，仍更優(yōu)選地，至少大約5或更高或者大約0. 2或更低，進(jìn)一步更優(yōu)選地，至少大約10或更高或者大約0. I或更低，以及最優(yōu)選地，至少大約20或更高或者大約0. 05或更低的陽性或陰性似然比。在本文上下文中，術(shù)語“大約”表示給定測量結(jié)果的+/-5%。
在優(yōu)勢比的情況下，I的值指示在“疾病”和“對照”兩組中的受試者中陽性結(jié)果是等同可能的；高于I的值指示疾病組中更可能有陽性結(jié)果；低于I的值指示對照組中更可能有陽性結(jié)果。在某些優(yōu)選的實施方式中，標(biāo)志物和/或標(biāo)志物小組優(yōu)選被選擇為表現(xiàn)出至少大約2或更高或者大約0. 5或更低，更優(yōu)選地，至少大約3或更高或者大約0. 33或更低，仍更優(yōu)選地，至少大約4或更高或者大約0. 25或更低，進(jìn)一步更優(yōu)選地，至少大約5或更高或者大約0. 2或更低，以及最優(yōu)選地，至少大約10或更高或者大約0. I或更低的優(yōu)勢比。在本文上下文中，術(shù)語“大約”表示給定測量結(jié)果的+/-5 %。小組可包含至少一種額外的標(biāo)志物；疾病的特異性標(biāo)志物(例如，在細(xì)菌感染但不在其它疾病狀態(tài)中增加或減少的標(biāo)志物)和/或非特異性標(biāo)志物(例如，無關(guān)誘因，由于炎癥而增加或減少的標(biāo)志物；無關(guān)誘因，由于內(nèi)穩(wěn)態(tài)改變而增加或減少的標(biāo)志物等等)兩者。雖然某些標(biāo)志物在本文描述的方法中可能并非個體決定性的，但改變的特別的“指紋”圖式可實際作為疾病狀態(tài)的特異性指示物。如上文所述，改變圖式可從單份樣品獲得，或者可任選地考慮小組一個或多個成員中的時間的改變(或小組應(yīng)答值的時間的改變)。在本發(fā)明方法的一種優(yōu)選實施方式中， i)步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平處于或高于參照水平指示患者處于罹患或發(fā)展出SIRS的高風(fēng)險中；以及ii)步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平低于參照水平指示患者處于罹患或發(fā)展出SIRS的低風(fēng)險。已觀察到，IL-6濃度在無癥狀患者中顯著不同。例如，下述因子對該個體間差異有貢獻(xiàn)近來的醇消耗、身體鍛煉、壓力、近來的感染史、受傷和處于急性高血糖癥。因此，在本發(fā)明方法的優(yōu)選實施方式中，基于患者逐個確定IL-6參照水平。優(yōu)選地，密切監(jiān)測展示出高于對照水平的IL-6水平的患者SIRS或敗血癥的臨床征兆和癥狀的發(fā)作。更優(yōu)選地，對患者進(jìn)行下述參數(shù)的監(jiān)測IL-6水平，白血細(xì)胞計數(shù)(WBC)和測定未成熟白細(xì)胞形式，體溫，心率，呼吸速率，收集來自引流物(drainages)、血清、氣管支氣管分泌物和尿的微生物標(biāo)本以及每日胸部X線照相。確保通過超聲和CT-掃描進(jìn)行的控制內(nèi)窺鏡和放射學(xué)檢查。更優(yōu)選地，按照下文所述對患者進(jìn)行治療啟動廣譜抗生素治療、抗真菌治療。在有懷疑的情況下，自由安排重做手術(shù)。在本發(fā)明的另一方面，提供了監(jiān)測無癥狀患者發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險的方法，所述方法包括下述步驟a)在來自患者的樣品中測定IL-6或其變體的水平；b)將步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平與參照水平相比較；以及c)基于步驟c)中的比較，針對患者推薦、決定、啟動、繼續(xù)、調(diào)節(jié)或停止SIRS或敗血癥療法。上述監(jiān)測的診斷和治療結(jié)果包括來自血清、引流物、氣管支氣管分泌物和尿的微生物標(biāo)本，內(nèi)窺鏡控制，放射學(xué)顯影流程如超聲、胸部X線照相和CT-掃描，啟動廣譜抗生素治療或?qū)F(xiàn)有抗生素治療改變?yōu)楦行У闹委?，抗真菌治療。在有懷疑的情況下，自由安排重做手術(shù)。在IL-6或其變體水平高于參照水平的情況下，對樣品或額外收集的樣品進(jìn)行測定以鑒定出樣品中含有的感染生物(例如細(xì)菌、真菌等等)。此類測定是本領(lǐng)域通常已知的，并且與對敗血癥的診斷相關(guān)。在本發(fā)明的另一方面，提供了在無癥狀患者中預(yù)測死亡風(fēng)險的方法，所述方法包括下述步驟a)在來自患者的樣品中測定IL-6或其變體的水平；b)將步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平與參照水平相比較；c)基于步驟b)中的比較，針對患者預(yù)測死亡風(fēng)險。除非有不同說明，以上關(guān)于檢測或診斷罹患或發(fā)展出SIRS的風(fēng)險的方法所描述的定義和優(yōu)選的實施方式經(jīng)必要修正后還可應(yīng)用于本發(fā)明的本方面。
根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了適用于檢測或診斷罹患或發(fā)展出SIRS的風(fēng)險的設(shè)備，優(yōu)選地，根據(jù)上文所述方法來檢測或診斷，所述設(shè)備包含a)第一分析單元，其包含針對IL-6或其變體的檢測工具，其中所述分析單元適用于測定通過檢測工具檢測的IL-6的水平；b)包含計算機的評價單元，所述計算機包含實際嵌入的計算機程序代碼，用于比較從第一分析單元獲得的測定的量和包含上文說明的相應(yīng)參照水平的合適數(shù)據(jù)庫；優(yōu)選地，第一分析單元以及優(yōu)選還有評價單元互相有效連接。優(yōu)選地，設(shè)備還包含基于患者罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的診斷或風(fēng)險預(yù)測的、用于輸出所需的診斷和治療和/或預(yù)防的工具。更優(yōu)選地，設(shè)備還包含用于輸出進(jìn)展和/或?qū)IRS或敗血癥的治療和/或療法的應(yīng)答的工具。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了適用于進(jìn)行上文所述的方法的試劑盒，所述試劑盒包含用于測定IL-6或其變體的水平的工具；用于比較IL-6或其變體的測定的水平和參照水平的工具；用于進(jìn)行所述方法的說明書。術(shù)語“試劑盒”在本文中使用時指本發(fā)明的前述化合物、工具或試劑的集合，它們可被或可不被包裝到一起。試劑盒的組分可由單獨的管包裝(即，作為單獨的部分的試劑盒)，或在單個管中提供。此外，應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明的試劑盒將用于實踐上文中提到的方法。優(yōu)選地預(yù)想以即用(ready-to-use)方式提供所有組分，用于實踐上文提到的方法。此外，試劑盒優(yōu)選含有用于進(jìn)行所述方法的說明書。說明書可以以紙或電子形式通過用戶手冊提供。例如，手冊可包含用于解釋使用本發(fā)明的試劑盒進(jìn)行上文所述的方法時獲得的結(jié)果的說明。根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了包含下述計算機程序代碼的計算機程序，所述代碼在計算機上運行所述計算機程序時適用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。在本發(fā)明的另一方面，提供了計算機可讀介質(zhì)，其具有儲存于其上的本發(fā)明的計算機程序。在本發(fā)明的另一方面，提供了計算機程序產(chǎn)品，其具有儲存于其上的本發(fā)明的計算機程序。優(yōu)選地，計算機程序還包含基于診斷的疾病、用于輸出所需的預(yù)防和/或療法的工具，所述工具被儲存于計算機可讀介質(zhì)上。除非有不同指明，以上關(guān)于全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)的檢測或診斷的方法或用于檢測或診斷罹患或發(fā)展出SIRS的風(fēng)險的方法所描述的定義和優(yōu)選的實施方式也應(yīng)用于本發(fā)明的本方面。在本發(fā)明的另一方面，提供了適用于進(jìn)行本發(fā)明的方法的試劑盒，所述試劑盒包含i)用于測定IL-6或其變體的水平的工具；ii)用于比較IL-6或其變體的測定的水平與參照水平的工具；以及任選地，iii)用于進(jìn)行所述方法的說明書。在本發(fā)明的另一方面，提供了用于在無癥狀患者中檢測或診斷全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)或敗血癥，或用于檢測或診斷罹患或發(fā)展出SIRS的風(fēng)險的方法，所述方法包括下述步驟 a)在來自患者的樣品中測定CRP的水平；b)比較步驟a)中測定的CRP的水平與參照水平；c)檢測或診斷SIRS，或檢測或診斷發(fā)展出SIRS的風(fēng)險；其中以短間隔至少兩次分離樣品，并且針對每份樣品重復(fù)步驟a)和b)。在本發(fā)明的另一方面，提供了用于在無癥狀患者中檢測或診斷發(fā)展出或罹患全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)或敗血癥的風(fēng)險的方法，所述方法包括下述步驟a)在來自患者的樣品中測定原降鈣素的水平；b)比較步驟a)中測定的原降鈣素的水平與參照水平；c)檢測或診斷發(fā)展出或罹患全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)或敗血癥的風(fēng)險；其中以短間隔至少兩次分離樣品，并且針對每份樣品重復(fù)步驟a)和b)。在本發(fā)明的另一方面，提供了選自抗IL-2抗體、抗IL-3抗體、抗IL-4抗體、抗IL-5抗體和抗IL-6抗體的抗體。附圖
簡述圖I手術(shù)前和手術(shù)后無癥狀患者中的IL_6(pg/ml)動力學(xué)。針對基線I (手術(shù)前)、基線2 (手術(shù)期間)和手術(shù)后(第1、2、3和4天；以6小時間隔采樣)，對IL-6水平作圖。附圖顯示了對發(fā)展出SIRS/敗血癥的患者群和沒有發(fā)展出SIRS/敗血癥的患者群之間的比較。示出了中位數(shù)和百分位數(shù)。圖2對于第I至7號患者繪制的隨時間的IL-6濃度(pg/ml)。三角形表示診斷出臨床SIRS征兆的時間點。圖3非SIRS患者的特征。對于非SIRS患者繪制隨時間的IL-6濃度(pg/ml)。圖4手術(shù)前和手術(shù)后無癥狀患者中的CRP (pg/ml)動力學(xué)。針對基線I (手術(shù)前)、基線2(手術(shù)期間)和手術(shù)后(第1、2、3和4天；以6小時間隔采樣)，對CRP水平作圖。附圖顯示了對發(fā)展出SIRS/敗血癥的患者群和沒有發(fā)展出SIRS/敗血癥的患者群之間的比較。示出了中位數(shù)和百分位數(shù)。圖5手術(shù)前和手術(shù)后無癥狀患者中CRP對IL-6動力學(xué)。附圖顯示了對發(fā)展出SIRS/敗血癥的患者群和沒有發(fā)展出SIRS/敗血癥的患者群之間的比較。示出了中位數(shù)。本說明書中提到的所有參照文獻(xiàn)的全部公開內(nèi)容和本說明書中特別提到的公開內(nèi)容都通過引用并入本文。下述實施例將僅僅闡述本發(fā)明。它們無論如何不應(yīng)被理解為限制本發(fā)明的范圍。實施例患者特征研究中包括48名患者(36名男性和12名女性)?；颊咂骄挲g為61歲，范圍從19至87歲。所有患者被Medizinische Universitat Graz,奧地利的胸外科接收,進(jìn)行選擇性手術(shù)。37名患者由于多種癌類型接受了肺手術(shù)，9名患者由于食管癌進(jìn)行了食管切除術(shù)，I名患者接受了胃切除術(shù)，以及I名患者由于化學(xué)燒傷接受了胃切除術(shù)和食管切除術(shù)。在所有患者中，在手術(shù)日的早晨啟動抗生素治療。手術(shù)前所有患者均進(jìn)行兩次基線水平測量，以測定IL-6和常規(guī)實驗室參數(shù)。全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)是基于ACCP/SCCM Consensus ConferenceDefinitions (1992/2003)診斷的，即，被診斷為SIRS的患者展示出下述中的至少2種癥 狀a)白血細(xì)胞計數(shù)(WBC)高于約12，000/U/L或低于約4000/ii /L，b)體溫高于約38°C或低于<約36°C，c)心率高于約90次跳動/分鐘或CO2分壓低于約32mmHg，和d)呼吸速率高于約20次呼吸/分鐘，e)在計數(shù)的白血細(xì)胞中超過10%的未成熟白血細(xì)胞。48名患者中有10名(21%)在研究的監(jiān)測時間窗內(nèi)發(fā)展出了 SIRS。顯示SIRS臨床征兆的10名患者中有三名額外具有驗證了敗血癥的陽性血培養(yǎng)物。病例中兩名應(yīng)答于抗生素治療的改變，盡管僅在I名患者中通過陽性血培養(yǎng)物驗證了感染。10名患者中的5名在研究期間單純顯示SIRS征兆而沒有感染?；颊咧蠭名在監(jiān)測窗結(jié)束后很短的時間發(fā)展出SIRS。根據(jù)下文討論的結(jié)果，這顯示，基于IL-6的診斷和預(yù)測不限于敗血癥，其還可應(yīng)用于SIRS。材料和方法基于Roche Cobas Elecsys IL-6 測定(Roche, Mannheim,德國)，使用夾心式ELISA免疫測定來測定IL-6。簡言之，用經(jīng)生物素化的單克隆IL-6-特異性抗體孵育30ii L血漿或血清樣品。添加用釕復(fù)合體標(biāo)記的單克隆IL-6特異性抗體和鏈霉親和素涂布的微顆粒之后，抗體與樣品的抗原形成夾心式復(fù)合體。然后將反應(yīng)混合物吸入至Elecsys電化學(xué)發(fā)光設(shè)備的測量室中，微顆粒在此處被磁性捕獲到電極表面。然后用ProCell移除未結(jié)合的物質(zhì)。然后向電極應(yīng)用電壓誘導(dǎo)化學(xué)發(fā)光發(fā)射，其通過光電倍增器來測量。經(jīng)由校正曲線(由2點校正儀器特異性地生成的)和經(jīng)由試劑條形碼提供的主曲線(master curve)來測定結(jié)果。使用標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計檢驗，對測定的IL-6濃度進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。根據(jù)研究方案，以在手術(shù)前和手術(shù)期間的兩個時間點取得的2個基線水平開始，監(jiān)測登記的患者的SIRS的臨床和實驗室征兆。手術(shù)后，通過在手術(shù)前兩次和手術(shù)后6天期間每6小時采集血樣，對患者密切調(diào)查。在采血的每個時間點，根據(jù)建立的SIRS和敗血癥標(biāo)準(zhǔn)，記錄臨床狀態(tài)。
令人吃驚地，SIRS/敗血癥患者的IL-6濃度值與沒有發(fā)展出SIRS的患者的中位數(shù)值顯著不同。盡管在手術(shù)后所有患者中IL-6水平都增加了，但僅SIRS組的患者展示出相對于他們各自基線水平而言的IL-6濃度的大幅增加，而非SIRS患者僅顯示出IL-6濃度較之各自的基線水平增加了至多10倍見附圖)。一些SIRS患者的特征(見圖I和2)第I號患者的患者特征如下所示男性，62歲，食管癌，食管切除術(shù)。手術(shù)前的常規(guī)實驗室參數(shù)和IL-6值是不明顯的(IL-6基線水平14. 3和2. 9pg/ml)。在手術(shù)后第一天，中午測量到了 6. 4pg/ml IL-6的基線水平。6小時后IL-6水平為2279. 00pg/ml。雖然值隨著時間減少，但直到第6天仍保持很高，大約500pg/ml。當(dāng)陽性血培養(yǎng)物指示細(xì)菌感染，并且記錄了> 38°C的升高的體溫時，在第4天才首次識別臨床SIRS/敗血癥征兆。第6天心率> 90次跳動/分鐘。該病例令人信服地顯示，密切和頻繁的IL-6監(jiān)測允許在支持SIRS或敗血癥診斷的臨床征兆和癥狀發(fā)作前很久就對發(fā)展出或罹患SIRS的高風(fēng)險做出早期診斷和檢測。
第2號患者的患者特征如下所示男性，81歲，食管胃接合處癌。手術(shù)前患者白血球計數(shù)較低。第二基線水平實際為< 4000個白血細(xì)胞。手術(shù)后第I天，患者體溫<36°C，并且呼吸速率>20/分鐘。兩種征兆被采納為暗示SIRS。同時處于基線l(1.6pg/ml)以及處于基線2 (37. 9) pg/ml的IL-6值增加至1400. 00pg/ml。除從第2天直到第6天增加至>12的血細(xì)胞計數(shù)之外，僅有IL-6值保持高水平(至多500pg/ml)直到第4天，然后緩慢降低。沒有獲得陽性血培養(yǎng)物結(jié)果，即，沒有檢測到敗血癥相關(guān)感染。該病例顯示，高于參照水平的IL-6水平允許對發(fā)展出或罹患SIRS的風(fēng)險進(jìn)行早期診斷和檢測。第3號患者的患者特征如下所示男性，70歲，肺癌，肺切除術(shù)。該患者最初(基線I)具有增加的白血細(xì)胞計數(shù)(> 12000)，但在一周后的基線2時間點具有標(biāo)準(zhǔn)化的值。基線IL-6水平也在正常范圍內(nèi)，為23. 5和16. 5pg/ml。在手術(shù)后的所有時間點，除了升高的IL-6水平外沒有出現(xiàn)指向SIRS或敗血癥的臨床征兆。第2天后白血細(xì)胞計數(shù)增加至大約13000的水平并且不減少。IL-6在手術(shù)后增加至200至300pg/ml的值，瞬間峰值600pg/ml，甚至在I個測量點為850pg/ml。在第5天晚上，IL-6值突然增加至3994. 00pg/ml，6小時前值是148. 6pg/ml。兩天后，在超出研究方案時間線的時候，患者發(fā)展出SIRS標(biāo)準(zhǔn)，并且發(fā)展出嚴(yán)重的病況，但能被穩(wěn)定。除了 IL-6，沒有其它實驗室或臨床參數(shù)反映了患者的急性惡化。因此，緊密監(jiān)測IL-6令人驚奇地允許早期檢測到發(fā)展出SIRS或敗血癥的高風(fēng)險，這允許早期治療介入。第4號患者的患者特征如下所示女性，50歲，軟骨肉瘤，肺轉(zhuǎn)移，肺切除術(shù)?；€處和整個6天的研究期間，WBC計數(shù)在正常范圍，最大值為第4天的11000。手術(shù)期間(基線2) IL-6已經(jīng)增加至282. 7pg/ml的值。在手術(shù)后第一次測量時(第I天/第I次)IL-6增加至1079pg/ml,并且6小時后達(dá)到2771pg/ml的峰。從該時間點起，值持續(xù)下降至研究結(jié)束時值大約70pg/ml。在與IL-6為其最高值時的相同時間點，該患者出現(xiàn)了溫度> 38°C和HR > 90/分鐘的SIRS標(biāo)準(zhǔn)，這驗證了 IL-6是可靠的SIRS早期標(biāo)志物。第5號患者的患者特征如下所示男性，19歲，食管和胃化學(xué)燒傷。在手術(shù)前的基線處，所有參數(shù)在正常范圍。手術(shù)期間當(dāng)采集第二基線血樣時IL-6輕微增加至67. 4pg/ml。6小時后(第I天/第I次)采集的下一份血樣已經(jīng)顯示IL-6值高于700pg/ml，并在之后的幾天期間進(jìn)一步增加至高于1000pg/ml (第I天/第I次-第3天/第I次)。從第5天/第2次直到研究期間結(jié)束(第6天/第2次)，記錄到了 SIRS的臨床征兆(心率> 100/分鐘和呼吸速率> 20/分鐘)。第6號患者的患者特征如下所示女性，60歲，肺癌后葉切除術(shù)。在兩個基線水平處，所有參數(shù)都在正常范圍。手術(shù)后第一個IL-6值(第I天/第I次)顯示升高至幾乎500pg/mlo IL-6水平在整個研究期間增加,顯示550至150pg/ml之間的水平。從第I天/第4次起，白血球顯著增加并且達(dá)到20x 10的水平。與>38°C的增加的體溫結(jié)合，記錄為SIRS。兩個時間點后，體溫趨于正常但在第6天/第2次又升高了一次。第7號患者的患者特征如下所示男性，48歲，肺癌，肺切除術(shù)。最初在基線處所有參數(shù)都處于正常范圍。在第二個基線時間點，患者已經(jīng)顯示出> 100/分鐘的增加的心率，其持續(xù)于幾乎全部研究時間點。IL-6值在第I天/第I次顯著增加至幾乎400pg/ml，之后在接下來的7個采樣時間點期間降低至大約70pg/ml的中度增加的值。在第4天/第I次時，IL-6開始再次增加，達(dá)到多于500pg/ml的值。從第5天/第2次直到第6天/第2次 研究結(jié)束時，記錄到SIRS的臨床征兆(心率> 100/分鐘并且呼吸速率> 20/分鐘)。非SIRS患者的特征(見圖I和3至5)。48名患者中根據(jù)定義沒有發(fā)展出SIRS或敗血癥的38名在觀察期間在某時間點展示出SIRS的至多一種單個癥狀，但是從來沒有兩種或更多，因此，這些患者被診斷為沒罹患SIRS?；€IL-6值與SIRS患者之一的相當(dāng)。手術(shù)后，所有非SIRS患者也具有輕微增加的IL-6值,一些至多大約100pg/ml, —些至多400, —名具有900pg/ml的單峰,但是他們沒有顯示出在SIRS患者組中觀察到的IL-6水平的劇烈的升高。考慮到進(jìn)行的手術(shù)的嚴(yán)重性，在非SIRS患者中觀察到的IL-6的小幅增加在能預(yù)期的范圍內(nèi)?；谶@些患者中的結(jié)果(沒有發(fā)作SIRS或敗血癥)，數(shù)據(jù)驗證了患者處于罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的低風(fēng)險。參考文獻(xiàn)I Kishimoto T， Hirano T.A New Interleukin with Pleitropic Activities.Bio Essays 1988 Jul ；9(1) :11-152 Song M，Kellum JA. Interleukin-6. Crit Care Med 2005 ；33 (Suppll2)463-465.3 Taga T，Kishimoto T. Gpl30 and the Interleukin-6 Family of Cytokines.Annu. Rev. Immunol. 1997 ；15 :797-8194 Drucker C，Gewiese J，Malchow S，Scheller J，Rose-John S. Impact ofInterleukin-6 Classic—and Trans-signaling on Liver Damage and Regeneration. JAutimm 2009 in press.5 Hodgin KE，Moss M. The epidemiology of Sepsis. Current Pharm Design2008 ；14 :1833-1839.6.American College of Chest Physicians/Society of Critical CareMedicine Consensus Conference !definitions for seps. is and organ failure andguidelines for the use of innovative therapies in sepsis. Crit Care Med. 1992Jun ；20(6) :864-74.
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權(quán)利要求
1.在無癥狀患者中檢測或診斷發(fā)展出或罹患全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)或敗血癥的風(fēng)險的方法，所述方法包括下述步驟 a)在來自患者的樣品中測定IL-6或其變體的水平； b)將步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平與參照水平相比較； c)檢測或診斷發(fā)展出或罹患全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)或敗血癥的風(fēng)險； 其中以范圍從約15分鐘至約12小時的短間隔至少兩次分離樣品，并且針對每份樣品重復(fù)步驟a)和b)。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述無癥狀患者是展示出下述a)至d)、優(yōu)選地下述a)至e)中的少于2種、優(yōu)選少于I種癥狀的患者 a)白血細(xì)胞計數(shù)多于約12，000/μ /L或少于約4000/ μ /L, b)體溫高于約38°C或低于約36°C， c)心率高于約90次跳動/分鐘或CO2分壓低于約32mmHg，和 d)呼吸速率高于約20次呼吸/分鐘， e)在計數(shù)的白血細(xì)胞中多于約10%的未成熟白血細(xì)胞， 任選地,患者不展示出被診斷的感染。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中所述短間隔在從約I至6小時的范圍內(nèi)，優(yōu)選從約I小時至約3小時的范圍內(nèi)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I至3中任意一項的方法，其中 i)步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平高于參照水平指示患者處于罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的聞風(fēng)險；以及 )步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平低于參照水平指示患者處于罹患或發(fā)展出SIRS或敗血癥的低風(fēng)險。
5.根據(jù)權(quán)利要求I至4中任意一項所述的方法，其中所述參照水平是通過將IL-6或其變體的基線水平乘以至少約50的因子、優(yōu)選乘以至少約100的因子、更優(yōu)選乘以至少約500的因子、最優(yōu)選乘以至少約1000的因子來獲得的。
6.權(quán)利要求I至5中任意一項的方法，其中IL-6是可被鼠抗IL-6單克隆抗體M-BE8或M-23C7結(jié)合的IL-6。
7.權(quán)利要求I至6中任意一項的方法，其中所述樣品中IL-6或其變體的水平是通過下述來測定的 i)結(jié)合IL-6的抗體，或通過其片段或變體； )特異性結(jié)合IL-6的抗體，或其片段或變體； iii)結(jié)合可被鼠抗IL-6單克隆抗體M-BE8或M-23C7結(jié)合的IL-6的抗體，或通過其片段或變體； iv)鼠抗IL-6單克隆抗體M-BE8或M-23C7，或通過其片段或變體。
8.權(quán)利要求I的任意一項的方法，其中測定CRP代替IL-6，并且所述方法用于診斷SIRS或敗血癥。
9.權(quán)利要求I至8中任意一項的方法，其中所述無癥狀患者是選自創(chuàng)傷患者、具有燒傷的患者、接受治療的患者、接受侵入性治療的患者、接受手術(shù)介入的患者的患者。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述患者正接受侵入性治療，并且在所述治療前采集至少一次所述樣品，以及在所述治療后采集至少一次所述樣品。
11.根據(jù)權(quán)利要求I至10中任意一項的方法，其中所述方法 i)還包括通過最小侵入性步驟從所述患者收集樣品的步驟， ii)排除收集樣品的手術(shù)步驟，或 iii)是體外方法。
12.監(jiān)測無癥狀患者SIRS發(fā)作或評估發(fā)展出或罹患SIRS的風(fēng)險的方法，所述方法包括下述步驟 a)在來自所述患者的樣品中測定IL-6或其變體的水平； b)比較在步驟a)中測定的IL-6或其變體的水平與參照水平；以及 c)基于步驟b)中的比較，針對患者推薦、決定、啟動、繼續(xù)、調(diào)節(jié)或停止SIRS療法。
13.適用于進(jìn)行權(quán)利要求I至12中任意一項的方法的試劑盒，所述試劑盒包含 i)用于測定IL-6或其變體的水平的工具； )用于將測定的IL-6或其變體的水平與參照水平進(jìn)行比較的工具；以及任選地 iii)用于進(jìn)行所述方法的說明書。
14.用于在無癥狀患者的樣品中檢測IL-6或其變體的工具，其用于早期檢測或診斷發(fā)展出或罹患SIRS或敗血癥的風(fēng)險，或用于早期檢測或診斷SIRS或敗血癥。
全文摘要
本發(fā)明涉及在無癥狀患者中，優(yōu)選地在接受手術(shù)介入的患者中對全身炎性應(yīng)答綜合征(SIRS)(包括敗血癥)的早期診斷和預(yù)測的技術(shù)領(lǐng)域，特別地，提供了用于在無癥狀患者中檢測或診斷SIRS，或者用于檢測或診斷罹患或發(fā)展出SIRS的風(fēng)險的方法，所述方法包括下述步驟a)在來自患者的樣品中測定IL-6或其變體的水平；b)將步驟a)中測定IL-6或其變體的水平與參照水平相比較；c)檢測或診斷SIRS，或者檢測或診斷罹患或發(fā)展出SIRS的風(fēng)險；其中以短間隔至少兩次分離樣品，并且針對每份樣品重復(fù)步驟a)和b)。還提供了相應(yīng)的療法監(jiān)測和死亡率預(yù)測方法、部分的試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK102782501SQ201180011904
公開日2012年11月14日 申請日期2011年3月2日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月2日
發(fā)明者A-M·韋恩伯格, F-M·斯莫勒-于特納, N·紐伯克, S·格呂布 申請人:弗·哈夫曼-拉羅切有限公司