專利名稱：降鈣素原用于在具有非特異性不適的患者中診斷細(xì)菌感染和指導(dǎo)抗生素治療的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于臨床診斷學(xué)領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明涉及在從具有非特異性不適的對象的體液得到的樣品中測定降鈣素原(PCT)。
背景技術(shù)：
表現(xiàn)出非特異性不適(NSC)的患者是眾所周知但定義不明確的群體。這在例如急診部(ED)常見。受影響的個體常常主述“感覺不好”、“感覺虛弱”、“感覺精疲力竭”、“疲倦或嗜睡”、感覺“暈?！保S沭不能應(yīng)付日?；顒印⑷狈κ秤?van Bokhoven等，2008. TClin Epidemiol:61:318-22)0 一些患者可能不能回憶起他們?yōu)楹伪凰屯鵈D。在NSC患者護(hù)理期間，ED醫(yī)生面對廣泛不同的診斷，其范圍從家庭護(hù)理不足到急性的威脅生命的病情 (Gordon 1986. Geriatrics 41 (4) : 75-80)。具有NSC的患者屬于對ED醫(yī)生最具挑戰(zhàn)性的患者(Chew和 Birnbaumer 1999. Emerg Med Clin North Am 17(1): 265~78)0 此夕卜，由于諸如并發(fā)疾病、多種藥物或精神狀態(tài)改變的因素，臨床表現(xiàn)常常不清。Vanapee等證實，來到ED的老年個體中高達(dá)20%沒有特異性不適(Vanpee等，2001. Eur TEmerg Med8 (4) : 301-4)。50%的沒有特異性不適的老年個體受到急性醫(yī)療問題的閑擾(Rutschmann 等,2005. Swiss Med Wkly 135 (9-10) : 145-50)。降鈣素原(PCT)已成為診斷膿毒癥的廣泛接受的生物標(biāo)志物。PCT反映出細(xì)菌感染的嚴(yán)重性，特別被用于監(jiān)測感染發(fā)展成為膿毒癥、重癥膿毒癥或膿毒性休克?？梢允褂肞CT來測量與感染相關(guān)的全身性炎性應(yīng)答的活性、控制抗細(xì)菌療法的成功和估計預(yù)后(Assicot 等，1993. Lancet 341:515-8:Clec’hC 等，2004. Crit Care Med 32:1166-9 Lee等,2004. Yonsei Med T 45:29-37 :Meisner 等,2005. Curr Opin Crit Carell :473-480 Wunder等，2004. Inflamm Res 53:158-163)?；加心摱景Y的患者中PCT水平的增加與死亡率相關(guān)(Oberhoffer 等，1999. Clin Chem Lab Med 37:363-368)。PCT已在具有感染癥狀(例如呼吸短促、發(fā)燒)的患者中用于抗生素的治療指導(dǎo)。在來到ED的具有下呼吸道感染癥狀的患者中測量PCT，并且只對PCT濃度>0. 25ng/mL或>0. 5ng/mL 的患者用抗牛.素講行治療(Christ-Crain 等，2004. Lancet 363:600-7)。在患有社區(qū)獲得性肺炎(CAP)的患者中，基于血清PCT濃度進(jìn)行抗生素治療(PCT濃度〈O. Ing/mL時強(qiáng)烈不鼓勵；PCT濃度〈O. 25ng/mL時不鼓勵；PCT濃度>0. 25ng/mL時鼓勵，PCT濃度>0. 5ng/mL 時強(qiáng)烈鼓勵)(Christ-Crain等,2006. Am T RespCritCare Med 174:84-93)oPCT指導(dǎo)顯著降低了 CAP中抗生素的使用，并且沒有惡化患者的后果。同樣地，對急性呼吸道感染來說，使用與上述相同的決定閾值的PCT指導(dǎo)的療法，在初級護(hù)理中也顯著減少了抗生素使用，并目.不損害患者的后果(Briel 等,2008. Arch Intern Med 168:2000-7 Burkhardt等，2010. Eur Resp T Express:doi:10. 1183/09031936. 00163309)。到目前為止，使用PCT測量值診斷流行性細(xì)菌感染僅限于由于他們所表現(xiàn)出的癥狀而已經(jīng)被懷疑患有細(xì)菌感染的患者。到目前為止完全不清楚PCT的這種用法是否也可能用于表現(xiàn)出非特異性不適、但沒有直接指向細(xì)菌感染是這些不適的可能原因的患者。在這樣的患者中，細(xì)菌感染的患病率是未知的，并且它可能相對低。生物標(biāo)志物例如PCT可能能夠以有意義的靈敏度和特異性在這樣的患者群體中鑒定具有細(xì)菌感染的患者，這是極富挑戰(zhàn)性并且一點也不是顯而易見的，這是因為有許多其他患者并沒有細(xì)菌感染，他們明確有病，并且他們可能病得非常嚴(yán)重。到目前為止，已經(jīng)在懷疑患有細(xì)菌感染的患者中進(jìn)行了PCT測定，因為所述患者顯示出指向細(xì)菌感染的癥狀或表現(xiàn)出指向細(xì)菌感染的不適。還從未實踐過測量PCT水平以意圖在具有非特異性不適的患者中診斷流行性細(xì)菌感染。通過測定PCT的濃度來確定炎性過程的病因?qū)W并從肽的存在或不存在來確定所述炎癥是感染性還是非感染性起因的診斷方法，描述在EP 080702B1中。令人吃驚地發(fā)現(xiàn)，在來自于表現(xiàn)出非特異性不適的患者的體液的樣品中測量降鈣素原水平，可用于在這些患者中進(jìn)行細(xì)菌感染的診斷和治療指導(dǎo)。發(fā)明概述本發(fā)明涉及在來到急診部的具有非特異性不適的患者中診斷或鑒定細(xì)菌感染的 方法。所述方法包括下列步驟(i)提供來自于表現(xiàn)出非特異性不適的患者的樣品；(ii)測定所述樣品中降鈣素原(PCT)或長度為至少12個氨基酸、優(yōu)選長度在50個以上氨基酸、更優(yōu)選長度110個以上氨基酸的其片段的水平；以及(iii)通過將所述測定到的PCT水平與預(yù)定的閾值水平進(jìn)行比較，來確定所述患者是否具有細(xì)菌感染。本發(fā)明還涉及這樣的方法在向表現(xiàn)出非特異性不適的患者給藥抗生素提供治療指導(dǎo)、以及在監(jiān)測抗生素治療中的引用。


圖I :來到ED的具有非特異性不適、并且具有和不具有感染的患者的PCT濃度(到院時)。圖2 :用于在來到ED的具有非特異性不適的患者中診斷細(xì)菌感染的ROC圖。圖3:在BANC研究中具有非特異性不適的患者的鑒定。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在表現(xiàn)出非特異性不適的患者中診斷或鑒定細(xì)菌感染的方法。所述方法包括下列步驟(i)提供來自于表現(xiàn)出非特異性不適的患者的樣品；(ii)測定所述樣品中降鈣素原(PCT)或長度為至少12個氨基酸、優(yōu)選長度50以上個氨基酸、更優(yōu)選長度110以上個氨基酸的其片段的水平；以及(iii)通過將所述測定到的PCT水平與預(yù)定的閾值水平進(jìn)行比較，來確定所述患者是否具有細(xì)菌感染。在本發(fā)明的一個實施方案中，在表現(xiàn)出非特異性不適的患者中細(xì)菌感染是無癥狀的(例如尚未顯示出臨床癥狀但存在的細(xì)菌感染)。非特異性不適可以選自但不限于下列不適“感覺不好”、“感覺虛弱”、“感覺精疲力竭”、“疲倦或嗜睡”、感覺“暈?！保狈κ秤?，或僅僅主訴不能應(yīng)付日?；顒?，或者患者可能不能回憶起他們?yōu)楹伪凰屯鵈D。特異性不適通常提供關(guān)鍵信息，并允許產(chǎn)生工作診斷或遵從預(yù)定的診斷方案。特異性不適本身在文獻(xiàn)中是認(rèn)識清楚的，并且診斷方案往往是適用的(Siegenthalerff.《內(nèi)科學(xué)中的·^別診斷從癥>1犬至"診斷》(Differential Diagnosis in InternalMedicine:From Symptom to Diagnosis), New York:Thieme Medical Publishers:2007)。在特異性不適中存在著這樣的不適，在所述不適中感染、特別是細(xì)菌感染，通常被認(rèn)為是不適的原因。這些特異性不適隨著細(xì)菌的類型和細(xì)菌感染的部位而變。這樣的特異性不適可以選自但不限于下列不適頭痛，身體特定部位(例如腹部)中的疼痛，發(fā)燒(>38°C)，選自咳嗽、生痰、呼吸困難、呼吸急促和肋膜疼痛的呼吸癥狀，聽診期間的一種發(fā)現(xiàn)(例如羅音、捻發(fā)音)，感染的一種體征(核心體溫>38°C、顫抖)和消化道感染的一種體征(惡心、嘔吐、腹瀉)。其他特異性不適概述如下細(xì)菌感染的經(jīng)典癥狀是局部發(fā)紅、發(fā)熱、腫脹和疼痛。細(xì)菌感染的標(biāo)志之一是局部疼痛，身體特定部位中的疼痛。例如，如果發(fā)生割傷并且它被細(xì)菌感染，將在感染位點處發(fā)生疼痛。細(xì)菌性咽喉痛常常以咽喉的一側(cè)更加疼痛為特征。如果疼痛僅僅發(fā)生在一只耳中， 耳部感染更可能是細(xì)菌性的。如上所述，細(xì)菌感染的癥狀隨著感染類型而不同。取決于被感染的區(qū)域，癥狀可能變化。然而，總是會出現(xiàn)癥狀，即使當(dāng)所述區(qū)域輕微感染時也是如此。當(dāng)在呼吸道中存在細(xì)菌感染時，發(fā)現(xiàn)與咽喉和呼吸相關(guān)的癥狀。咽喉感染在生活在高污染地區(qū)的人中非常常見。肺炎在自然免疫力非常低的兒童和老年人中非常常見。竇炎和咽炎也見于患有細(xì)菌感染的人中。當(dāng)呼吸道中存在細(xì)菌感染時，常常出現(xiàn)有色鼻分泌物和頭痛。當(dāng)消化道中存在感染時(例如胃腸炎)，癥狀大多與消化問題相關(guān)。通常發(fā)生胃的炎癥和疼痛。腹瀉和嘔吐是指示腸胃道感染的其他癥狀。作為嚴(yán)重細(xì)菌感染癥狀的結(jié)果，也可能發(fā)生惡心和脫水。陰道區(qū)域中的臭味或魚腥味是陰道感染的癥狀。女性陰道具有幾類對器官有益的細(xì)菌。然而，如果這種類型的細(xì)菌的產(chǎn)生不規(guī)則，它可能引起感染。對于尿路感染來說，細(xì)菌感染的癥狀包括小便器官瘙癢和疼痛。陰道感染和尿路感染不應(yīng)被忽視，因為它們可能引起內(nèi)部器官的進(jìn)一步炎癥。腦脊膜炎是覆蓋腦和脊髓的膜的細(xì)菌感染的嚴(yán)重結(jié)果。盡管它也可見于成年人，但嬰兒對這種問題更加易感。腦脊膜炎的常見細(xì)菌感染癥狀是身體和頸部僵硬、頭痛、煩躁、發(fā)燒或低于正常體溫以及皮疹。最危險的細(xì)菌感染引起膿毒癥，這是一種引起致死性器官機(jī)能障礙的嚴(yán)重病癥。發(fā)燒和身體的重度顫抖是膿毒癥的細(xì)菌感染癥狀。患有膿毒癥的患者還感覺關(guān)節(jié)疼痛。這必須被立即治療以阻止感染蔓延至內(nèi)部器官。在膿毒癥的情況下，患者將住院進(jìn)行強(qiáng)化治療。丹毒是真皮的急性細(xì)菌感染，引起炎癥?；颊叩湫偷卦谧畛醺腥镜?8小時內(nèi)發(fā)生包括高燒、顫抖、寒戰(zhàn)、頭痛、嘔吐的癥狀。紅斑狀皮膚病變快速擴(kuò)大，并具有界限明顯的升高的邊緣。它表現(xiàn)為紅色、腫脹、發(fā)熱、硬化和疼痛的皮疹，在堅實度方面類似于橘皮。更嚴(yán)重的感染可以引起水皰、大皰和瘀斑，并可能引起皮膚壞死。淋巴結(jié)可能腫脹，并可能發(fā)生淋巴水腫。偶爾可見延伸至淋巴結(jié)的紅線。感染可能發(fā)生在皮膚的任何部位，包括面部、手臂、手指、腿和腳趾，但是它傾向于偏好肢端。對感染最為易感的是脂肪組織，以及典型在目艮、耳和頰周圍的面部區(qū)域。腹膜炎是腹膜、即圍住腹腔和內(nèi)臟部分的漿膜的炎癥。腹膜炎可以是局部或廣泛性的，并可能由感染引起(經(jīng)常由中空器官的破裂造成，正如在腹部創(chuàng)傷或闌尾炎中可能發(fā)生的)。腹膜炎的主要癥候是急性腹痛、腹部觸痛和腹壁緊張。這些癥候的位置取決于腹膜炎是局部性(例如穿孔前的闌尾炎或憩室炎)還是遍布于整個腹部。在任一種情況下，疼痛典型地作為廣泛性腹痛(涉及內(nèi)臟腹膜層的局部神經(jīng)支配不良)開始，并且在晚些時候可能變成局部性的(涉及體神經(jīng)支配的周壁腹膜層)。一部分胃腸道的穿孔和腹膜破裂是感染性腹膜炎的最常見原因。膽管炎是膽管的炎癥。最常見的原因是細(xì)菌感染。膽管炎的典型三聯(lián)征是發(fā)燒、黃疸和右上腹部疼痛。膽囊炎是膽囊的炎癥，并通常表現(xiàn)為右上腹疼痛。這通常伴有低度發(fā)燒、嘔吐和惡心。
骨髓炎是指骨或骨髓的感染。一般來說，微生物可能通過三種基本方法中的一種或多種感染骨通過血流，與局部感染區(qū)域鄰近，或穿透性創(chuàng)傷，包括醫(yī)源性原因例如關(guān)節(jié)置換或骨折的內(nèi)部固定或根管填充術(shù)后的牙齒。骨髓炎的體征和癥狀包括發(fā)燒、感染區(qū)域疼痛、感染區(qū)域上腫脹、發(fā)熱和發(fā)紅。http://en. wikipedia. org/wiki/Infection:“非特異性”不適的分類蘊(yùn)含了 ED醫(yī)生的主觀判斷。這樣的判斷依賴于與醫(yī)生相關(guān)的因素，例如臨床經(jīng)驗和技巧以及對可能指導(dǎo)進(jìn)一步評估的不同不適進(jìn)行權(quán)重。與患者相關(guān)的因素包括以言語表達(dá)不適的能力或患者的認(rèn)知狀態(tài)。作為一般性范圍，NSC的定義旨在縮小患者分類中的主觀性，并且由此促進(jìn)結(jié)構(gòu)化的主動的患者管理。特異性不適通常提供關(guān)鍵信息，并允許產(chǎn)生工作診斷或遵從預(yù)定的診斷方案。特異性不適本身在文獻(xiàn)中是認(rèn)識清楚的，并且診斷方案經(jīng)常是適用的(Marx J A, HockberserR, Walls R.《Rosen 急診醫(yī)學(xué):概念和臨床》(Rosen' s EmerRency Medicine:ConceptsandClinical),第六版，St Louis:Mosbv 主編,2005 :SieRenthaler ff.《內(nèi)科學(xué)中的I另[J診斷從癥狀至丨J診斷》(Differential DiaRnosis in Internal Medicine:From SymptomtoDiaRnosis), New York:Thieme Medical Publishers:2007)。與特異性不適相反，NSC作為所有不適的整體來定義，這樣的不適不是成組的特異性不適或體征的一部分，或者在這樣的情況下不能建立初始工作診斷。優(yōu)選將NSC定義為排除特異性不適后的剩余病癥，因為主動性定義可能需要幾乎無限地枚舉可能的非特異性不適。這種長且復(fù)雜的定義可能排除某些NSC患者，因為他們的癥狀不能與預(yù)定的名單完全匹配。因此，在本申請中提供的NSC名單可能不完整。在本發(fā)明的NSC定義的情形中，術(shù)語工作診斷用于患者表現(xiàn)出NSC、但根據(jù)在顯現(xiàn)時的事實和發(fā)現(xiàn)仍可能進(jìn)行診斷的情形(例如表現(xiàn)出虛弱和貧血性蒼白的患者)。圖3以程式性方式歸納了該定義。在最優(yōu)選實施方案中，非特異性不適被定義為根據(jù)圖3可以被包含的不適。這意味著本發(fā)明的患者不表現(xiàn)出下列不適之一疼痛(胸、腹、頭、腿、關(guān)節(jié)、背)，呼吸困難，咳嗽，虛弱(局部)，中風(fēng)樣癥狀，肢端(腿、手臂)腫脹，腹瀉，排尿困難，GCS〈14，意識不清，中毒，抽搐，出血，暈厥，焦慮，精神癥狀，自殺意念，皮膚病變，過敏性皮膚反應(yīng),發(fā)燒,眩暈,心悸,惡心伴有嘔吐,外傷。此外,對于在初始評估(病史、身體檢查、ECG讀取)后是否存在引起標(biāo)準(zhǔn)化檢查或治療的主要不適這一問題，答案是“否”。此外，在所述患者中，生命指征(體溫，脈搏或心率，血壓和呼吸率)都不超出范圍。此外，在初始評估后不能、特別是不能以足夠的確定性建立工作診斷。在本發(fā)明的非常特別的實施方案中，從具有NSC的所述患者組中優(yōu)選排除了患有原發(fā)疾病的那些患者，這樣的原發(fā)疾病優(yōu)選不是感染和/或優(yōu)選選自動脈硬化、心力衰竭、急性冠脈綜合征、冠心病、心肌梗塞、癌癥、糖尿病、慢性胃腸疾病、慢性腎病、高血壓、骨科疾病包括骨質(zhì)疏松癥、和神經(jīng)變性疾病包括阿茲海默氏病。在本發(fā)明的情形中，術(shù)語“水平”涉及在從對象獲取的樣品中PCT (或前體/片段)的濃度(優(yōu)選用重量/體積來表示；w/v)。本文中使用的術(shù)語“患者”是指由于疾病而接受醫(yī)療護(hù)理或應(yīng)接受醫(yī)療護(hù)理的活的人類或非人類生物體。這包括患有正對其病理體征進(jìn)行研究的未確定疾病的人。因此，本文描述的方法和分析方法適用于人類和獸醫(yī)疾病兩者。當(dāng)在本文中使用時，術(shù)語“樣品”是指出于對目標(biāo)對象例如患者進(jìn)行診斷、預(yù)后或 評估的目的而獲得的體液樣品。優(yōu)選的測試樣品包括血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液、痰液和胸腔積液。此外，本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員將會認(rèn)識到，某些測試樣品在分級或純化程序、例如將全血分離成血清或血漿組分后，將更容易分析。因此，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，樣品選自血液樣品、血清樣品、血漿樣品、腦脊液樣品、唾液樣品和尿液樣品，或上面提到的任何樣品的提取物。優(yōu)選，樣品是血液樣品，最優(yōu)選為血清樣品或血漿樣品。當(dāng)在本文中在蛋白質(zhì)或肽的情形中提到時，術(shù)語“片段”是指可以源自于較大的蛋白質(zhì)或肽的較小蛋白質(zhì)或肽，因此其包含較大蛋白質(zhì)或肽的部分序列。所述片段可以從較大的蛋白質(zhì)或肽通過其一個或多個肽鍵的皂化來產(chǎn)生。在本發(fā)明的情形中，降鈣素原優(yōu)選是指跨越氨基酸殘基1-116、2-116或3_116的肽或其片段。因此，降鈣素原片段的長度為至少12個氨基酸，優(yōu)選50個以上氨基酸，更優(yōu)選110個以上氨基酸。PCT可以包含翻譯后修飾例如糖基化、脂質(zhì)化或衍生化。PCT本身是降鈣素和鈣抑肽的前體。PCT 1-116的氨基酸序列在SEQ ID NO: I中給出。在本發(fā)明的情形中，“診斷”涉及對象中細(xì)菌感染的識別和(早期)檢測，并且也可以包含鑒別診斷。診斷測試的靈敏度和特異性不僅取決于測試的分析“質(zhì)量”，而且它們還取決于構(gòu)成異常結(jié)果的定義。在實踐中，典型地通過將“正常”(即表觀健康的)和“患病”群體(即患有感染的患者)的變量值對其相對頻率進(jìn)行作圖，計算出接受者工作特征曲線(R0C曲線)。取決于所致力解決的具體診斷問題，參比組絕不一定是“正常的”，而可以是患有另一種疾病或病癥的患者組，所述患者組應(yīng)與目標(biāo)疾病組區(qū)分開。對于任何特定標(biāo)志物來說，患有或未患疾病的對象的標(biāo)志物水平分布可能交疊。在這些條件下，測試不能以100%準(zhǔn)確性絕對辨別正常與疾病，并且交疊的區(qū)域表示測試不能辨別正常與疾病的地方。選擇一個閾值，高于它(或低于它，取決于標(biāo)志物隨著疾病如何變化)時測試被認(rèn)為是異常的，低于它時測試被認(rèn)為是正常的。ROC曲線下的面積是察覺到的測量值將允許正確鑒定病癥的概率的度量。即使在測試結(jié)果不一定給出準(zhǔn)確數(shù)字的情況下，ROC曲線也能使用。只要人們能夠?qū)Y(jié)果排序，人們即可產(chǎn)生ROC曲線。例如，對“患病”樣品進(jìn)行的測試的結(jié)果可以按照程度排序(例如1=低，2=正常，3=高)。這種排序可以與“正?！比后w中的結(jié)果相關(guān)聯(lián)，并產(chǎn)生ROC曲線。這些方法在本技術(shù)領(lǐng)域中是公知的(參見例如Hanley等，1982. Radiologyl43:29-36)。優(yōu)選，所選的閾值能夠提供大于約O. 5、更優(yōu)選大于約O. 7的ROC曲線面積。在這種語境中，術(shù)語“約”是指給定測量值的+/_5%。ROC曲線的水平軸表示(I-特異性)，其隨著假陽性率而增加。曲線的垂直軸表示靈敏度，其隨著真陽性率而增加。因此，對于所選的具體截止值來說，可以測定(I-特異性)的值，并可以獲得相應(yīng)的靈敏度。ROC曲線下的面積是測量到的標(biāo)志物水平將允許正確鑒定疾病或病癥的概率的度量。因此，ROC曲線下的面積可用于確定測試的有效性。按照本發(fā)明的方法，當(dāng)所述測定到的PCT水平高于預(yù)定閾值水平時，患者被診斷為具有細(xì)菌感染。優(yōu)選，預(yù)定閾值水平在O. 02至O. 5ng/mL之間，更優(yōu)選在O. 02ng/mL至O. 25ng/mL之間，更加優(yōu)選在O. 02ng/mL至O. Ing/mL之間，更加優(yōu)選在O. 02ng/mL至O. 06ngmL之間,最優(yōu)選在O. 02ng/mL至(低于)0. 05ng/mL之間。在優(yōu)選實施方案中，當(dāng)所述測定到的PCT水平高于O. Ing/mL、優(yōu)選高于O. 05ng/mL、更優(yōu)選高于O. 025ng/mL時，患 者被診斷為具有細(xì)菌感染。這些值使用PCT測試格式(靈敏型BRAHMS PCT LIA)來測定，其在定量測量范圍內(nèi)與自動化PCT分析法(靈敏型BRAHMS RYPT0RPCT)具有相同的校準(zhǔn)。BRAHMS PCT LIA靈敏型能夠在正常群體中定量測定PCT水平，給出中值PCT水平，如EP 09011073. 5 (“用于在無癥狀群體中診斷不良事件的降I丐素原(Procalcitonin for the prognosis of adverseevents in the asymptomatic population)”)中所述。在其他PCT分析法中，如果它們與靈敏型BRAHMS PCT LIA進(jìn)行的校準(zhǔn)不同，上面提到的值可能不同。因此，在考慮到校準(zhǔn)的差別后，上面提到的值將適用于這樣的校準(zhǔn)不同的PCT分析法。一種可能的校準(zhǔn)差別的定量，是通過使用這兩種方法測量樣品中的PCT，對所討論的PCT分析法與靈敏型BRAHMS PCTLIA進(jìn)行方法比較分析(關(guān)聯(lián)性)。另一種可能是只要所討論的PCT分析法具有足夠的分析靈敏度，使用該分析法測定代表性正常群體的中值PCT水平，如EP 09011073.5 (“用于在無癥狀群體中診斷不良事件的降I丐素原(Procalcitonin for the prognosis of adverseevents in the asymptomatic population)”)中所述將結(jié)果與所述中值PCT水平進(jìn)行比較，并根據(jù)該比較獲得的差異來重新計算校準(zhǔn)。在本文中，PCT或片段或其前體或片段的水平的測定，使用檢測方法和/或診斷分析法來執(zhí)行。當(dāng)在本文中提到時，“分析法”或“診斷分析法”可以是在診斷學(xué)領(lǐng)域中應(yīng)用的任何類型的分析法。這樣的分析法可以基于待檢測的分析物與具有一定親和性的一種或多種捕獲探針的結(jié)合。對于捕獲分子與靶分子或目標(biāo)分子之間的相互作用來說，親和常數(shù)優(yōu)選大于 IO8M'在本發(fā)明的上下文中，“捕獲分子”是可用于結(jié)合來自樣品的靶分子或目標(biāo)分子、即分析物(即在本發(fā)明的情況下是心血管肽)的分子。因此，捕獲分子必須在空間上和表面特征例如表面電荷、疏水性、親水性、是否存在路易斯供體和/或受體上適當(dāng)塑造，以特異性結(jié)合靶分子或目標(biāo)分子。因此，結(jié)合可以由例如捕獲分子與靶分子或目標(biāo)分子之間的離子、范德華、η-ii、S-Ji、疏水或氫鍵相互作用或兩種以上上面提到的相互作用的組合來介導(dǎo)。在本發(fā)明的情形中，捕獲分子可以例如選自核酸分子、糖類分子、RNA分子、蛋白質(zhì)、抗體、肽或糖蛋白。優(yōu)選，捕獲分子是抗體，包括與靶或目標(biāo)分子具有足夠親和性的其片段，并包括重組抗體或重組抗體片段，以及所述抗體的化學(xué)和/或生物化學(xué)修飾的衍生物或源自于長度為至少12個氨基酸的其變異鏈的片段。優(yōu)選的檢測方法包括各種格式的免疫分析法，例如放射免疫分析法(RIA)、化學(xué)發(fā)光和熒光免疫分析法、酶聯(lián)免疫分析法(ELISA)、基于Luminex的珠子陣列、蛋白質(zhì)微陣列分析法，以及快速檢測格式例如免疫層析試條測試。分析法可以是均相或非均相分析法、競爭和非競爭性夾心分析法。在特別優(yōu)選的實施方案中，分析法采用夾心分析法形式，其是非競爭性免疫分析法，其中待檢測和/或定量分子與第一抗體并與第二抗體結(jié)合。第一抗體可以結(jié)合到固相例如珠子上、孔或其他容器的表面上、芯片或試條上，并且第二抗體是例如用染料、放射性同位素或反應(yīng)性或催化活性部分標(biāo)記的抗體。然后通過適合的方法測量與分析物結(jié)合的標(biāo)記抗體的量?！皧A心分析法”所涉及的通用組合物和程序是久已確立的，并為專業(yè)技術(shù)人員所公知。疫分析手冊》(The Tmmun ο a. s say Handbook), David Wild 主編，Elsevier LTD, Oxford 第三版(2005 年 5 月)，ISBN-13:978-0080445267 :HultschigC 等，Curr Qpin Chem Biol. 2006Feb: 10(1) :4-10. PMID: 16376134,在此引為參考)。在特別優(yōu)選的實施方案中，分析方法包含兩種捕獲分子，優(yōu)選為二者都作為在液體反應(yīng)混合物中分散體而存在的抗體，其中第一種標(biāo)記組分附著在第一種捕獲分子上，其中所述第一種標(biāo)記組分是基于熒光或化學(xué)發(fā)光淬滅或擴(kuò)增的標(biāo)記系統(tǒng)的一部分，并且所述標(biāo)記系統(tǒng)的第二種標(biāo)記組分附著于第二種捕獲分子上，使得當(dāng)兩種捕獲分子與分析物結(jié)合后產(chǎn)生可測量信號，允許檢測在包含樣品的溶液中形成的夾心復(fù)合物。更加優(yōu)選，所述標(biāo)記系統(tǒng)包含稀土穴狀化合物或稀土螯合物與熒光染料或化學(xué)發(fā)光染料、特別是花青類型的染料的組合。在本發(fā)明的情形中，基于熒光的分析法包含使用染料，所述染料可以例如選自FAM (5-或6-羧基熒光素)、VIC、NED、熒光素、熒光素異硫氰酸酯(FITC)、IRD-700/800、花青染料例如CY3、CY5、CY3. 5、CY5. 5、Cy7、占噸、6-羧基-2’，4’，7’，4，7-六氯熒光素(HEX)、TET、6-羧基-4’，5’ -二氯-2’，7’ -二甲氧基熒光素(J0E)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基羅丹明(TAMRA)、6-羧基-X-羅丹明(R0X)、5_羧基羅丹明_6G (R6G5)、6_羧基羅丹明-6G (RG6)、羅丹明、羅丹明綠、羅丹明紅、羅丹明110、BODIPY染料例如BODIPYTMR、俄勒網(wǎng)綠、香豆素類例如傘形酮、苯并亞胺類例如Hoechst 33258 ;菲啶類例如德克薩斯紅、雅吉瓦黃、Alexa Fluor、PET、溴化乙錠、吖啶類染料、咔唑染料、吩噁嗪染料、葉啉染料、聚甲炔染料等。在本發(fā)明的情形中，基于化學(xué)發(fā)光的分析法包含根據(jù)化學(xué)發(fā)光材料的物理原理使用染料，所述原理描述在Kirk-Othmer的《化學(xué)技術(shù)全書》(Encyclopedia ofchemical technology)第四版，J. I. Kroschwitz 執(zhí)行主編，M. Howe-Grant 編輯，John Wiley&Sons, 1993，vol. 15，p. 518-562中，在此引為參考，包括在551-562頁中的引用文獻(xiàn)。優(yōu)選的化學(xué)發(fā)光染料是吖啶酯。正如本技術(shù)領(lǐng)域的專業(yè)人員所知，用本發(fā)明的方法可能診斷的細(xì)菌感染可以用適合的抗生素來治療?？赡艿目股仡悇e選自青霉素類(例如氟氯西林、阿莫西林、氨芐西林、美洛西林)，頭孢菌素類(例如頭孢唑啉、頭孢呋辛、頭孢噻肟、頭孢克洛、頭孢氨芐)，β -內(nèi)酰胺酶抑制劑(例如舒巴坦、他佐巴坦)，四環(huán)素類(例如多西環(huán)素、米諾環(huán)素、四環(huán)素、土霉素)，氨基糖苷類(例如慶大霉素、新霉素、鏈霉素)，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(例如阿奇霉素、克拉霉素、紅霉素、羅紅霉素、螺旋霉素、克林霉素)，林可酰胺類(例如林可霉素)，旋轉(zhuǎn)酶抑制劑(例如環(huán)丙沙星、氧氟沙星、諾氟沙星)，磺胺類，甲氧芐啶類，糖肽類抗生素(例如萬古霉素)，多肽類抗生素(例如多粘菌素E、多粘菌素)和酰胺醇類(例如氯霉素)。此外，本發(fā)明涉及包含針對PCT或其片段或針對PCT前體或其片段的一種或多種抗體的試劑盒在具有非特異性不適的患者中診斷細(xì)菌感染的用途。
實施例入院時提供了近期外部實驗室結(jié)果或特定ECG變化(例如STEMI)的任何患者是不合格者。同樣地，送到ED的患有已知晚期醫(yī)學(xué)病癥(例如末期癌癥)的患者是不合格者。如果患者血液動力學(xué)不穩(wěn)定或者如果重要參數(shù)明顯在正常范圍之外(例如收縮壓<90mmHg,心率>120/min，體溫>38. 4或〈35. 6°C，呼吸速率>30/min)，將他們排除。感染的診斷 在研究中總共包括了 415位患者。這415位患者中有86位被診斷患有細(xì)菌感染(肺炎n=19，膀胱炎n=17，尿路感染n=8，膿毒癥n=7，尿膿毒癥n=10，膿毒性休克n=l，支氣管炎n=3,未知局部感染n=9,腹膜炎n=l,骨髓炎n=，I, σ -憩室炎η=1,結(jié)腸炎n=l, COPD伴有急性惡化η=2,膽管炎η=1,膽囊炎η=，I,丹毒η=2,胃腸炎η=2)。在本研究中，感染的診斷按照標(biāo)準(zhǔn)判據(jù)來進(jìn)行溫度>37.5°C，白細(xì)胞計數(shù)>11000/mL或〈4000/mL，胸部χ-射線上肺部浸潤，或病原體培養(yǎng)物陽性。如上所概述的，這415位患者中的86位被診斷患有細(xì)菌感染(例如LRTI、尿路感染、膿毒癥、膿毒性休克)。下呼吸道感染(LRTI)包括急性支氣管炎、慢性阻塞性肺病(COPD)的急性惡化和肺炎?；加蠰RTI的患者表現(xiàn)出選自咳嗽、生痰、呼吸困難、呼吸急促和肋膜疼痛的至少一種呼吸道癥狀，以及此外聽診期間的至少一種發(fā)現(xiàn)(羅音、捻發(fā)音)或感染體征之一(核心體溫>38°C，顫抖，白細(xì)胞計數(shù)>10G/1或〈4G/1個細(xì)胞)。尿路感染(UTI)的診斷是基于下述判據(jù)中的兩個發(fā)燒(>38°C)，尿樣對亞硝酸鹽陽性，白細(xì)胞尿和顯著細(xì)菌尿。膿毒癥、重癥膿毒癥和膿毒性休克按照標(biāo)準(zhǔn)判據(jù)來定義(Levy等,《001年SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS 國際膿毒癥定義大會》(2001SCCM/ESICM/A CCP/A TS/SIS InternationalSepsis Definitions Conference) . Crit Care Med 2003;31:1250-1256)。PCT的測量如MorRenthaler 等(MorRenthaler 等 2002. Clin Chem 48:788-790)中所述，使用功能分析靈敏度為O. 007ng/mL的超靈敏可商購測試系統(tǒng)來測量PCT。簡單來說，產(chǎn)生針對PCT的降鈣素部分的綿羊抗體，并產(chǎn)生針對PCT的鈣抑肽部分的小鼠單克隆抗體。將試管用抗I丐抑肽抗體包被。將抗降I丐素抗體用MACN π丫唳酯標(biāo)記(InVent GmbH, Hennigsdorf,德國)并用作示蹤劑。將重組PCT在正常馬血清中的稀釋液用作校準(zhǔn)物。將IOOyL樣品或標(biāo)準(zhǔn)品在包被的試管中溫育30分鐘，加入200 u L不! 示劑。在進(jìn)一步溫育2小時后，將試管用ImL LIA清洗溶液(BRAHMS AG, Hennigsdorf，德國)清洗4次，并使用LB952T照度計(BerthoId，Wi Idbad，德國)測量結(jié)合的化學(xué)發(fā)光。結(jié)果在研究中包括總共415位患者。具有非特異性不適的患者在來到急診部后立即測定其血漿樣品中的降鈣素原水平。這415位患者中的86位被診斷患有細(xì)菌感染。具有非特異性不適并患有和未患細(xì)菌感染的患者的PCT濃度顯示在圖I中?；加屑?xì)菌感染的患者與未患細(xì)菌感染的患者相比，PCT濃度明顯更高(p〈0. 0001)。ROC圖分析揭示出曲線下面積(AUC)為O. 721 (p<0. 0001) (&2)0使用了不同的截止值來確定相應(yīng)的靈敏度和特異性(表 I)。序列SEQ ID NO 1 (PCT 的氨基酸序列)I APFRSALESS PADPATLSED EARLLLAALV QDYVQMKASE LEQEQEREGS51 SLDSPRSKRC GNLSTCMLGT YTQDFNKFHT FPQTAIGVGA PGKKRDMSSD
101 LERDHRPHVS MPQNAN
權(quán)利要求
1.一種用于在來到急診部的具有非特異性不適的患者中診斷細(xì)菌感染的方法，所述方法包括下列步驟 (i)提供來自于表現(xiàn)出非特異性不適的患者的樣品； (ii)測定所述樣品中降鈣素原(PCT)或其長度為至少12個氨基酸的片段的水平；以及 (iii)通過將所述測定到的PCT水平與預(yù)定的閾值水平進(jìn)行比較，來確定所述患者是否具有細(xì)菌感染。
2.權(quán)利要求I的方法，其中所述樣品是體液，特別是血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、唾液或胸腔積液。
3.權(quán)利要求I和2的方法，其中所述PCT片段或PCT前體的片段具有至少12個氨基酸殘基的長度。
4.權(quán)利要求I至3的方法,其中所述預(yù)定的閾值水平在O.02ng/mL至O. 5ng/mL之間，更優(yōu)選在O. 02ng/mL至O. 25ng/mL之間，更加優(yōu)選在O. 02ng/mL至O. Ing/mL之間，更加優(yōu)選在O. 02ng/mL至O. 06ng/mL之間，最優(yōu)選在O. 02ng/mL至(低于)O. 05ng/mL之間。
5.權(quán)利要求I至4的方法，其中當(dāng)所述測定到的PCT水平高于所述預(yù)定的閾值水平時，所述患者具有細(xì)菌感染。
6.權(quán)利要求I至5的方法，其使用功能分析靈敏度低于O.06ng/mL的PCT檢測分析法。
7.權(quán)利要求I至6的方法，其中所述細(xì)菌感染選自下呼吸道感染、感染、尿路感染、陰道感染、膿毒癥、重癥膿毒癥、膿毒性休克、消化道感染、腹膜炎、膀胱炎、結(jié)腸炎、細(xì)菌性腦膜炎、竇炎、咽炎、膽管炎、膽囊炎、骨髓炎、丹毒、腹膜炎、膽管炎、膽囊炎、骨髓炎。
8.權(quán)利要求I至7的方法，其中所述細(xì)菌感染可以用抗生素治療。
9.權(quán)利要求I至8的方法，其中所述細(xì)菌感染沒有細(xì)菌感染的臨床癥狀。
10.權(quán)利要求I至9的方法，其還包括下列步驟 (iv)向患者給藥抗生素或不給藥抗生素。
11.權(quán)利要求I至9的方法，其還包括下列步驟 測定至少一種其他標(biāo)志物例如C-反應(yīng)性蛋白(CRP)的水平。
12.權(quán)利要求I至11的方法在向來到急診部的具有非特異性不適的患者給藥抗生素提供治療指導(dǎo)的用途。
13.權(quán)利要求I至11的方法在使用抗生素治療來到急診部的具有非特異性不適的患者中的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在具有非特異性不適的患者中診斷細(xì)菌感染的方法，所述方法包括下列步驟(i)提供來自于表現(xiàn)出非特異性不適的患者的樣品；(ii)測定所述樣品中降鈣素原(PCT)或長度為至少12個氨基酸的其片段的水平；以及(iii)通過將所述測定到的PCT水平與預(yù)定的閾值水平進(jìn)行比較，來確定所述患者是否具有細(xì)菌感染。本發(fā)明還涉及使用該方法為向具有非特異性不適的患者給藥抗生素提供治療指導(dǎo)。本發(fā)明還涉及該方法在用抗生素治療具有非特異性不適的患者中的用途。
文檔編號G01N33/569GK102822675SQ201180012896
公開日2012年12月12日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月8日
發(fā)明者約阿希姆·斯特魯克, 克里斯蒂安·尼克爾, 羅蘭德·賓吉瑟爾, 斯溫·吉爾斯多夫, 奧利弗·哈特曼 申請人:B.R.A.H.M.S 有限公司