專利名稱：免疫測定標準物以及利用內(nèi)部測定校準標準物測量臨床生物標志物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的組合物，能夠在免疫測定中用作參照標準物和校準物以測量臨床生物標志物。本發(fā)明還涉及使用所述組合物的方法和包含所述組合物的試劑盒。
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背景技術(shù)：
淀粉樣蛋白β (Αβ)肽是由淀粉樣蛋白前體蛋白(APP)通過β分泌酶和Y分泌酶酶復(fù)合物被剪切而生成的(Wolfe, Biochemistry, 45:7931-7939 (2006))。β分泌酶生成這些淀粉樣蛋白肽的N末端,而Y分泌酶生成C末端(Wolfe, Biochemistry, 45:7931-7939 (2006))。后來人們制成了數(shù)種肽，長度典型地為38-42個氨基酸不等，取決于、分泌酶在哪里切割ΑΡΡ。Αβ肽具有一個胞外域(氨基酸1-28)和一個包埋在脂雙層膜內(nèi)的跨膜域(氨基酸29-42)。長度為42個氨基酸的淀粉樣蛋白肽(Αβ42)被認為是假定的神經(jīng)毒性種類，或是單獨地，或是作為聚集體。人們懷疑這些聚集體對腦的神經(jīng)變性起貢獻，結(jié)果導致阿爾茨海默病和癡呆。A β 42對臨床癡呆起貢獻的假說稱為淀粉樣蛋白級聯(lián)假說，如Hardy等人所述(Science, 256:184-185 (1992))。Αβ肽的特征之一是在生理濃度下自組裝成為寡聚體的能力(Burdick etal. , Journal of Biological Chemistry, 267:546-554(1992) ;Cerf et al. , BiochemicalJournal, 421:415-423 (2009).)。Αβ 42種類較之Αβ 4(l和Αβ 38種類更易于形成寡聚體。已經(jīng)證明寡聚體形成的機制是起源于位于氨基酸16-20處的一個小的五氨基酸區(qū)域(KLVFF)，其介導Αβ肽們以反平行的方式結(jié)合。這個小區(qū)域因此得名“聚集域”(Tjernberg etal. , Journal of Biological Chemistry, 271:8545-8548 (1996))。在特定的條件下,尤其是在低PH范圍，Αβ肽聚集體的組裝很迅速(即在數(shù)分鐘之內(nèi))，而在中性或更高的pH動力學則較之為慢(Burdick et al. , Journal of Biological Chemistry, 267:546-554 (1992))。聚集體在水性條件下，尤其是在鹽存在下不易溶。Αβ肽的C末端藉由鹽橋折疊翻過二聚體的中心，從而增加它們的疏水性并促進肽們進一步聚合形成纖絲或原纖維。Αβ42種類中額外的兩個C末端殘基提供較之其他的A β種類增加的疏水性(Kim et al. , Journal ofBiological Chemistry, 280:35069-35076 (2005))。臨床數(shù)據(jù)提示，癡呆和認知減退與Aβ 42濃度的相關(guān)性比與Αβ 4(|或Αβ 38種類更高。該結(jié)果與Αβ42的快速聚集性質(zhì)一起已經(jīng)導致人們提出抑制Αβ42具體可具有臨床效益的假說。已經(jīng)有多項研究顯示可以利用不同的機制來抑制々042聚集體的形成。Tjernberg et al. (Journal of Biological Chemistry, 271:8545-8548 (1996))顯不，包含聚集域的肽可很好地與Αβ肽結(jié)合，并抑制聚集體的形成。還有人顯示其他的幾種結(jié)合聚集域的分子也可抑制淀粉樣蛋白肽聚集(Martharu et al. , Journal of NeurologicalSciences, 280:49-58(2009);Kim et al. , Biochemical and Biophysical Research Communications, 303:576-279 (2003))。對聚集核心域中的氨基酸進行替代或刪除整個聚集域也可防止 Αβ 聚集和原纖維形成(Tjernberg et al. , Journal of Biological Chemistry, 274:12619-12625(1999))。此外，人們已設(shè)計了多種藥物來抑制Y分泌酶活性，以降低Αβ 42和相關(guān)肽種類的量。這些手段在臨床上的效用目前還在研究之中。為了評估分子抑制六@42生成或防止其聚集的有效性，準確地測量Αβ42的量是必要的。有幾種技術(shù)被用來對生物樣品中的々042進行檢測和定量，包括免疫測定(Olsson et al. , Clinical Chemistry, 51:336-345(2005);Verwey etal. , Journal of Immunological Methods, 348:57-66(2009);Sjogren et al. , Journalof Neural Transmission, 107:563-679 (2000))和基于質(zhì)譜(MS)的方法(Cantoneet al., Journal of Neuroscience Methods, 180:255-260(2009);Journal of MassSpectrometry, 40:142-145 (2005))?；谫|(zhì)譜的方法，包括 MALDI-T0F 和 SELDI-T0F 以及液相色譜制備質(zhì)譜(liquid chromatography prepared mass spectrometry)方法，能夠檢測生物樣品中許多淀粉樣蛋白β種類，但目前尚不能提供測量臨床樣品中的Αβ42所需的足夠定量數(shù)值。免疫測定方法是基于一種雙夾心免疫測定法，其包含一種對A β 42Ν末端特異性的抗體，和另一種對AP42C末端高度特異(即不識別其他Αβ肽種類)的抗體。免疫測定有兩種基本形式。第一種形式藉由固定在固體表面的N末端區(qū)域特異性抗體捕捉生物樣品中 的Αβ肽。向該免疫測定中加入攜帶有標簽的八042特異性抗體以完成抗體夾心。第二種形式藉由固定在固體表面的C末端區(qū)域特異性抗體捕捉生物樣品中的Αβ肽。向該免疫測定中加入攜帶有標簽的N末端區(qū)域特異性抗體。在任何一種形式中，通過第二種抗體導入的標簽容許對完整的復(fù)合物加以檢測。通過使用Αβ42參照標準物(添加標準物代替生物樣品)來使得這些測定定量化。用從參照標準物測量得到的信號產(chǎn)生標準曲線，然后用標準曲線來定量所述生物樣品中Αβ42的量。迄今為止，在免疫測定中使用A β 42參照標準物都是依賴合成的全長A β 42肽，通常產(chǎn)生它們的難度很小。但是，這些肽具有很強的疏水性質(zhì)，因此在水性溶液中不可溶。此外，Αβ 42作為參照標準物的貯存和使用都存在不少問題。如已經(jīng)討論的，Αβ 42迅速地形成聚集體，而且這種形成在室溫和中性PH條件下更容易發(fā)生。在低溫(-20’ C)和低pH下長期儲存有助于最大程度地減小儲存中的聚集，但不能防止之。在適于免疫測定的緩沖液中重溶A β 42也可能造成困難。這些溶劑幾乎總是水性的，緩沖于中性pH，含有鹽，并且在室溫下使用。這些條件都是加速A042聚集的。由于不溶性沉淀物，以及在大小和可被檢測抗體和捕捉抗體識別的性質(zhì)上的不均一性，已經(jīng)聚集的々042肽是無法用作免疫測定中的參照標準物的。因此，本發(fā)明通過提供可用于生成^42肽或其蛋白質(zhì)構(gòu)建物和組合物的方法，所述Αβ 42肽或其蛋白質(zhì)構(gòu)建物和組合物可以用作免疫測定或其他模式中的參照標準物或校準物來準確地測定液體或組織提取物樣品中A β 42肽的豐度，從而滿足了本領(lǐng)域的需求。具體地說，本發(fā)明的組合物和方法旨在產(chǎn)生用于Αβ42的非聚集性的肽參照標準物，供免疫測定模式中使用。本文中描述的組合物可方法可以廣泛地應(yīng)用于其他許多難于測定和定量的肽。

發(fā)明內(nèi)容
在一個方面中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含N-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域、C-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域、以及接頭區(qū)域。在另一個方面中，本發(fā)明提供一種組合物，其包含N-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域、C-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域、以及接頭區(qū)域，其中所述組合物在免疫測定中用作參照標準物。在一個實施方案中，所述免疫測定選自下組夾心免疫測定、單一抗體測定、雙夾心免疫測定、和競爭測定。在另一個實施方案中，所述組合物選自下組蛋白質(zhì)、肽、片段和修飾的蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述N-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域結(jié)合A β 42、A β 4(|、A β 38、tau或胰島素生長因子受體I。在另一個實施方案中，所述C-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域結(jié)合八042404(|40383&11或胰島素生長因子受體1。在另一個實施方案中，所述接頭區(qū)域是非免疫反應(yīng)性區(qū)域。在另一個實施方案中，所述接頭區(qū)域包含選自下組的接頭聚乙二醇、谷氨酰胺殘基、丙氨酸殘基、賴氨酸殘基、脂質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)、核酸(包括但不限于DNA、RNA和PNA)、以及烷基鏈。在另一個方面中，本發(fā)明提供具有SEQ ID NO: 1，2，3，4，5，6，7，8，9. 10，11，12，13，14，15，17，19，21，22，23，24，25，26或27的氨基酸序列的分離的肽分子。在另一個方面，本發(fā)明提供一種用于測量生物樣品中被分析物的量的方法，該方法包括將參照標準物附接到至少兩個珠子上，從而形成第一珠子組和第二珠子組，其中所述參照標準物包含被第一檢測抗體識別的表位，且其中每個珠子組包含不同濃度的所述參 照標準物；將對所述被分析物特異的捕捉抗體附接到第三珠子組上；將全部所述珠子組混合到一起形成懸浮陣列(suspension array);將生物樣品施加于該懸浮陣列，以致所述被分析物結(jié)合于所述第三珠子組上的捕捉抗體；添加第一檢測抗體到該懸浮陣列，其中所述第一檢測抗體結(jié)合參照標準物和結(jié)合于該捕捉抗體的被分析物；測量來自所述第一珠子組中結(jié)合于參照標準物的第一檢測抗體的第一信號；測量來自所述第二珠子組中結(jié)合于參照標準物的第一檢測抗體的第二信號，基于所述第一和第二信號產(chǎn)生標準曲線；并通過測量來自所述第一檢測抗體的第三信號且將該第三信號與該標準曲線上所述第一和第二信號的度量值進行比較而確定該第三珠子組中被分析物的量。在一個實施方案中，所述參照標準物包含組合物，所述組合物包含N-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域、C-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域和接頭區(qū)域。在另一個實施方案中，所述參照標準物包含具有SEQ ID NO: I, 2，3，4，5，6，7，8，9. 10，11，12，13，14，15，17，19，21，22，23，24，25，26或27的氨基酸序列的肽或修飾肽。在另一個實施方案中，所述生物樣品選自血液、血清、血漿、外周血單核細胞、外周血淋巴細胞、組織、腦脊液和細胞。在另一個實施方案中，被分析物選自
A β 42. A β 40. A β 38. tau或胰島素生長因子受體IO在另一個實施方案中，所述方法在多孔板、硝酸纖維素濾材、玻璃纖維中，或者在玻片上進行。在另一個實施方案中，所述第一信號和第二信號是選自藻紅蛋白、alexa 532、鏈親和素-藻紅蛋白、和鏈親和素-Alexa 532的信號。在另一個實施方案中，所述參照標準物共價附接于所述珠子。在另一個實施方案中，所述捕捉抗體共價附接于所述珠子。在另一個實施方案中，所述共價附接是碳二亞胺鍵。在另一個方面，本發(fā)明人提供了用于實施免疫測定來檢測A β42肽的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的組合物。表格簡要說明表格I顯示了 Αβ肽的理想的物理性質(zhì)，以及用于測量這些性質(zhì)的測試。表格顯示了 A β 42肽和修飾的肽序列以及說明。
表格3顯示了 tau肽和修飾的肽序列以及說明。表格4在3份人腦脊液(CSF)樣品中測得的Aβ 42肽的濃度。表格5是經(jīng)過表征的新A β肽的列表。表6顯不動態(tài)光散射(DLS)數(shù)據(jù)的匯總。附圖簡要說明圖I顯示雙側(cè)(two-sided)或夾心式可溶性標準物的示意圖。圖2顯示來自示例性A β42夾心免疫測定的校準曲線。 圖3顯示使用修飾的A β 42肽標準物的示例性A β 42夾心測定。圖3Α顯示來自修飾的標準物2 (SEQ ID NO:2)和4(SEQ ID NO:4)的校準曲線。圖3B顯示來自修飾的標準物12 (SEQ ID NO: 12)和13 (SEQ ID NO: 13)的校準曲線。圖3C顯示來自修飾的標準物14 (SEQ ID NO: 14)和6 (SEQ ID NO:6)的校準曲線。圖4顯示Αβ42內(nèi)部測定珠子方法的示意圖。圖5Α顯示共價偶聯(lián)有不同濃度的Αβ 1-40肽(SEQ ID Ν0:15)的6個不同的Luminex珠子組測得的中值熒光強度(MFI)。圖5Β顯示來自A β 4。內(nèi)部測定標準物(圓)或來自作為可溶性標準物的天然A β 42肽的4-PL生成的校準曲線，與圖2中所示的曲線相似。圖5C顯示利用從可溶型Αβ 42肽產(chǎn)生的校準曲線或從內(nèi)部測定Αβ 4(|標準物生成的標準曲線在人CSF樣品中測得的A β 42肽。圖6顯示人外周血單核細胞裂解物中磷酸化的胰島素生長因子受體I (IGF-Rl)的水平。從不同珠子組上的MFI值生成了 4參數(shù)校準曲線(圖6Α)，并用該曲線來確定PBMC裂解物中磷酸化IGF-Rl的相對水平(圖6Β)。圖7顯示DLS數(shù)據(jù)。圖8顯示圓二色分析。圖9顯示肽穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。對于全長Αβ 42和7種修飾肽在不同溫度下進行穩(wěn)定性研究，長達40天(圖9A-9F)。

圖10顯示全長^42與7種修飾肽之間的標準曲線比較。圖11顯示全長肽相對修飾肽的標準曲線分析。圖12顯示使用全長肽相對使用修飾肽的CSF樣品分析。圖13顯示摻入修飾A β (1_42)肽的聚乙二醇間隔物的結(jié)構(gòu)。發(fā)明詳述通過參考下面對本發(fā)明的優(yōu)選實施方式的詳細說明以及包括在本文內(nèi)的實施例，可以更容易地理解本發(fā)明。本發(fā)明涉及新的組合物和方法，可以用來作為參照標準物和校準物，以在免疫測定中測量臨床生物標志物。本發(fā)明還涉及使用所述組合物的方法和包含所述組合物的試劑盒。具體地，本發(fā)明的組合物和方法旨在產(chǎn)生非聚集性的用于Ai342*tau的肽參照標準物，以供免疫測定模式中使用。本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的組合物的試劑盒。定義
如本文使用的，術(shù)語“Α β ”是指淀粉樣蛋白β。如本文使用的，術(shù)語“Αβ42”是指淀粉樣蛋白β1-42。“Αβ42”是指一種42個氨基酸長的肽，其具有如表2，SEQ ID NO: I所示的氨基酸序列。如本文使用的，術(shù)語“Αβ 38”是指淀粉樣蛋白β 1-38?！唉ˇ?38”是指一種38個氨基酸長的肽,其具有序列 DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGG(SEQ ID NO: 17)。如本文使用的，術(shù)語“Αβ4(ι”是指指淀粉樣蛋白β1-40?！唉ˇ?(ι”指一種40個氨基酸長的肽，其具有如表2，SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列。如本文使用的，術(shù)語“tau”是指與表3，SEQ ID NO: 20所示的氨基酸序列對應(yīng)的天然tau蛋白。如本文使用的，術(shù)語“抗體”以其最廣泛的意義使用，具體涵蓋單克隆抗體(包括 全長單克隆抗體)、多克隆抗體、多特異性抗體(即雙特異性抗體)、以及抗體片段(及Fab、F(ab’)2和Fv)，只要它們展現(xiàn)針對選定抗原的結(jié)合活性或親和力。“抗體”還可以指附著于(hang to)或融合于載體蛋白/生物，例如噬菌體或其他展示載體、具有與分離的抗體相同的性質(zhì)的抗體或抗體片段。如本文使用的，術(shù)語“分離的”，在指主題蛋白和蛋白復(fù)合物時，指蛋白或蛋白復(fù)合物的制備物基本不含通常會與該蛋白或復(fù)合物一起存在(例如該蛋白或復(fù)合物內(nèi)源存在的細胞環(huán)境中)的污染蛋白。因此，分離的蛋白復(fù)合物與那些通常會“污染”或干擾對分離條件下該復(fù)合物的研究(例如當篩選其調(diào)節(jié)物時)的細胞組分是分離的。然而需要理解的是，這樣的“分離”的復(fù)合物可以包含這樣的其他蛋白質(zhì)，所述主題蛋白或蛋白復(fù)合物對該蛋白質(zhì)的調(diào)節(jié)作用是考察的對象。如本文使用的，術(shù)語“分離的”在本文中還對核酸如DNA或RNA使用，指以不出現(xiàn)于自然界中的狀態(tài)存在的分子。此外，“分離的核酸分子”意圖包括不會天然作為片段出現(xiàn)，也不會在自然狀態(tài)下被發(fā)現(xiàn)的核酸片段。如本文使用的，術(shù)語“核酸”是指多核苷酸例如脫氧核糖核酸(DNA)，此外在合適時還可指核糖核酸(RNA)。該術(shù)語還可以理解為包括(作為等價物)從核苷酸類似物制成的RNA或DNA的類似物，以及單鏈(如有義或反義)和雙鏈多核苷酸，這一點適用于現(xiàn)在描述的實施方案。“核酸”還可以指肽核酸“PNA”或人工合成的DNA或RNA。如本文使用的，術(shù)語“肽”、“蛋白(質(zhì))”和“多肽”在本文中可以互換使用。術(shù)語“純化的蛋白質(zhì)”指這樣的蛋白質(zhì)制備物，其優(yōu)選地與細胞或細胞裂解物中通常伴隨于該蛋白質(zhì)的其他蛋白質(zhì)分離，抑或?qū)嵸|(zhì)上不包含這樣的其他蛋白質(zhì)。如本文使用的，術(shù)語“修飾肽”指相對于該肽的天然序列已經(jīng)被修飾的肽。例如，修飾可以包括在天然肽序列中去除有害的域或者添加接頭。如本文使用的，術(shù)語“結(jié)合”是指兩個分子之間由于，例如，共價、靜電、疏水、離子、和/或氫鍵相互作用等在生理條件下直接締合。類似的，兩個或更多個多肽之間的“復(fù)合物形成”是指多個多肽之間由于例如共價、靜電、疏水、離子、和/或氫鍵相互作用等在生理條件下直接締合。如本文使用的，術(shù)語“域”是指蛋白質(zhì)中包含特定結(jié)構(gòu)和/或行使特定功能的區(qū)域(即，聚集域，“磷酸化域”)。術(shù)語“聚集域”如本文中所用的，是指位于氨基酸16-20 (KLVFF(SEQ ID NO: 18))的介導Αβ肽以反向平行的方式結(jié)合的五氨基酸區(qū)域。
如本文使用的，術(shù)語“免疫反應(yīng)性域”是指蛋白質(zhì)中包含能被抗體識別的特定氨基酸序列的區(qū)域。該區(qū)域包括含有修飾的氨基酸序列，所述修飾例如糖基化、甲基化、磷酸化、或任何本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的其他翻譯后修飾?？梢员涣姿峄陌被岬膶嵗欣野彼帷⒔z氨酸或蘇氨酸氨基酸。包含磷酸化氨基酸的“免疫反應(yīng)性域”也可以表述為磷酸化域?！懊庖叻磻?yīng)性”域還可以包含蛋白質(zhì)的兩個或更多個如下所述的區(qū)域，這些區(qū)域在蛋白質(zhì)的天然折疊狀態(tài)下相互接近，共同構(gòu)成抗體結(jié)合位點。如本文使用的，術(shù)語“免疫測定”在本文中用來指這樣的生化測試，其利用一種或多種抗體來測量生物學基質(zhì)中被分析物的存在或濃度。這種測定可響應(yīng)于抗體對特定蛋白或肽的免疫反應(yīng)性域的特異性結(jié)合而產(chǎn)生可測量的信號。參照標準物在一個方面，本發(fā)明涉及能夠用作參照標準物和校準物來測量臨床生物標志物的 組合物。在一個實施方案中，所述參照標準物包含肽。所述肽可以是修飾肽。所述修飾肽可以在非免疫反應(yīng)性域中包含接頭、刪除或替代。在另一個實施方案中，所述非免疫反應(yīng)性域是聚集域或磷酸化域。聚集或非免疫反應(yīng)性域中的改變在一個方面，本發(fā)明提供可以用作參照標準物的修飾肽。有已知的域或氨基酸序列可導致粘性(sticky)肽如A β42與自身或其他分子發(fā)生自身聚集和非特異性相互作用。這樣，有可能構(gòu)建缺少這些有害域的標準物或校準物。本發(fā)明提供數(shù)種修飾肽來去除有害域的方式。在一個實施方案中，構(gòu)成有害域的氨基酸從氨基酸序列中被刪除，而N-末端免疫反應(yīng)性域與C-末端免疫反應(yīng)性域連接，缺少中央的17-20氨基酸序列以及不同長度的鄰近C-末端肽(在A β 42的情況下)。中央肽被刪除的A β 42肽的例子在表2，SEQ ID NO: 2、3和4中顯示。在一個實施方案中，中央聚集域加上鄰近的氨基酸被替換為由多種不同物質(zhì)構(gòu)成的接頭或者間隔物。在另一個實施方案中，考慮以不聚集的氨基酸作為接頭。在一個實施方案中，不聚集的氨基酸呈及氨基酸序列的親水性間隔物或接頭的形式，或者是EERP的形式，后者與八運42的(末端37-42序列(SEQ ID NO: 5)及A β 42的C末端32-42部分(SEQ ID NO: 6) 一起顯示。在另一個實施方案中，Aβ42肽包含更長的親水性接頭，例如氨基酸序列DREPNR (SEQID NO: 16)，其帶有 A β42 的 C 末端 37-42 (SEQ ID NO: 7)和 C 末端 32-42 (SEQ ID NO: 8)部分。在還有一個實施方案中，使用一系列帶電殘基，以N-末端和C-末端免疫反應(yīng)性域之間的接頭的形式使用。在另一個實施方案中，創(chuàng)建由整數(shù)m個賴氨酸殘基(SEQ ID NO:9)或整數(shù)η個谷氨酸殘基(SEQ ID NO: 10)構(gòu)成的接頭。在另一個實施方案中，使用一串中性殘基作為接頭。在另一個實施方案中，考慮由整數(shù)P個丙氨酸殘基(SEQ ID NO: 11)構(gòu)成的構(gòu)建體。在本發(fā)明的另一個實施方案中，使用不同形式的聚乙二醇(PEG)作為接頭。在優(yōu)選的實施方案中，將PEG-6原子和PEG-20原子與不同的C-末端部分一起使用(SEQ IDNO: 12-14)。在另一個實施方案中，使用任何具有能夠偶聯(lián)于氨基酸殘基的化學的聚合物作為接頭或間隔物。這種聚合物包括那些直鏈形式的聚合物和那些具有已知的分枝拓撲學的聚合物，如樹突聚物(dendrimers)和分枝共聚物，以刺激A β 42或其他類似的粘性或自聚集性分子等寡聚物的免疫反應(yīng)性。還可以利用tau的磷酸化區(qū)域來產(chǎn)生可用作參照標準物的修飾肽。異常高磷酸化的tau與神經(jīng)纖維纏結(jié)有關(guān)。Tau有多個磷酸化位點；每個位點對其生物學功能有不同的影響。對磷酸化的tau在Ser202/Thrl81/Thr212/Thr231或Ser262處的測量可以幫助了解哪個與MCI受試者中的認知衰退相關(guān)。因此，在另一個實施方案中，考慮用修飾的tau肽作為參照標準物。修飾的tau肽的例子示于表3。在另一個實施方案中，接頭可包含下述分子中的任一種脂質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)、核酸(包括但不限于DNA、RNA和PNA)、烷基鏈、或任何其他增加免疫測定中感興趣的兩個免疫表位的穩(wěn)定性的聯(lián)接。在另一個實施方案中，肽骨架和接頭之間的鍵包括共價鍵、親和素-生物素復(fù)合物或任何其他穩(wěn)定的鍵。在另一個實施方案中，構(gòu)建體不導致自聚集或?qū)嶒炇宜芰现破返姆翘禺愋晕剑鰧嶒炇宜芰现破酚绕涫蔷郾?、聚苯乙烯、聚碳酸?polycarbon)、或其他用于制備實驗室塑料，移液器吸頭、試管、平板、以及其他容納可以在 其中對感興趣的被分析物進行測量的液體的容器的實驗室塑料樹脂。在另一個實施方案中，新Αβ 42或tau免疫測定標準物或校準物需要被N-末端特異性抗體識別的N-末端表位的存在。本領(lǐng)域已知有很多種Αβ 42N-末端結(jié)合抗體。例如，6E010已知識別Aβ 3_8表位,而3D6已知識別Αβ的N-末端表位?？稍O(shè)計重疊表位以容許根據(jù)免疫測定要求和檢測系統(tǒng)選擇數(shù)種要使用的N-末端特異性抗體。在另一個實施方案中，新Αβ42免疫測定標準物或校準物需要需要被C-末端Αβ 42特異性抗體識別的C-末端表位的存在。有充分表征的C-末端Αβ 42新表位抗體包括 G2-11 (來自 Heidelberg 大學)、21F12 (來自 Athena Diagnostics)、4D7A3 (來自Innogenetics)、和12F4(來自Covance,原Signet)?？稍O(shè)計重疊C-末端表位以容許根據(jù)免疫測定要求和檢測系統(tǒng)選擇數(shù)種要使用的C-末端Αβ 42特異性抗體。在另一個實施方案中，在此可使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何N-末端結(jié)合性、C-末端結(jié)合性或磷酸化tau結(jié)合性抗體。本發(fā)明還涉及用于生成肽或蛋白構(gòu)建體及其組合物的方法，所述構(gòu)建體或其組合物可以用作免疫測定中的參照標準物或校準物來準確地測量液體或組織提取物樣品中的肽的豐度。免疫測定往往需要生物學上特異性的捕捉試劑，如抗體，來捕捉感興趣的被分析物或生物標志物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域公知的方法，即通過用生物標志物作為抗原免疫動物，來產(chǎn)生抗體?？梢曰谏飿酥疚锏慕Y(jié)合特征來從樣品分離它們。或者，如果多肽生物標志物的氨基酸序列是已知的，可以合成該多肽并使用它們通過本領(lǐng)域已知的方法來生成抗體。生物標志物的例子包括A β肽和tau。本發(fā)明考慮傳統(tǒng)的免疫測定，包括例如夾心免疫測定，包括ELISA或基于熒光的免疫測定，以及其他酶免疫測定。在基于SELDI的免疫測定中，將針對生物標志物的生物特異性捕捉試劑附接在質(zhì)譜(MS)探針，如預(yù)活化的PRQ j丨」]NC IiiP R陣列的表面上。然后通過該試劑特異性地將該生物標志物捕獲在生物芯片上，并通過質(zhì)譜檢測被捕獲的生物標志物。因此，在一個方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的參照標準物來測量臨床標志物的方法。在一個實施方案中，參照標準物是通過免疫測定測量的。在另一個實施方案中，免疫測定是夾心免疫測定。在另一個實施方案中，免疫測定是單一抗體免疫測定，經(jīng)常以對免疫反應(yīng)性結(jié)合位點的競爭性或“競爭”模式運行。在另一個實施方案中，免疫測定是雙重夾心免疫測定或酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)。在一個優(yōu)選的實施方案中，測量臨床標志物的方法是通過使用免疫測定，所述免疫測定包含下述步驟將參照標準物附接到至少兩個珠子上，從而形成第一珠子組和第二珠子組，其中所述參照標準物包含被第一檢測抗體識別的表位，且其中每個珠子組包含不同濃度的所述參照標準物；將對被分析物特異性的捕捉抗體附接到第三珠子組；將所有珠子組混合到一起而形成懸浮陳列；將生物樣品施加到該懸浮陣列，以使得被分析物結(jié)合到所述第三珠子組上的捕捉抗體；向該懸浮陣列加入第一檢測抗體，其中所述第一檢測抗體結(jié)合參照標準物結(jié)合于和所述捕捉抗體的被分析物；測量來自結(jié)合于所述第一珠子組中的參照標準物的第一檢測抗體的第一信號；測量來自結(jié)合于所述第二珠子組中的參照標準物的第一檢測抗體的第二信號；基于所述第一和第二信號產(chǎn)生標準曲線；并通過測量來自所述第一檢測抗體的第三信號且將該第三信號與該標準曲線上所述第一和第二信號的度量值進行比較而確定該第三珠子組中被分析物的量。不對本發(fā)明構(gòu)成限制，應(yīng)當理解珠子組可以替換為任何其中通過特定檢測技術(shù)或儀器可獨立測量多重信息的其他固相。 在一個實施方案中，所述參照標準物包含本文中描述的組合物。在另一個實施方案中，所述生物樣品選自血液、血清、血漿、外周血單核細胞、外周血淋巴細胞組織、腦脊液和細胞。在另一個實施方案中，所述被分析物是々042、4 04(|、4 038、tau或胰島素生長因子受體I。所述被分析物和/或參照標準物可結(jié)合于多種表面。表面可以是任何可通過共價聯(lián)接、被動吸收、生物素-鏈親和素或任何其他本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的聯(lián)接而固定抗體或參照標準物的固相表面。例如，所述表面可以是珠子、平板、載玻片(slide)、纖維、表面等離子共振傳感器或任何固體表面。在另一個實施方案中，所述方法在多孔板、硝酸纖維素纖維中，或在玻璃載玻片上形成。在另一個實施方案中，所述第一和第二信號是通過熒光檢測的。例如，所述第一信號和第二信號可以是選自下組的信號藻紅蛋白、Alexa 532、鏈親和素-藻紅蛋白和鏈親和素-Alexa 532。在另一個實施方案中，所述信號是通過酶活性(即辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)、化學發(fā)光、放射性、紅外發(fā)射、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、或任何本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法來檢測的。在另一個方面，本發(fā)明包含一種用于實施免疫測定來檢測A β 42或tau肽的試劑盒，所述試劑盒包含本發(fā)明的參照標準物。新的免疫測定標準物或校準物與天然A β 42的性能比較新的免疫測定標準物或校準物在免疫測定中應(yīng)當具有與天然A 042可比較的性能。天然全長Αβ42肽可以利用標準的固相技術(shù)合成，或者可以從多家供貨商作為目錄產(chǎn)品商購(Anaspec Inc. , American Peptide Company,或 Invitrogen Inc. ) 可以使用標準方法，利用本領(lǐng)域公知的質(zhì)量分析技術(shù)，如氨基酸分析(Kanu et al. , Journalof Mass Spectrometry, 43:1-22(2008);Bernstein et al. , Journal of AmericanChemical Society,127:2075-2084(2005) ; Li et al. , Encyclopedia of AnalyticalChemistry, Meyers, R. A. , ed. , John Wiley &Sons Ltd. (2009)),根據(jù)截短的種類驗證全長構(gòu)建物的豐度。
舉例而言，表I列出了 Ae4Ji的理想的物理性質(zhì)，以及多種用于測試這些性質(zhì)的方法。這些方法可以用來確定參照標準物的這些性質(zhì)是否與天然A β 42肽的這些性質(zhì)可比較。表I
權(quán)利要求
1.一種組合物，其包含N-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域、C-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域，和接頭區(qū)域。
2.一種組合物，其包含N-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域、C-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域，和接頭區(qū)域，其中所述組合物用作免疫測定中的參照標準物。
3.權(quán)利要求2的組合物，其中所述免疫測定選自下組夾心免疫測定、単一抗體免疫測定、雙夾心免疫測定、和競爭測定。
4.權(quán)利要求I或2的組合物，其中所述N-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域結(jié)合Aβ 42。
5.權(quán)利要求I或2的組合物，其中所述C-末端免疫反應(yīng)性區(qū)域結(jié)合Aβ 42。
6.權(quán)利要求I或2的組合物，其中所述接頭區(qū)域是非免疫反應(yīng)性域。
7.權(quán)利要求6的組合物，其中所述接頭區(qū)域包含選自下組的接頭聚こニ醇、谷氨酰胺殘基、丙氣酸殘基、賴氣酸殘基、脂質(zhì)、球狀蛋白質(zhì)、核酸、和燒基鏈。
8.一種分離的修飾肽分子，其具有選自下組的氨基酸序列SEQ ID NO: I, 2, 3,4, 5,6,7，8，9. 10，11，12，13，14，15，17，19，21，22，23，24，25，26 和 27。
9.一種測量生物樣品中被分析物的量的方法，所述方法包括 (a)將參照標準物附接于至少兩種珠子，從而形成第一珠子組和第二珠子組，其中所述參照標準物包含被第一檢測抗體識別的表位，且其中每個珠子組包含不同濃度的所述參照標準物； (b)將對所述被分析物特異的捕捉抗體附接到第三珠子組上； (C)將全部所述珠子組混合到一起形成懸浮陣列； (d)將生物樣品施加于該懸浮陣列，藉此所述被分析物結(jié)合于所述第三珠子組上的捕捉抗體； (e)添加第一檢測抗體到該懸浮陣列，其中所述第一檢測抗體結(jié)合所述參照標準物和結(jié)合于所述捕捉抗體的被分析物； (f)測量來自結(jié)合于所述第一珠子組中的參照標準物的第一檢測抗體的第一信號； (g)測量來自結(jié)合于所述第二珠子組中的參照標準物的第一檢測抗體的第二信號； (h)基于所述第一和第二信號產(chǎn)生標準曲線；和 (i)通過測量來自所述第一檢測抗體的第三信號且將該第三信號與該標準曲線上所述第一和第二信號的度量值進行比較來確定該第三珠子組中被分析物的量。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述參照標準物包含權(quán)利要求1、2或8的組合物。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述生物樣品選自下組血液、血清、血漿、外周血單核細胞、外周血淋巴細胞、組織、腦脊液、和細胞。
12.權(quán)利要求9的方法，其中所述被分析物選自下組:Αβ42、Αβ4(ι、Αβ38、 &ιι、和胰島素生長因子受體I。
13.權(quán)利要求9的方法，其中所述方法是在多孔板、硝酸纖維素濾材、玻璃纖維或玻璃載玻片上進行的。
14.權(quán)利要求9的方法，其中所述第一信號和第二信號是選自下組的信號藻紅蛋白、Alexa 532、鏈親和素-藻紅蛋白、和鏈親和素-Alexa 532。
15.ー種用于實施免疫測定以檢測ム042肽的試劑盒，所述試劑盒包含權(quán)利要求1、2或8的組合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于創(chuàng)建定量標準物以校準被分析物的新組合物和方法。這些組合物為創(chuàng)建用于分析被分析物和測量臨床生物標志物的標準物和校準物提供了條件。還提供了包含所述新組合物用于測定，例如夾心免疫測定的試劑盒。
文檔編號G01N33/68GK102859363SQ201180018175
公開日2013年1月2日 申請日期2011年2月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月9日
發(fā)明者P.賴恩, C.馬佩利, O.王, F.伯里沙, R.J.尼利 申請人:百時美施貴寶公司