專利名稱：胃癌的生物標(biāo)志物及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域。更具體地說，本發(fā)明涉及生物標(biāo)志物在胃癌的診斷和治療中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
胃癌是世界范圍內(nèi)造成癌癥相關(guān)死亡的第二大最常見因素，五年存活率低于15%。死亡率高是由于診斷受到耽擱，因?yàn)橐驗(yàn)槲赴?例如發(fā)育異常和早期腺癌)在早期通常是沒有癥狀的。胃癌的早期診斷和手術(shù)介入對(duì)于更好的預(yù)后是關(guān)鍵的，這將五年存活率提高到50%。目前,消化道內(nèi)窺鏡檢查法(strointestinal endoscopy)是診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。然而，這是一個(gè)不舒服的程序，本身存在風(fēng)險(xiǎn)，并且操作不適合于大規(guī)模篩查。然而，目前沒有用于胃癌診斷的具有靈敏性和特異性的非侵入性檢測(cè)。確實(shí)需要鑒定出用于診斷目的的指示早期胃癌的存在的可靠的血清蛋白生物標(biāo)志物(biomarker)。在后基因組時(shí)代，認(rèn)識(shí)到蛋白是身體的役馬(work horse) 0不同代謝途徑都是通過蛋白來表現(xiàn)。因此，可以使用在胃癌早期表達(dá)的獨(dú)特且特異的蛋白作為生物標(biāo)志物。從病理學(xué)上來看，癌癥的進(jìn)展主要表現(xiàn)為癌組織中的失控生長(zhǎng)、心血管的構(gòu)建和對(duì)臨近組織的浸入。這些變化將帶來蛋白表達(dá)的伴隨性變化，包括它們的形成、集中和與其它分子的相互作用。通過利用血液和淋巴灌注到組織和器官，來自癌組織的蛋白和片段浸入循環(huán)。身體對(duì)癌癥的防御性反應(yīng)還生成另外一組蛋白。因此，來自病人的血清/血漿樣品將為胃癌發(fā)生的篩查提供理想的樣品
發(fā)明內(nèi)容
為了滿足上述需求，本發(fā)明鑒定出一組指示早期胃癌的蛋白生物標(biāo)志物。所述蛋白生物標(biāo)志物通過使用比較基因組學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。該過程總結(jié)如下。通過實(shí)驗(yàn)方法誘導(dǎo)大鼠胃癌。采取一系列的血清樣品，并通過高分辨率乳房X線照相術(shù)檢測(cè)胃損傷。目的是將所見到的可能胃損傷與血漿樣品中發(fā)現(xiàn)的差異化表達(dá)的蛋白關(guān)聯(lián)。還使用定制的免疫親和柱進(jìn)行高豐度蛋白的移除。使用比較蛋白組學(xué)分析來尋找患有發(fā)育異常和早期腺癌的大鼠的血清中的特征性變化(characteristic alternation)。利用組織學(xué)檢查確認(rèn)胃部癌發(fā)生的不同時(shí)期。最后，通過Matrix Assisted LaserDesorption/Ionization Time Of Flight Mass Spectrometry (MALDI-T0F MS)來鑒定出一組血清候選生物標(biāo)志物。這些生物標(biāo)志物的一些還未見報(bào)道與胃癌相關(guān)。查出到表達(dá)差異化超過3倍的蛋白，并且通過膠內(nèi)胰蛋白酶消化和隨后的MALDI-TOF MS成功鑒定到11種蛋白(見圖I)。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的六種上調(diào)蛋白是白蛋白、T-激肽原I (KNGI)、a -2-HS糖蛋白(AHSG)、α -I-抗胰蛋白酶(ATT)、阿法敏(Afamin)和Y-肌動(dòng)蛋白。另外五種下調(diào)蛋白是應(yīng)激70蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白AIV、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白和鼠球蛋白。它們的主要功能總結(jié)在圖2中。作為本發(fā)明的一個(gè)目的，提供了使用所鑒定到的一組蛋白生物標(biāo)志物來對(duì)早期胃癌進(jìn)行大規(guī)模篩查的方法。作為本發(fā)明的另一個(gè)目的，可以使用所鑒定到的一些蛋白生物標(biāo)志物作為抗癌藥物的標(biāo)靶用于治療目的。由于這一組生物標(biāo)志物的表達(dá)水平上升指示胃癌的存在，因此它們可能是癌組織的必需組分。這些蛋白的破壞可能導(dǎo)致癌的破壞。另一方面，顯示下調(diào)的癌癥生物標(biāo)志物的增強(qiáng)可以增強(qiáng)可能在癌癥狀態(tài)已經(jīng)受到影響的正常途徑。在本公開內(nèi)容所附的并且構(gòu)成本公開內(nèi)容的一部分的權(quán)利要求書中具體指出了表征本發(fā)明的各種新穎性特征。為了更好地理解本發(fā)明、本發(fā)明的操作優(yōu)點(diǎn)和利用本發(fā)明所達(dá)到的特定目的，可以參考附圖和以下說明，其中例示并描述了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方式。


圖I示出了根據(jù)本發(fā)明的在早期指示胃癌的上調(diào)生物標(biāo)志物和下調(diào)變化。圖2總結(jié)了本發(fā)明的生物標(biāo)志物的主要功能。圖3是示出典型2D-DIGE實(shí)驗(yàn)的工作流程的圖。圖4示出了顯示大鼠H&E系的胃部的顯微照片(250倍)。圖5是顯示Ig Y (MW 180kDa)的純度的非還原性SDS-PAGE。圖6是使用大鼠血清作為樣品的10%SDS_PAGE和Western印跡。圖7顯示40mg粗制大鼠血清(左)和雙耗竭大鼠血清(流通物)(右)的代表性10%2-DE凝膠(銀染)。圖8是在18cm IPG膠條(strip)中解析的40 μ g大鼠血清樣品的蛋白組的代表性 2-DE，其中采用 pH 3-10，10% 的 SDS-PAGE0圖9是在18cm IPG膠條(strip)中解析的40 μ g大鼠血清樣品的蛋白組的代表性2-DE，其中采用pH 4-7，10%的SDS-PAGE作為第二維度。圖10是去除HAP后大鼠血清模式的代表性2-DE，其中采用印染可視化。正常(上圖)和患有腺癌的發(fā)育異常(下圖)血清樣品(40 μ g)。圖11是圖10示出的顯示一致地差異化表達(dá)超過3倍的15種蛋白的2_DE凝膠的放大區(qū)域。圖12顯示在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發(fā)現(xiàn)的差異化蛋白的鑒定。(*第一個(gè)數(shù)指示通過MS分析的值，后一個(gè)數(shù)代表MS/MS分析)(向上箭頭指示在癌癥中被上調(diào)，而向下箭頭指示在癌癥中被下調(diào))(NA :沒有獲得數(shù)據(jù))。圖13提供免疫耗竭后標(biāo)記的總共為150 μ g血清樣品的代表性2D-DIGE凝膠(pH4-7)。(A)Cy 3(D&A血清樣品)和Cy 5 (對(duì)照血清)的重疊圖.⑶分開的CyDye圖Cy2(內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物)、Cy 3和Cy 5。圖14是通過DeCyder分析一致地表達(dá)差異化超過3倍的11個(gè)斑點(diǎn)(spot)的3D圖像。圖15顯示在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發(fā)現(xiàn)的差異化蛋白的鑒定，其中在免疫耗竭后進(jìn)行樣品歸一化。圖16顯示在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發(fā)現(xiàn)的差異化蛋白的鑒定，其中在免疫耗竭前進(jìn)行樣品歸一化。圖17是顯示使用3種不同樣品制備方法鑒定到的差異化蛋白的數(shù)量㈧以及它們的身份(B)的文氏圖。圖18顯示在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發(fā)現(xiàn)的差異化蛋白的身份。
具體實(shí)施方式
材料除非另有說明，否則所有使用的化學(xué)品均來自Sigma(USA)，并且至少是分析級(jí) (AR)。另外，包括乙腈、甲醇和三氟乙酸在內(nèi)的有機(jī)溶劑至少是HPLC級(jí)。塑料器具具有高質(zhì)量，以避免聚合物滲漏。Eppendorf管是最高分析級(jí),來自Eppendorf(USA)。動(dòng)物樽型24只6周齡雄性維斯塔大鼠(Wistar rat)從中國(guó)香港大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(Laboratory Animal Services Centre, LASEC)購(gòu)買。將動(dòng)物于標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下圈養(yǎng)在聚碳酸酯籠中，室溫為23±2° C，相對(duì)濕度為60±5%，12小時(shí)光/暗循環(huán)。讓動(dòng)物自由采食和進(jìn)水。所有程序都是按照香港理工大學(xué)的動(dòng)物受試對(duì)象道德委員會(huì)批準(zhǔn)(AnimalSubjects Ethics Subcommittee)的協(xié)議進(jìn)行。通過 N-甲基-N’ -硝基-N-硝基胍(N-methyl-N' -nitro-N-nitroso Ruandine,MNNG)進(jìn)行的胃癌誘導(dǎo)在2周的實(shí)驗(yàn)室條件適應(yīng)之后，當(dāng)大鼠達(dá)到8周齡時(shí)利用MNNG進(jìn)行胃癌誘導(dǎo)。讓實(shí)驗(yàn)組中的19只大鼠每天飲用新鮮配制的含有O. 01%MNNG的水。在最初的6周每周通過口服強(qiáng)飼法飼喂ImL 10%的NaCl以引發(fā)由MNNG (Chen等，2004)誘導(dǎo)的胃部癌發(fā)生。溶液保存在遮光瓶中以避免MNNG受光降解。5只對(duì)照大鼠飼喂普通自來水。每2周記錄每只大鼠的體重。血液樣品收集在利用MNNG進(jìn)行的胃癌誘導(dǎo)后第8周開始，每?jī)芍軓拿恐淮笫笫占簶悠?。在輕度醚麻醉下利用銳利的玻璃毛細(xì)管從眼部下方的靜脈采取約1.5mL血液。將血液在室溫靜置I小時(shí)使其凝結(jié)。然后在2，OOOg在4° C離心20分鐘。將所得血清等分成小份并在-80° C保存待用。沒有樣品保存超過12個(gè)月。胃部的高分辨X線分析從第19周開始，每月通過高分辨X線檢查實(shí)驗(yàn)大鼠。乳房X線照相機(jī)ΜΑΜΜ0ΜΑΤ3000 (Siemens,德國(guó))由香港理工大學(xué)的射線照相室(Radiographic Clinic)提供。在用氯胺酮(90mg/kg)和子拉辛(zylaxine, 10mg/kg)進(jìn)行麻醉的情況下，口服強(qiáng)飼ImL 10%的泛影葡胺(gastrografin)以包埋胃壁。然后，口服施用約50mL空氣使胃部膨脹以便更好地觀察。讓大鼠取臥姿位置進(jìn)行X線照射(圖2. 3)。X線條件設(shè)定為電壓在23kV至35kV的范圍內(nèi)，毫安秒在2mA至5mA之間。胃部組織的組織學(xué)檢杳在需要胃部組織的情況下，從動(dòng)物上取下胃部，然后將它們于10%緩沖福爾馬林中固定以使組織穩(wěn)定從而防止腐爛。每個(gè)胃部切成4條，包括胃部近端I條，胃部主體2條和胃部遠(yuǎn)端I條(如圖2.4所示)。在53. 7° C將它們?cè)诟栺R林中浸沒6小時(shí)。然后將樣品浸沒在乙醇濃度逐漸升高的多個(gè)浴室中以使組織脫水，然后進(jìn)行二甲苯浴(一種清潔劑)，最后放到熱熔融石蠟中。然后將樣品包埋在模具中以使其冷卻硬化。使用顯微切片機(jī)將組織切成4 μ m。將切片放在載玻片上用蘇木精和曙紅染色。蘇木精將細(xì)胞核染成藍(lán)色，而曙紅將細(xì)胞質(zhì)染成粉紅色。在光學(xué)顯微鏡下分析樣本。檢查發(fā)育異常和/或腺癌的發(fā)生，然后由 Pak-kwan Hui (廣華醫(yī)院病理科(Pathology Department of The Kwong WahHospital)主任(顧問級(jí)病理學(xué)家))確認(rèn)。在母雞中的抗體生成和來自蛋黃的IgY的純化抗體生成將經(jīng)用PBS(0. 5ml終體積)稀釋的來自正常維斯塔大鼠的200 μ g大鼠血清與弗氏完全佐劑(在初始注射中)或弗氏不完全佐劑(在隨后的加強(qiáng)中)中按1:1 (v/V，體積比)混合(Ruan等，2005)。以3周的間隔將I mL的抗原乳液注射到母雞的胸肌中，注射4次，以及按6周的間隔進(jìn)行最后的兩次注射。每天收集雞蛋、標(biāo)記并保存在4° C。
Ig γ純化為了獲得最大量的雞蛋Ig Y (抗目標(biāo)抗原)，進(jìn)行了 3種不同的Ig Y純化方法。EGGstract試劑盒根據(jù)制造商的說明書進(jìn)行EGGstract Ig Y純化(Promega, USA)。簡(jiǎn)而言之,獲取每個(gè)雞蛋的蛋黃并稱重,然后在室溫下向其中緩慢加入3倍體積的溶液A。將混合物混合5分鐘。此后讓蛋黃的液體部分析出，然后將蛋黃混合物于IOOOOg在4° C離心15分鐘。加入1/3體積的溶液B，然后緩慢攪拌5分鐘。再于IOOOOg在4° C將上清液再離心15分鐘。然后，在1/3體積的溶液B中將沉淀重新懸浮，緩慢攪拌5分鐘，在與上述相同的條件下進(jìn)行最后一輪的離心。最后，將沉淀在初始蛋黃體積的PBS中重新懸浮。硫酸銨沉淀用水以1:2的體積比稀釋蛋黃，然后在-20° C冷凍過夜。然后將混合物解凍并在IOOOOg在4° C離心10分鐘。向上清液中添加硫酸銨至終濃度為50%(w/v，重量/體積)。在4° C將溶液混合I小時(shí)，然后在5000g離心20分鐘。離心之后，將沉淀于0. OlMTris-HCl中重新懸浮至上清液一半的體積。然后,通過添加硫酸銨至33%的終濃度來使樣品沉淀。再在4° C再次攪拌溶液I小時(shí)，然后在5000g離心20分鐘。最后，在離心之后，將沉淀重新懸浮在PBS中(Ruan等，2005)。硫Ife納沉淀用水以1:9的稀釋比稀釋蛋黃,然后在4° C溫育6小時(shí)。然后，將混合物在IOOOOg在4° C離心25分鐘。然后，收集上清液并通過添加硫酸鈉(19%，重量/體積)進(jìn)行沉淀。在室溫將上清液攪拌2小時(shí)，在IOOOOg在4° C進(jìn)行另一輪25分鐘的離心之后，收集沉淀并溶解在PBS中(Akita和Nakai，1993)。親和柱根據(jù)制造商的說明書制備溴化氰活化瓊脂糖。簡(jiǎn)而言之，洗滌CNBr活化瓊脂糖并以若干個(gè)等分試樣在ImM冷HCl中溶脹30分鐘。然后，用5_10柱體積的蒸餾水洗滌CNBr活化瓊脂糖，再用偶聯(lián)緩沖液洗滌。然后通過燒結(jié)玻璃過濾器對(duì)懸浮液進(jìn)行快速過濾。然后立即將偶聯(lián)緩沖液中的IgY轉(zhuǎn)移至樹脂。將Ig Y與凝膠混合并在4° C溫育過夜。再通過燒結(jié)玻璃過濾器將懸浮液過濾。使用偶聯(lián)緩沖液從瓊脂糖上洗掉未反應(yīng)的配體。然后，添加封閉劑以在4° C將未反應(yīng)的位點(diǎn)封閉16小時(shí)。最后，先使用偶聯(lián)緩沖液充分洗滌凝膠，再用乙酸鹽緩沖液反復(fù)洗滌5次。然后留取IgY親和凝膠待用。
血 青樣品中高豐度蛋白(HAP)的耗竭(depletion)首先用至少10倍柱體積的平衡緩沖液(IOmM Tris, pH 7. 4)平衡IgY親和柱(IOmL,在4. 91cm 2x 5cm柱中)。將血清樣品裝載到柱子上部。通常收集4mL的組分。將“流通”組分收集作為“HAP耗竭”血清。利用洗脫緩沖液(O. IM甘氨酸，pH 2.5)進(jìn)行酸性洗脫。立即用中和緩沖液(1M Tris, pH 8)中和從柱子上洗脫的蛋白。最后，用20mMpH 7.4的Tris緩沖液充分洗漆以柱子pH得到恢復(fù)。然后使用AmiconUltra 20 (MiIlipore, USA)或Amicon Ultra 4 (Mi I lipore, USA)(截流值為IOkDa)濃縮所收集的“流通/結(jié)合”樣品。蛋白濃度測(cè)定按照制造商的說明書通過布拉德福德分析法(Bradford assay, Bio-Rad, USA)測(cè)定蛋白濃度。在595nm處讀取樣品吸光值。根據(jù)由從O到10mg/mL的一系列濃度的牛血清白蛋白(BSA)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線確定每個(gè)樣品的蛋白濃度。一維凝膠電泳(I-DE) 通過與等體積的還原性樣品緩沖液(O. 5M Tris-HCl pH 6. 8，O. 025%SDS (w/V)，O. 25%甘油(v/v)，痕量的O. 1%溴酚藍(lán)和O. 125% β -巰基乙醇(ν/ν))或非還原樣品緩沖液(與還原樣品緩沖液相似，不同的是沒有添加β_巰基乙醇)混合而制得蛋白樣品，然后在95°C加熱15分鐘。使用帶有5%積層凝膠的10%丙烯酰胺平板凝膠解析樣品混合物。通電，恒定電壓為100V。進(jìn)行電泳直至染料前沿到達(dá)分離凝膠的底部。二維凝膠電泳(2-DE)第一維等電聚焦(IEF):在20°C，在IEF再水化盒中，對(duì)具有線性pH 3至10或4至7的經(jīng)固定的pH梯度(IPG)膠條(18cm，Bio-Rad, Hercules, CA, USA)進(jìn)行被動(dòng)再水化12小時(shí)，蛋白在含有7M脲、2M硫脲、4% (w/v (重量/體積))CHAPS、10% (w/v)異丙醇、5% (v/v)丙三醇、64mM DTT和1%(ν/ν (體積/體積))IPG緩沖液的改性緩沖液中。然后將膠條轉(zhuǎn)移到IEF聚焦盤中，凝膠面向電極。IPG膠條使用礦物油覆蓋IPG膠條以避免脫水。使用PROTEANIEF CELL (Bio-Rad, USA)在 20°C進(jìn)行 IEF。所施加的電壓如下500VX I 小時(shí)，1000VX I 小時(shí)，4000VX2小時(shí)，8000VX4小時(shí)，在8000V 80kVh和最后的步驟且保持在50V?？偣灿屑sIOOkV施加于膠條。IPG膠條的平衡在IEF之后，將膠條浸沒在含有1% (w/v) DTT的平衡緩沖液(50mMTris-HCl pH 8· 8，6M 脲，39%(v/v)丙三醇，2% (w/v) SDS 和 O. 006% (w/v)溴酚藍(lán))在連續(xù)振蕩的同時(shí)進(jìn)行15分鐘的還原。隨后，將膠條放入到另一份含有25%(w/v)碘乙酰胺的平衡液中在連續(xù)振蕩的同時(shí)進(jìn)行15分鐘的烷基化。第二維-SDS-PAGE :使用蒸餾水漂洗經(jīng)過平衡的膠條，然后將其放到10%丙烯酰胺平板凝膠的頂部。在所述膠條的頂部加上0. 5%瓊脂糖溶液以與所述凝膠相連接地密封所述膠條。在前15分鐘以15mA/凝膠進(jìn)行電泳，然后增加到35mA/凝膠，直到染料前沿到達(dá)分尚凝膠的底部。銀染在電泳之后，采用質(zhì)譜相容性銀染程序?qū)δz進(jìn)行染色。簡(jiǎn)而言之，在含有40%(v/v)乙醇和10%(v/v)乙酸的固定液中將凝膠固定I小時(shí)。然后，在30%(v/v)乙醇，0. 2%(w/v)硫代硫酸鈉中將凝膠敏化30分鐘。使用蒸餾水將凝膠洗滌3次，每次5分鐘。然后，使用0. 25%(w/v)硝酸銀洗滌凝膠20分鐘。然后再用蒸餾水洗滌凝膠2次，每次洗滌I分鐘。最后，通過將凝膠于含有2. 5%(w/v)碳酸鈉的0.04%(v/v)甲醛中振蕩而對(duì)凝膠進(jìn)行顯影。當(dāng)?shù)鞍装唿c(diǎn)達(dá)到所需的暗度水平時(shí)，通過加入1.5%(w/v)EDTA終止顯影步驟。圖像分析通過常規(guī)掃描儀(Plustek，USA)掃描經(jīng)染色的凝膠。然后通過2_DE凝膠分析軟件 Melanie version 4. O (Gene-bio, Sweden)分析圖像。二維差異凝膠電泳(Two dimensional Difference Gel Electrophoresis,2D-DIGE)該方法在IEF之前使用花青染料(cyanine, Cy)標(biāo)記蛋白并且在對(duì)每個(gè)樣品使用不同的熒光標(biāo)記的情況下可以在同一 2-D凝膠上在兩個(gè)樣品(對(duì)照樣品和疾病樣品)之間進(jìn)行量化比較。這減少了斑點(diǎn)圖案變化性和在實(shí)驗(yàn)使用的凝膠的數(shù)量，使得斑點(diǎn)配對(duì)(spotmatch)明顯簡(jiǎn)單而準(zhǔn)確。最低限度的標(biāo)記確保每個(gè)蛋白分子只有一個(gè)賴氨酸并且提取物中不超過3%d蛋白分子受到標(biāo)記?；ㄇ嗳玖?CyDye)的單個(gè)正電荷代替了存在于賴氨酸中的單個(gè)正電荷，從而使蛋白的等電點(diǎn)沒有變化，但是使尺寸增加約500Da。針對(duì)Cy2標(biāo)記樣品對(duì)來自兩個(gè)樣品(Cy3和Cy5)的單個(gè)蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化(即 Cy5: Cy2和Cy3: Cy2)。然后使用統(tǒng)計(jì)分析對(duì)來自所有凝膠的對(duì)照樣品和疾病樣品之間的這些對(duì)數(shù)豐度比進(jìn)行比較。圖3示出了典型的2D-DIGE試驗(yàn)的工作流程。樣品標(biāo)記根據(jù)生產(chǎn)廠家說明書進(jìn)行熒光標(biāo)記。簡(jiǎn)而言之，將CyCye于高梯度N，N- 二甲基甲酰胺(DMF)中重構(gòu)成濃度為ImM的儲(chǔ)備液。據(jù)認(rèn)為，該儲(chǔ)備液在_20°C保存數(shù)月是穩(wěn)定的。在本發(fā)明的情況中，該儲(chǔ)備液在兩個(gè)月內(nèi)使用。2D-DIGE原理圖示在以上的圖2. 6中。簡(jiǎn)而言之，使用DMF將CyDye儲(chǔ)備液稀釋至400pmol/ μ I的終濃度，然后立即進(jìn)行標(biāo)記。必須將蛋白樣品的pH的調(diào)節(jié)至8. 5并且濃度為5 μ g/ μ I至10 μ g/ μ I。使用3種Cy染料(Cy2、Cy3和Cy5)之一來標(biāo)記蛋白樣品。使用Cy2標(biāo)記樣品作為DeCyder分析凝膠上的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物。將樣品進(jìn)行渦旋振蕩然后在黑暗中在冰上溫育30分鐘。然后，將IOmM賴氨酸添加到樣品中以終止標(biāo)記反應(yīng)。然后混合樣品并在黑暗中在冰上再溫育10分鐘。將經(jīng)過標(biāo)記的樣品直接進(jìn)行2-DE或在_80°C保存?zhèn)溆?。?dāng)進(jìn)行2-DE時(shí)，匯集被不同CyDye標(biāo)記的樣品然后被動(dòng)再水化為帶有改進(jìn)的再水化緩沖液的膠條。采用與上述的常規(guī)2-DE相同的程序進(jìn)行2D-DIGE。不同的是使用專門的低熒光Pyrex玻璃板來使在掃描過程中的背景熒光最小化并且使信噪比最大化。其他設(shè)備設(shè)置與常規(guī)2-DE的相同。另外，一旦用CyDye標(biāo)記樣品后，隨后的步驟必須在黑暗中進(jìn)行，因?yàn)橐乐笴yDye見光以使光漂白最小化。蛋白檢測(cè)和圖像分析在進(jìn)行二維凝膠電泳后，在凝膠仍然在低熒光玻璃盒中的時(shí)候?qū)ζ溥M(jìn)行掃描。使用雙蒸水(ddH20)清潔玻璃板的外部并用Kimwipe使之干燥,然后將凝膠盒定位在Typhoon9400 可變模式成像儀(Typhoon 9400Variable Mode Imager,GE Healthcare, USA)中。Cy2圖像以488 μ m的激發(fā)波長(zhǎng)和520 μ m帶通(BP) 40發(fā)射濾光器進(jìn)行掃描。Cy3圖像以532 μ m的激發(fā)波長(zhǎng)和580 μ m BP 40發(fā)射濾光器進(jìn)行掃描。Cy5圖像以633 μ m激光器的激發(fā)波長(zhǎng)和670 μ m BP 30發(fā)射濾光器進(jìn)行掃描。通過調(diào)節(jié)功率并使分辨率為1000 μ m (像素尺寸)來掃描凝膠，以充分利用飽和前的圖像動(dòng)態(tài)范圍(image dynamic range)。隨后,將凝膠圖像轉(zhuǎn)換成16比特TIF文件,然后轉(zhuǎn)移至ImageQuant V5. O (GEHealthcare, USA)進(jìn)行凝膠對(duì)齊并切割。然后，使用DeCyder軟件V6. O (GE Healthcare, USA)進(jìn)行斑點(diǎn)檢測(cè)，利用該軟件確定斑點(diǎn)檢測(cè)和排阻的光學(xué)設(shè)定。在絕大多數(shù)的情況下，將斑點(diǎn)檢測(cè)的估計(jì)數(shù)量設(shè)定為2500個(gè)斑點(diǎn)。一般情況下，更高的值常常導(dǎo)致包括非蛋白來源的斑點(diǎn)。在DeCyder差異膠內(nèi)分析(DeCyder Differential In-gel Analysis, DIA)模塊中進(jìn)行蛋白表達(dá)的統(tǒng)計(jì)和量化。只有歸一化后體積變化超過3倍的那些蛋白斑點(diǎn)才被認(rèn)為是差異化表達(dá)。MALDI-TOF MS膠內(nèi)消化膠內(nèi)蛋白胰蛋白酶消化根據(jù)來自制造商Bruker Daltonick(德國(guó))的手冊(cè)“用于質(zhì)譜的蛋白質(zhì)程序(Proteomic protocol for mass spectrometry) ”進(jìn)行。簡(jiǎn)而言之，切下經(jīng)銀染的凝膠上感興趣的蛋白斑點(diǎn)并通過使用純凈水(milli-Q水)洗滌20分鐘進(jìn)行脫色。此后，在脫色液(30mM鐵氰化鉀和64mM硫代硫酸鈉)中溫育15分鐘，然后使用25mM碳酸氫銨反復(fù)洗滌直到膠塊變成無(wú)色。然后添加乙腈以使膠塊脫水。當(dāng)膠塊收縮時(shí)除去剩余的乙腈。隨后，將膠塊在真空下干燥。干燥后，將膠塊在56°C在還原性溶液(含有IOmM的二硫蘇糖醇的25mM碳酸氫銨)中溫育45分鐘。此后，在室溫黑暗中使用烷基化溶液(含有55mM碘乙酰胺的25mM碳酸氫銨)將感興趣的膠塊溫育30分鐘。另外，使 用含有50mM碳酸氫銨的50%(v/v，體積比)的乙腈將膠塊洗滌15分鐘，并添加100%乙腈以使它們?cè)俅问湛s。將在25mM碳酸氫銨中新鮮制備的3 μ I的10 μ g/ml胰蛋白酶(Promega)添加至膠塊并將膠塊-溶液混合物在56°C溫育90分鐘。洗脫膠塞(gel plug)中的胰蛋白酶片段，將50%(v/v)乙腈和1%(ν/ν)三氟乙酸添加至膠塞。利用超聲波促進(jìn)肽片段擴(kuò)散到溶液中。月太質(zhì)量矛旨紋(Peptide mass finRerprint, PMF)分木斤使用配備有反射器的Bruker Autoflex III MALDI-T0F-T0F 質(zhì)譜儀(Bruker Daltonic,德國(guó))分析待鑒定的蛋白的PMF指紋。在MALDI-TOF MS反射器模式中，由脈沖UV(紫外光)激光束產(chǎn)生的離子被加速至23. 5kV的動(dòng)能。在MALDI-T0F-T0F MS模式中，前體離子被加速至8kV并在時(shí)間-離子門(time-ion-gate)中進(jìn)行選擇。片段在LIFT室中被進(jìn)一步加速了 19kV并在離子反射器通過后分析它們的質(zhì)量。根據(jù)來自Bruker Daltonics (德國(guó))的稱為“AnchorChipTMTechnology Revision 2. O”的手冊(cè)制備基質(zhì)和肽樣品。簡(jiǎn)而言之,將
Iμ I基質(zhì)溶液-在乙腈中飽和的氰基-4-羥基肉桂酸0. 1%TFA(1:1)點(diǎn)(spot)在錨芯片標(biāo)靶板上。待基質(zhì)小滴在空氣中干燥后，施加相同體積的樣品溶液，并讓其再次變干。使用
Iμ I的1%TFA將樣品斑點(diǎn)洗滌30秒。使用壓縮空氣輕緩地吹掉小滴。使用I μ I的乙醇丙酮0. 1%TFA(6:3:1)使所得的擴(kuò)散后的樣品斑點(diǎn)重結(jié)晶。最后，將標(biāo)靶板放到AutoflexIII機(jī)中進(jìn)行PMF分析。使用帶有外部校正標(biāo)準(zhǔn)物的質(zhì)量校正試劑盒(Mass CalibrationKit) (Bruker Daltonics,德國(guó))校正光譜。數(shù)據(jù)檢索將所生成的PMF光譜提交至內(nèi)部NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)(in-house NCBIdatabase),然后使用Mascot檢索引擎針對(duì)嚙齒目分類進(jìn)行檢索。通常將檢索條件設(shè)定如下固定脲甲基修飾(fixed carbamidomethylmodification、可變氧化修飾(variable oxidationmodification)、單錯(cuò)切限(one mis-cleavage limitation)和 200ppm 的分子量公差。Western 印跡在SDS-PAGE分離之后，在4°C以IOOV將經(jīng)解析的蛋白樣品向O. 45 μ m硝化纖維素(NC)膜(Amersham Biosciences, US)上轉(zhuǎn)移I小時(shí)。隨后，使用5%(w/v,重量體積比)在Tris緩沖鹽水(TBS)緩沖液中的脫脂奶粉在4°C將經(jīng)印跡的膜封閉過夜。然后使用20mMTris-Tween緩沖鹽水(TBST)以5分鐘循環(huán)將膜洗滌30分鐘以除去任何過量的BSA。將在TBS緩沖液中的抗大鼠全血清Ig Y (1:10000)加到膜上并在室溫溫育I小時(shí)。然后使用20mM TBST以5分鐘循環(huán)將膜洗滌30分鐘。此后，使用在TBS緩沖液中的辣根過氧化物酶(HRG)偶聯(lián)的兔抗Ig Y重鏈和輕鏈抗體的1:10000稀釋液對(duì)膜進(jìn)行探查。將膜-緩沖液裝置(setup)在室溫溫育I小時(shí)。再使用20mM TBST以5分鐘循環(huán)將膜洗滌30分鐘。最后，使用 SuperSignal 化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)試劑盒(SuperSignal chemiluminescent substratedetection kit (Pierce, USA))使印跡顯影。維斯塔大鼠中胃癌模型的建立人類中的胃癌一般是在后期得到診斷，并且在這種情況下，難以在早期收集血清樣品。另外，如在前文部分所詳細(xì)說明的，為生物標(biāo)記物探索而收集的人類組織/體液樣品 中存在大量的變數(shù)。這些變數(shù)非常難以控制和/或優(yōu)化。而且，基因組研究的結(jié)果只是告訴具有致癌基因的那些人發(fā)展癌癥的機(jī)會(huì)，但是沒有指示發(fā)生的時(shí)間。來自良性腫瘤和惡性腫瘤的基因表達(dá)中的很多變化是因?yàn)楹蠓g修飾的緣故，這無(wú)法通過DNA或RNA分析來檢測(cè)。因此，使用大鼠模型進(jìn)行的蛋白質(zhì)組研究提供了有前景的替代方案。已經(jīng)證明，通過施用MNNG在維斯塔大鼠中誘導(dǎo)的胃癌是人類差異化型胃癌的一種良好模型。這是因?yàn)榇笫笪赴┚哂信c人類癌癥非常相似的組織學(xué)特征。另外，在使用各種腫瘤促進(jìn)劑和預(yù)防劑進(jìn)行處理時(shí),具有MNNG誘導(dǎo)癌癥的大鼠顯示出與人類癌癥非常類似的反應(yīng)(Manikandan等，2008)。根據(jù)寡聚核苷酸微陣列分析，在大鼠胃癌中，參與胃部的差異化表型的基因下調(diào)而參與胞外基質(zhì)重塑和免疫反應(yīng)的那些基因上調(diào)。這些表達(dá)型式類似于人類胃癌的表達(dá)型式(Abe等，2003)。因此，使用MNNG中毒維斯塔大鼠來建立胃癌模型以探索血清中的有關(guān)生物標(biāo)記物。所有有關(guān)的程序已經(jīng)在上文中說明。體重的變化每2周記錄實(shí)驗(yàn)大鼠和對(duì)照的體重并且所有體重都顯示體重的凈增加。然而，在檢測(cè)到發(fā)育異常之前，在實(shí)驗(yàn)組大鼠中觀察到體重的明顯損失。這種體重增加模式與以前的研究是吻合的(Nagai等，1984; Schwab等，1997)。組織學(xué)研究還利用胃部的組織切片在微觀上研究發(fā)育異常的存在。發(fā)育異常的主要的組織學(xué)和細(xì)胞學(xué)特征包括細(xì)胞異型性(核多形性、著色過度、核分層、核質(zhì)比增加、胞質(zhì)嗜堿性增加以及核極性損失)；差異化異常(在化生性腸上皮細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞和潘氏細(xì)胞數(shù)目缺少/減少和胃上皮細(xì)胞的分泌產(chǎn)物的消失/減少)和解體的黏膜結(jié)構(gòu)系統(tǒng)(隱窩結(jié)構(gòu)不規(guī)貝1J、背靠背腺體形成(back-to-back gland formation),隱窩的出芽和分支以及管腔內(nèi)和表面乳頭狀生長(zhǎng))。從大鼠獲得胃部之后，根據(jù)上文所述對(duì)它們進(jìn)行處理。在固定和各種染色程序之后，進(jìn)行組織學(xué)研究并且確定癌發(fā)生的時(shí)期?，F(xiàn)在參考圖4。胃部A顯示正常的組織。對(duì)于胃部B，腺體差異化失去。小窩腺體顯示增加的核尺寸、泡狀核和增加的有絲分裂像。出現(xiàn)發(fā)育異常。在胃部C中出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育異常，早期的腺癌顯示浸潤(rùn)固有層和肌層的發(fā)育異常腺體。在胃部D中，存在由與充分差異化的腺癌保持一致的嚴(yán)重發(fā)育異常的粘蛋白分泌腺體組成的腫瘤塊。
根據(jù)胃部癌癥的一般分類(日本胃癌(Japanese Gastric Cancer), 1998),可以將實(shí)驗(yàn)組大鼠的健康狀態(tài)分成四期。第一期是大鼠保持正常。在第二期，發(fā)育異常，小窩腺體具有增加的核尺寸、泡狀核、增加的有絲分裂速度，并且失去腺體差異化。在第三期，除了出現(xiàn)嚴(yán)重的發(fā)育異常之外，早期腺癌還顯示出浸潤(rùn)到固有層和肌層的發(fā)育異常腺體。在第四期，存在腫瘤塊。該腫瘤塊由與充分差異化的腺癌保持一致的嚴(yán)重發(fā)育異常的粘蛋白分泌腺體組成。從大鼠中獲得的組織學(xué)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，發(fā)育異常和腺癌主要出現(xiàn)在胃部的胃竇(antrum)/幽門，并且有時(shí)也發(fā)生在胃部的主體。在人類中，發(fā)育異常經(jīng)常見于胃竇/幽門，并且在一定水平上也見于胃底。但是在大鼠中，發(fā)育異常限于胃竇/幽門，在胃底中沒有見到(Matsukura 等，1978)。
利用MNNG誘導(dǎo)胃癌后大鼠的健康狀態(tài)將實(shí)驗(yàn)組的兩只大鼠從研究中排除，因?yàn)樗鼈冊(cè)谖赴┱T導(dǎo)后很快就死于麻醉并發(fā)癥。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)中，在對(duì)照大鼠中都沒有觀察到發(fā)育異常和腺癌。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組，在飲用水中喂飼O. OP/oMNNG之后，19只維斯塔大鼠的健康狀態(tài)根據(jù)它們切下的胃部的組織學(xué)的結(jié)果被分為4種狀態(tài)7只大鼠保持正常；8只大鼠具有發(fā)育異常；3只大鼠具有發(fā)育異常+早期腺癌；1只大鼠具有腺癌。從攝入MNNG后第17周開始，19只大鼠中的12只大鼠￠3%)經(jīng)組織學(xué)確認(rèn)在胃部中具有發(fā)展的發(fā)育異常，其中，它們中的3只大鼠還發(fā)展到早期腺癌時(shí)期，并且I只大鼠具有帶有腫瘤的腺癌；同時(shí)6只其他大鼠保持正常。當(dāng)與文章所述的情況相比，本發(fā)明的結(jié)果與利用MNNG誘導(dǎo)維斯塔大鼠胃癌的發(fā)病率(55%-73%) (Bralow等，1973;Martin等，1974)和誘導(dǎo)癌癥所需的時(shí)間相似。一些不同可能是由于使用高度近交系大鼠的緣故(Kobori等，1976)。由于本發(fā)明人的設(shè)計(jì)的目的是發(fā)現(xiàn)早期胃癌的候選生物標(biāo)記物，因此來自D&A組的血清樣品被用于后一部分的研究。從結(jié)果可以看出，伴有或者不伴有腺癌的胃部發(fā)育異常得以在12只大鼠中成功建立。然后可以使用來自這些大鼠的血清樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，以發(fā)現(xiàn)候選生物標(biāo)記物。從血■清樣品中的高豐度蛋白(HAP)的去除血清中存在大量的蛋白使得其成為用于揭示疾病生物標(biāo)記物的理想材料。但是，這也是一種巨大的分析挑戰(zhàn)，因?yàn)檠宓鞍踪|(zhì)組含有大量的濃度動(dòng)態(tài)范圍廣的蛋白。由于大多數(shù)先進(jìn)的分析技術(shù)受到樣品量的限制，一些豐度非常低的蛋白的存在使得難以檢測(cè)到低豐度蛋白。因此，在生物標(biāo)記物探索中除去高豐度蛋白(HAP)是必要的。在若干種常用技術(shù)中，使用抗體來除去白蛋白、免疫球蛋白和其他高豐度蛋白似乎是最有效果并且最具有特異性的方法。但是，由于常用哺乳動(dòng)物(例如大鼠、兔和狗)來產(chǎn)生抗體，大量交叉反應(yīng)引起干擾的發(fā)生。幸運(yùn)的是，目前可以使用由鳥類多克隆IgY抗體組成的市售免疫耗竭柱。鳥類多克隆抗體迅速地受到歡迎是因?yàn)樗傻目贵w數(shù)量比哺乳動(dòng)物的高很多倍。這是因?yàn)榭贵w生成動(dòng)物中的免疫反應(yīng)往往隨著與用作抗原來源的動(dòng)物的系統(tǒng)差異的增加而增加。另外，小雞抗體與相應(yīng)的兔抗體相比識(shí)別哺乳動(dòng)物蛋白上的更多表位(Schade等，1996)。這使得在小雞中生成抗高度保守的哺乳動(dòng)物蛋白的抗體比在其他動(dòng)物中更加成功(Tini等，2002)。另外，在卵黃中獲得高的且持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)的IgY滴度所需的抗原數(shù)量比較而言要比在兔子中所需的數(shù)量低得多(Song等，1985 ；Hatta等，1993)。除了在鳥類血清中所見到的之外，鳥類抗體在蛋黃中的豐度高。因此，通過收集鳥蛋可以容易地收集鳥類抗體(Fischer等，1996)。如此可以使得不用對(duì)宿主進(jìn)行抽血。使用完全弗氏佐劑對(duì)小雞進(jìn)行免疫是完全可以接受的并且不引起局部炎性反應(yīng)(Ruan等，2005)。IgY生成和純化簡(jiǎn)單而有效。有各種方法和技術(shù)可以用來滿足不同的要求和需要，例如純度、收率、活性和時(shí)間節(jié)省。而且，卵黃抗體在冷、熱以及酸條件下是長(zhǎng)期穩(wěn)定的(Camenisch等，1999)。IgY 牛成在100多年以前，Klemperer就證明了抗體物質(zhì)可以從經(jīng)免疫的母雞轉(zhuǎn)移至其雞蛋中(Klemperer，1893)。雞蛋蛋黃在多克隆抗體生成中的應(yīng)用得到充分的認(rèn)識(shí)并且卵黃中的IgY濃度高于母雞血清中的濃度(Rose等，1974;Larsson等，1993;Woolley和Landon, 1995)。 在5只經(jīng)免疫的母雞中，在使用免疫原(大鼠血清)進(jìn)行第一次免疫后在第10周左右有兩只母雞沒有下蛋。因此，這些母雞沒有在實(shí)驗(yàn)中使用。其他3只母雞保留39周并且收集到總共308個(gè)免疫雞蛋。IgY 鈍化有若干種用于IgY純化的常用程序。為了選出最適合用于純化IgY的方法，將3個(gè)蛋黃混合，分成3個(gè)相同的組，并且使用三種最常用的方法進(jìn)行純化。對(duì)三種方法的評(píng)價(jià)如下直接硫酸銨沉淀、直接硫酸鈉沉淀和可市售獲得的稱為EGGstract試劑盒的方法。在進(jìn)行所推薦的程序之后，使用非還原性SDS-PAGE來評(píng)價(jià)這三種不同方法的效率。使用非還原性凝膠是因?yàn)镮gY純化的主要污染物約為70kDa和30kDa，這與IgY的重鏈和輕鏈(分別為67kDa和23kDa)非常接近。通過銀染使受解析的蛋白可視化。如圖5所示，在泳道2中的蛋白是污染少得多的蛋白，特別是在30-50kDa范圍內(nèi)。使用抗Ig Y抗體證實(shí)約180kDa的蛋白條帶是Ig Y。因此,使用EGGstract試劑盒的純化效率似乎比其他兩種方法優(yōu)越得多。所收集的Ig Y的特異性利用針對(duì)大鼠血清的Western印跡來研究使用大鼠血清(作為抗原)注射產(chǎn)生的IgY。為了比較，也探查了來自未進(jìn)行抗原注射的母雞的用作對(duì)照的正常IgY。參考圖6，該圖顯示使用大鼠血清作為樣品的10%SDS_PAGE和Western印跡。泳道I是分子量標(biāo)記物。泳道2是使用考馬斯亮藍(lán)染色的5 μ g的大鼠血清。泳道3是使用收集于對(duì)照雞蛋的Ig Y進(jìn)行探查的相應(yīng)Western印跡。泳道4是使用經(jīng)免疫的母雞中產(chǎn)生的IgY進(jìn)行探查的相應(yīng)Western印跡，并且稀釋比為I : 10000。從Western印跡(圖6)可以看出，泳道3 (使用對(duì)照IgY進(jìn)行探查)沒有條帶，而泳道4(使用從經(jīng)免疫的雞蛋分離得到的IgY進(jìn)行探查)具有很多指示為陽(yáng)性的條帶。這些結(jié)果表明在經(jīng)免疫的母雞中產(chǎn)生的Ig Y對(duì)大鼠血清具有特異性。另外，在使用考馬斯亮藍(lán)染色的SDS-PAGE中見到的一些豐富的蛋白也以高豐度存在于Western印跡中。這些結(jié)果說明通過Ig Y檢測(cè)到的蛋白是在正常大鼠血清中的高豐度蛋白。梓子的耗竭效率
將該免疫耗竭柱設(shè)計(jì)為除去血清中的大多數(shù)高豐度蛋白?？梢酝ㄟ^耗竭步驟后留下的蛋白總量來容易地評(píng)價(jià)該柱子的耗竭效率。使粗制血清過柱一次(單耗竭)或兩次(雙耗竭，讓來自第一輪的流通物再過柱一次)。測(cè)量單耗竭和雙耗竭后的蛋白總量。結(jié)果顯示，柱子在雙耗竭后的耗竭效率高達(dá)(初始蛋白濃度的)99%，但是對(duì)于單耗竭而言，耗竭效率為約90%。在所有的高豐度蛋白中，白蛋白是最為豐富的。因此，還研究了白蛋白的除去以提供對(duì)HAP除去步驟的評(píng)估。免疫耗竭之前和之后大鼠血■清的蛋白質(zhì)組圖
根據(jù)上述利用以18cm，pH 4-7膠條進(jìn)行的被動(dòng)再水化的程序進(jìn)行免疫耗竭之前和之后的大鼠血清蛋白質(zhì)組的比較。如圖7所示，雙耗竭之前和之后血清樣品的蛋白質(zhì)組有很大的不同，說明已經(jīng)除去了在2DE凝膠中遮掩低豐度蛋白的大多數(shù)高豐度蛋白。在粗制大鼠血清和雙耗竭大鼠血清的凝膠中分別檢測(cè)到約700個(gè)斑點(diǎn)和1000個(gè)斑點(diǎn)。這使得在比較基因組學(xué)研究過程中“容易”檢測(cè)到低豐度候選癌癥生物標(biāo)記物蛋白。生物標(biāo)記物候選物的鑒定除了使用以不同類型的染料(包括銀和熒光染料)D2_DE的檢測(cè)限和動(dòng)態(tài)范圍問題的挑戰(zhàn)之外，在生物標(biāo)記物探索步驟中，耗竭步驟后樣品的歸一化一直有爭(zhēng)論。通常，研究人員在樣品被耗竭后一直要標(biāo)記蛋白。然而，存在與相同和/或不同樣品的不同耗竭循環(huán)之間的變化有關(guān)的問題。因此，對(duì)由銀染和Cydye熒光標(biāo)簽可視化并在耗竭之前和之后進(jìn)行樣品歸因化的2-DE色譜圖進(jìn)行比較。結(jié)果在下文提供。還將對(duì)在“最佳”樣品準(zhǔn)備步驟中的代表胃部發(fā)育異常的可能的生物標(biāo)記物候選物的差異化表達(dá)蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果也將在下文提供。2-DE凝膠的優(yōu)化為了進(jìn)行比較蛋白組學(xué)，需要對(duì)血清蛋白組中的蛋白進(jìn)行充分的解析。在最初的實(shí)驗(yàn)中，首先在pH 3-10的8cmIPG膠條中解析血清蛋白組中的蛋白(如圖8所示)。發(fā)現(xiàn)大多數(shù)蛋白集中在酸性區(qū)域。因此，使用pH 4-7的8cm IPG膠條再次進(jìn)行2-DE。結(jié)果如圖9所示。凝膠上的蛋白顯示已經(jīng)被充分解析并得到適當(dāng)聚焦。因此，18cm且pH 4-7的IPG膠條適用于隨后的所有實(shí)驗(yàn)。采用銀染的2-DE :在2-DE中常用檢測(cè)限為Ι-lOng左右的銀染可視化方法。在本設(shè)計(jì)中，在第一維度，對(duì)血清樣品進(jìn)行雙耗竭并將40mg蛋白在線性pH 4-7IPG膠條(18cm)上進(jìn)行解析，然后以10%SDS-PAGE作為第二維度。使用銀染方法，通過Melanie軟件檢測(cè)到約100個(gè)斑點(diǎn)。在對(duì)正常對(duì)照和患有腺癌的發(fā)育異常(D&A)的血清蛋白組所進(jìn)行的比較中，所有實(shí)驗(yàn)按6次重復(fù)進(jìn)行。銀染后，標(biāo)注通過Melanie軟件檢測(cè)到的差異化表達(dá)(具有超過3倍差異)的蛋白斑點(diǎn)并計(jì)數(shù)。發(fā)現(xiàn)總共有15個(gè)斑點(diǎn)的表達(dá)差異化至少3倍。參考圖12，在所述15個(gè)斑點(diǎn)中，11個(gè)斑點(diǎn)得到順利鑒定，并且它們屬于6種蛋白物種。4種蛋白的身份還未知道。記錄蛋白斑點(diǎn)的數(shù)目并顯示在圖10中。在圖11中顯示的是2-DE的放大區(qū)，其中顯示15種一致地差異化表達(dá)超過3倍的蛋白。2D-DIGE:銀染的一種主要不利之處是差異化表達(dá)水平的定量分析的不準(zhǔn)確性，這是由于其線性動(dòng)態(tài)范圍窄的緣故。在2001年發(fā)現(xiàn)了為動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍提供新東西(breath)的熒光染料并且上市銷售。使用熒光染料的最常用的方法是DIGE標(biāo)記(Tonge等，2001)。而且，利用DIGE的樣品標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)，可以在標(biāo)記之前和之后對(duì)通過柱耗竭產(chǎn)生的差異化蛋白進(jìn)行比較。另外，進(jìn)行正反標(biāo)記實(shí)驗(yàn)以解釋通過CyDye進(jìn)行的任何偏好蛋白標(biāo)記，從而進(jìn)一步驗(yàn)證DIGE技術(shù)對(duì)樣品的應(yīng)用免疫耗竭后的樣品歸一化(DIGElfHd ):在免疫耗竭之后，使用Cy3標(biāo)記50mg的D&A樣品，使用Cy5標(biāo)記50mg的正常樣品，并使用Cy2標(biāo)記正常樣品和D&A樣品的等量蛋白混合物作為內(nèi)部對(duì)照。結(jié)果，每塊凝膠由兩個(gè)實(shí)驗(yàn)樣品+它們作為內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物的混合物組成。在常規(guī)2-DE程序之后，使用相互排阻激發(fā)和發(fā)射波長(zhǎng)單獨(dú)對(duì)Cy2、Cy3和Cy5通道進(jìn)行成像。使用DeCyder軟件的差異化膠內(nèi)分析(DIA)模塊分析圖像，可以針對(duì)集中的內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物計(jì)算每種蛋白斑點(diǎn)的表達(dá)比。圖13是免疫耗竭后標(biāo)記的總共150μg血清樣品的代表性2D-DIGE凝膠(pH4-7)。(A)Cy 3 (D&A的血清樣品)和Cy 5 (對(duì)照血清)的重疊圖像。(B)分開的CyDye圖 像Cy 2 (內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)物)、Cy 3和Cy5。對(duì)于為比較而在DIGE標(biāo)記之前分別耗竭的正常和 D&A，由軟件檢測(cè)到1597個(gè)斑點(diǎn)。發(fā)現(xiàn)有35個(gè)斑點(diǎn)有至少3倍的差異化表達(dá)，其中，23個(gè)斑點(diǎn)是上調(diào)的，而12個(gè)斑點(diǎn)是下調(diào)的。成功得到鑒定的11種蛋白的由DeCyder軟件分析的強(qiáng)度以3D圖像顯示在圖14中。圖15顯示了在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發(fā)現(xiàn)的差異化蛋白的身份。免疫耗竭前的樣品歸因化(DIGE標(biāo)記)為了使通過“差異相同”的免疫耗竭柱的任何樣品組的偏差機(jī)會(huì)最小化，在裝載柱子之前進(jìn)行樣品的DIGE標(biāo)記。這使得可以讓正常和D&A樣品以相同的初始量裝載并通過免疫耗竭柱一起除去，使用Cy3和Cy5標(biāo)記每個(gè)樣品中的Img蛋白，使用Cy2標(biāo)記正常和D&A的混合物。將總共3mg蛋白裝載到柱子中并一起進(jìn)行免疫耗竭。在利用預(yù)先制作的IgY親和柱對(duì)樣品進(jìn)行免疫耗竭之后，通過DeCyder分析凝膠。結(jié)果顯示有60個(gè)斑點(diǎn)差異化表達(dá)(至少3倍)，其中40個(gè)斑點(diǎn)上調(diào)，20個(gè)斑點(diǎn)下調(diào)。成功鑒定的11種蛋白通過DeCyder軟件分析的強(qiáng)度以3D圖像顯示。圖16顯示了在胃癌的大鼠D&A血清樣品中發(fā)現(xiàn)的相應(yīng)差異化蛋白的身份。下表顯示在兩種2D-DIGE方法中的不同程序的比較
使用銀染可視免疫耗竭后的免疫耗竭前的化的2-DE樣品歸一化樣品歸一化
剛--記)，,(DIGE 標(biāo)記)
斑點(diǎn)總數(shù)__1002__1597__1632
上調(diào)斑點(diǎn)總數(shù)__9__23__40
下調(diào)斑點(diǎn)總數(shù)__6__12__20免疫耗竭前的DIGE標(biāo)記獲得了數(shù)量較多的差異化表達(dá)蛋白。比較通過三種不同樣品制備方法發(fā)現(xiàn)差異化表達(dá)的蛋白列表是值得的。一些蛋白顯示出在三種方法中的所有方法/ 一些方法共同被檢測(cè)到，而其他蛋白只有采用最靈敏的方法才會(huì)被檢測(cè)到。為了比較通過這三種方法發(fā)現(xiàn)的差異化表達(dá)蛋白的一致性，建構(gòu)文氏圖并顯示在圖17中。應(yīng)當(dāng)留意的是，只有身份已知的差異化蛋白才被用來建構(gòu)這種文氏圖。通過這三種不同方法鑒定了總共12種差異化表達(dá)的蛋白。其中在通過利用銀染進(jìn)行的2-DE所檢測(cè)到的6種蛋白中，其中5種蛋白也見于其他兩種2-DE方法；并且免疫耗竭方法之前和之后進(jìn)行樣品歸因化的兩種2D-DIGE都鑒定到6種另外的蛋白。2D-DIGE方法可以檢測(cè)到更多的差異化蛋白，這是不奇怪的，因?yàn)檫@種方法與采用銀染的2-DE相比具有更高的靈敏度和更廣的動(dòng)態(tài)范圍。然而，由DIGE查到的一些蛋白斑點(diǎn)不能通過MALDI-TOF-TOF MS鑒定到，這是因?yàn)榭捎糜贛ALDI-T0F-T0F MS鑒定的蛋白數(shù)量不足的緣故。通過DeCyder檢測(cè)到的蛋白在銀染后在凝膠上沒有觀察到，使得鑒定對(duì)于采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白組設(shè)置的大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室是不實(shí)用的。通過MALDI-T0F-T0F MS進(jìn)行的差異化表達(dá)蛋白的鑒定對(duì)來自以上三組實(shí)驗(yàn)的所有差異化表達(dá)蛋白(至少3倍)都進(jìn)行了 MALDI-T0F-T0F MS分析。所鑒定的蛋白總結(jié)在圖18中。通過建立大鼠胃癌模型，本發(fā)明為本發(fā)明人提供了非常有用的研究模型和用于鑒定胃癌生物標(biāo)記物的方法及其早期診斷和治療的方法，其中一個(gè)大優(yōu)點(diǎn)的是其使 用了更加方便并且介入更少的系列血樣樣品。評(píng)價(jià)受試對(duì)象具有胃癌的可能性的方法包括如下步驟(a)從個(gè)體抽取血液樣品；(b)檢測(cè)選自由白蛋白、T-激肽原I、α-2-HS糖蛋白、α -I-抗胰蛋白酶、阿法敏和Y -肌動(dòng)蛋白組成的組中的一種或更多種蛋白生物標(biāo)志物在來自所述受試對(duì)象的檢測(cè)樣品中的任意過表達(dá)，和(C)檢測(cè)選自由應(yīng)激70蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白AIV、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白和鼠球蛋白組成的組中的一種或更多種生物標(biāo)志物在所述檢測(cè)樣品中的任意低表達(dá)。該步驟使用已知的不是本發(fā)明部分的常規(guī)方法進(jìn)行。盡管在應(yīng)用于本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式時(shí)已經(jīng)說明并指出本發(fā)明的新的基本特征，但是應(yīng)當(dāng)理解的是，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在未偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)的情況下可以對(duì)所述實(shí)施方式的形式和細(xì)節(jié)進(jìn)行各種省略、替代和改變。本發(fā)明不限于上述實(shí)施方式，這些實(shí)施方式僅作為例子提供，它們可以在所附專利權(quán)利要求所限定的保護(hù)范圍內(nèi)以各種方式進(jìn)行改變。
權(quán)利要求
1.一種估測(cè)受試對(duì)象患有胃癌的可能性的方法，所述方法包括如下步驟 (a)檢測(cè)選自由白蛋白、T-激肽原I、α-2-HS糖蛋白、α _1_抗胰蛋白酶、阿法敏和Y-肌動(dòng)蛋白組成的組中的至少一種蛋白生物標(biāo)志物在來自所述受試對(duì)象的檢測(cè)樣品中的過表達(dá)，和(b)檢測(cè)選自由應(yīng)激70蛋白、載脂蛋白Al、載脂蛋白AIV、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白和鼠球蛋白組成的組中的至少一種生物標(biāo)志物在所述檢測(cè)樣品中的低表達(dá)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，步驟(a)包括檢測(cè)至少兩種蛋白生物標(biāo)志物的過表達(dá)，并且步驟(b)包括檢測(cè)至少兩種蛋白生物標(biāo)志物的低表達(dá)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，步驟(a)包括檢測(cè)至少三種蛋白生物標(biāo)志物的過表達(dá)，并且步驟(b)包括檢測(cè)至少三種蛋白生物標(biāo)志物的低表達(dá)。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，步驟(a)包括檢測(cè)至少四種蛋白生物標(biāo)志物的過表達(dá)，并且步驟(b)包括檢測(cè)至少四種蛋白生物標(biāo)志物的低表達(dá)。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，步驟(a)包括檢測(cè)至少五種蛋白生物標(biāo)志物的過表達(dá)，并且步驟(b)包括檢測(cè)至少五種蛋白生物標(biāo)志物的低表達(dá)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，步驟(a)包括檢測(cè)至少六種蛋白生物標(biāo)志物的過表達(dá)。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中，所述檢測(cè)樣品為血液樣品。
全文摘要
本發(fā)明提供了一組指示早期胃癌的生物標(biāo)志物和通過檢測(cè)這些生物標(biāo)志物在血液樣品中的水平而在早期診斷胃癌的方法。檢測(cè)到由白蛋白、T-激肽原I、α-2-HS糖蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、阿法敏和γ-肌動(dòng)蛋白組成的組中的一種或更多種蛋白生物標(biāo)志物的過表達(dá)和/或檢測(cè)到由應(yīng)激70蛋白、載脂蛋白A-I、載脂蛋白A-IV、轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白和鼠球蛋白組成的組中的一種或更多種蛋白生物標(biāo)志物的低表達(dá)是胃癌存在的指示。
文檔編號(hào)G01N33/50GK102844661SQ201180018413
公開日2012年12月26日 申請(qǐng)日期2011年2月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月11日
發(fā)明者盧俊立, 林穎淇 申請(qǐng)人:香港理工大學(xué)