專利名稱：使用微珠或其他捕獲物對分子或顆粒的超靈敏檢測的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
描述了用于檢測流體樣品中分析物分子或顆粒，并在一些情況下用于確定所述流體樣品中分子或顆粒的濃度的量度的系統(tǒng)和方法。相關(guān)申請本發(fā)明是Duffy等人于2010年3月24日提交的美國專利申請序列號12/731，130，名稱為“使用微珠或其他捕獲物對分子或顆粒的超靈敏檢測”的部分繼續(xù)申請案，其要求了 Duffy等人于2010年3月I日提交的美國臨時專利申請序列號61/309，141，名稱為“使用微珠或其他捕獲物對分子或顆粒的超靈敏檢測”的權(quán)益。上文提到的各申請都通過引用并入本文。
背景技術(shù)：
能夠快速精確地檢測并在特定情況下定量樣品中的靶標(biāo)分析物的方法和系統(tǒng)是現(xiàn)代分析測量法的基石。在許多領(lǐng)域中采用了這些系統(tǒng)和/或方法，如學(xué)術(shù)和工業(yè)研究、環(huán)境評估、食品安全、醫(yī)學(xué)診斷及對化學(xué)、生物及/或放射性戰(zhàn)劑的分析。這些技術(shù)的優(yōu)勢特征可包括特異性、快速性及靈敏性。目前大多數(shù)用于定量樣品中低水平的分析物分子的技術(shù)使用了擴增步驟以增加報告子分子的數(shù)量以能夠提供可量度的信號。例如，這些已知的方法包括在基于抗體的測定中用于增強信號的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)，以及在基于DNA的測定中用于擴增靶標(biāo)DNA鏈的多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)。一種更靈敏但間接的蛋白質(zhì)靶向擴增技術(shù)(稱為免疫PCR)(見 Sano, T. ; Smith, C. L. ; Cantor, C. R. Sciencel992, 258，120-122)利用了寡核苷酸標(biāo)記物，可在隨后對其進行PCR擴增并使用DNA雜交測定進行檢測(見Nam, J. M. ; Thaxton, C.S. ;MirkinjC. A. Science 2003;301，1884-1886;NiemeyerjC. Μ. ;Adlerj Μ. ;Pignatarο, B. ; Lenhertj S. ; Gaoj S. ; Chij L. F. ; Fuchs, H. ; Blohmj D. Nucleic Acids Research1999，27，4553-4561; and Zhou, H. ; Fisher, R. J. ; Papas, T. S. Nucleic Acids Research1993，21，6038-6039)。免疫-PCR法雖然使得能夠進行超低量蛋白質(zhì)的檢測，但其是復(fù)雜的測定方法，且容易產(chǎn)生假陽性信號(見Niemeyer, C. M. ; Adler, M. ;ffacker, R. Trends inBiotechnology 2005,23, 208-216)。用于檢測或定量溶液中低濃度的特定分析物的已知典型方法和/或系統(tǒng)的一個特征在于其是基于集合的響應(yīng)，其中許多分析物分子產(chǎn)生測量的信號。許多檢測步驟要求集合中存在大量分子以產(chǎn)生檢測閾值以上的累積信號。這項要求限制了大多數(shù)檢測技術(shù)的靈敏度以及動態(tài)范圍(即，能檢測到的濃度范圍)。許多的已知方法和技術(shù)有非特異性結(jié)合的問題，即要檢測的分析物分子或顆?；蛘邎蟾孀宇惙翘禺愋缘亟Y(jié)合于預(yù)期位點之外的位點。這導(dǎo)致背景信號的增加，因此限制了可精確地或可再現(xiàn)地檢測到的最低濃度。因此，有對改進方法的需要，尤其是在這些分子或顆粒以非常低的濃度存在的情況下，用于檢測及可選地定量流體樣品中分析物分子或顆粒。發(fā)明概述本文描述了用于檢測流體樣品中分析物分子或顆粒，并在一些情況下用于確定所述流體樣品中分子或顆粒的濃度的量度的系統(tǒng)和方法，本發(fā)明的主題在一些情況下涉及相關(guān)產(chǎn)品、對特定問題的備選解決方案和/或一種或多種系統(tǒng)和/或物品的多重或不同的用途。在一些實施方式中，用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法包括使大量各自包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物與含有或疑似含有所述至少一種類型的分析物分子或顆粒的溶液相接觸，使分析物分子或顆粒固定化于所述的大量捕獲物，使得至少一些捕獲物與單個分析物分子或顆粒相結(jié)合，而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物不與任何分析物分子或顆粒相結(jié)合，將至少一部分經(jīng)過了固定化步驟的捕獲物在空間上劃分入大量分隔的位置，指認至少一部分經(jīng)過了空間劃分步驟的所述大量位置并確定含有單個分析物分子或顆粒的所述位置的數(shù)量，以及至少部分地基于確定含有分析物分子或顆粒的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。在一些實施方式中，用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法 包括將大量各自包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物與與含有或疑似含有所述至少一種類型的分析物分子或顆粒的溶液相接觸以形成包含至少一個固定化分析物分子或顆粒的捕獲物，將接觸步驟中制備的捕獲物與大量結(jié)合配體相混合以使至少一些捕獲物中與單一結(jié)合配體相結(jié)合，而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物不與任何結(jié)合配體相結(jié)合，將至少一部分經(jīng)過了混合步驟的捕獲物在空間上劃分入大量分隔的位置，指認至少一部分經(jīng)過了空間劃分步驟的所述大量位置并確定含有結(jié)合配體的所述位置的數(shù)量，以及至少部分地基于確定含有結(jié)合配體的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。在一些實施方式中，用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法包括提供包含大量位置(其中至少一部分位置含有微珠)的基底，其中存在于基底上的微珠總數(shù)中，包含至少一個分析物分子或顆粒的微珠相對不包含分析物分子或顆粒的微珠的比例為大約8:1-大約1:10, 000, 000,指認至少一部分所述大量位置，其中在指認步驟中的所述大量位置中對至少兩個是至少部分同時指認的；在各個指認的位置中檢測微珠是否存在，如果存在，檢測所述微珠是否包含任何分析物分子或顆粒；以及至少部分地通過確定含有包含至少一個分析物分子或顆粒的微珠的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。在一些實施方式中，用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法包括提供包含大量位置(其中至少一部分位置含有微珠)的基底，其中存在于基底上的微珠總數(shù)中，包含至少一個結(jié)合于結(jié)合配體的分析物分子或顆粒的微珠相對不包含結(jié)合于結(jié)合配體的分析物分子或顆粒的微珠的比例為大約8:1-大約1:10，000，000，指認至少一部分的所述大量位置，其中在指認步驟中的所述大量位置中對至少兩個是至少部分同時地指認的；在各個指認的位置檢測微珠是否存在，如果存在，檢測所述微珠是否包含任何結(jié)合于結(jié)合配體的分析物分子或顆粒；以及至少部分地通過確定含有包含至少一個結(jié)合于結(jié)合配體的分析物分子或顆粒的微珠的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。在一些實施方式中，物品或試劑盒包含平均直徑為大約O. I微米-大約100微米的大量微珠，和含有大量反應(yīng)容器的基底，其中反應(yīng)容器的平均深度為微珠平均直徑的大約I. O倍-大約I. 5倍，反應(yīng)容器的平均直徑為微珠平均直徑的大約I. O倍-大約I. 9倍。在一些實施方式中，用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法包括將大量各自包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲分子與含有或疑似含有所述至少一種類型的分析物分子或顆粒的溶液相接觸，其中至少一些捕獲物變成結(jié)合于至少一個分析物分子或顆粒；將接觸步驟中制備的大量捕獲物與包含酶組分的大量結(jié)合配體相混合，使得統(tǒng)計學(xué)顯著比例的結(jié)合至少一個分析物分子或顆粒的捕獲物結(jié)合至單個結(jié)合配體；將至少一部分經(jīng)過混合步驟的捕獲物在空間上劃分入大量分隔的位置；至少部分地通過指認至少一部分的經(jīng)過空間劃分步驟的大量位置以確定酶組分或涉及酶組分的反應(yīng)產(chǎn)物的存在情況而確定流體樣品中分析物分子或顆粒濃度的量度。在一些實施方式中，用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法包括將大量分析物分子或顆粒固定化于大量微珠；將至少一部分的所述大量微珠在空間上劃分入大量分隔的位置，并指認所述大量位置中的至少一些并確定含有微珠的位置數(shù)量；·再進一步確定含有微珠及分析物分子或顆粒的所述位置數(shù)量，并至少部分地基于含有微珠以及分析物分子和顆粒的位置數(shù)量相對含有微珠的位置數(shù)量的比率而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。在一些實施方式中，用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法包括將大量分析物分子或顆粒固定化于大量微珠；將至少一部分所述大量微珠在空間上劃分入大量分隔的位置，以及指認所述大量位置中至少一些并確定含有微珠的位置數(shù)量；再進一步確定含有微珠及分析物分子或顆粒的所述位置數(shù)量，并至少部分地基于含有微珠以及分析物分子和顆粒的位置數(shù)量相對含有微珠但不含任何分析物分子或顆粒的位置數(shù)量的比率而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。在一些實施方式中，用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法包括提供大量各自結(jié)合于單個分析物分子或顆?；蛘卟唤Y(jié)合任何分析物分子或顆粒的捕獲物，單個地指認至少一部分捕獲物并確定結(jié)合分析物分子或顆粒的所述捕獲物數(shù)量，并至少部分地基于經(jīng)過指認步驟確定結(jié)合了分析物分子或顆粒的捕獲物的數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。附圖簡述在下文的詳述中結(jié)合附圖考慮時，本發(fā)明的其他方面、實施方式和特征會將會清楚。附圖為示意性的，并非按比例繪制。為清楚起見，不是每種組分在每張圖中都有標(biāo)記，在本領(lǐng)域技術(shù)人員不需要說明就能理解本發(fā)明的地方?jīng)]有必要顯示本發(fā)明的每個實施方式的每種組分。文中所提到的所有專利申請和專利都以其全文通過引用并入本文。在本說明書中包含的說明與通過引用并入的文獻之間有沖突的情況下，以本發(fā)明(包括定義)為主。圖I為示意性流程圖，描述了施行本發(fā)明示例性方法的步驟(A-D)的一個實施方式；圖2為示意性流程圖，描述了施行本發(fā)明示例性方法的步驟(A-D)的一個實施方式；圖3為示意性流程圖，描述了本發(fā)明方法的一部分的一個實施方式；圖4A為示意性流程圖，描述了施行本發(fā)明示例性方法的步驟(A-D)的一個實施方式；圖4B為示意性流程圖，描述了施行本發(fā)明示例性方法的步驟(A-D)的一個實施方式；圖4C為示意性流程圖，描述了施行本發(fā)明示例性方法的一個實施方式；圖5為示意性流程圖，描述了施行本發(fā)明示例性方法的步驟(A-C)的一個實施方式；圖6為示意性流程圖，描述了通過將基底和密封組分匹配而形成大量反應(yīng)容器的方法(步驟A-D)的實施方式，并描述了與在基底上的密封組分的尺寸大小(E、F)的實例；圖7描述了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，用于光檢測的實驗設(shè)置；圖8顯示了根據(jù)一個實施方式由密封組分密封的光纖陣列；圖9A顯示了示意流程圖，描述了根據(jù)一些實施方式，間接檢測結(jié)合于捕獲物的分析物分子的方法；圖9B顯示了示意流程圖，描述了根據(jù)一些方式，使用結(jié)合配體間接檢測固定化于捕獲物的分析物分子的方法；圖IOA和IOB顯示了示意流程圖，描述了用于根據(jù)本發(fā)明的一些方法將結(jié)合配體交聯(lián)于分析物分子的步驟的一些實施方式；圖IlA和IlB顯示了采用根據(jù)一些實施方式的本發(fā)明的光學(xué)檢測系統(tǒng)的一些系統(tǒng)的非限制性實例；

圖12為示意性方框圖，顯示了根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，采用了裝配有光學(xué)檢測系統(tǒng)和光纖裝置的系統(tǒng)；圖13顯示了示意性校準(zhǔn)曲線的圖，所述曲線可用于根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度；圖14顯示了根據(jù)一個示例性實施方式，對確定結(jié)合包含A)PSA，B) TNF-α、或C)DNA的分析物分子的捕獲物比例對比流體樣品中分析物分子濃度的作圖；圖15顯示了根據(jù)一個示例性實施方式，確定結(jié)合有分析物分子的捕獲物部分的對數(shù)對比流體樣品中分析物分子濃度的對數(shù)的作圖；圖16顯示了根據(jù)一個非限制性實施方式，包含微珠的反應(yīng)容器數(shù)對比反應(yīng)容器中提供的微珠總數(shù)的圖；圖17A-17C顯示了包含大量反應(yīng)容器的陣列中含有的微珠的非限制性圖像；圖18A顯示了含有微珠的陣列的非限制性熒光圖像，圖18B顯示了圖18A的放大圖像；圖19A和19B顯示了根據(jù)特定實施方式，確定含有分析物分子的反應(yīng)容器數(shù)對比流體樣品中分析物分子濃度的圖；圖19C顯示了根據(jù)一個示例性實施方式，總的熒光讀數(shù)對比流體樣品中分析物分子濃度的圖；圖20顯示了三次測量中圖19B的實驗數(shù)據(jù)的泊松噪音％對實驗偏差的作圖。圖21顯示了根據(jù)一個示例性實施方式，在兩種分析物分子濃度下，確定結(jié)合有分析物分子的捕獲物比例對比所提供的結(jié)合配體濃度的作圖；圖22顯示了根據(jù)一個示例性實施方式，在兩種分析物分子濃度下，確定結(jié)合有分析物分子的捕獲物比例對比為每個捕獲物所提供的結(jié)合配體濃度的作圖；圖23顯示了根據(jù)一個示例性實施方式，在兩種分析物分子濃度下，確定結(jié)合有分析物分子的捕獲物比例對比所提供的結(jié)合配體濃度的作圖；圖24顯示了根據(jù)一個示例性實施方式，總化學(xué)發(fā)光對比所提供的結(jié)合配體濃度的作圖；圖25A和25B顯示了示 意流程圖，描述了用于進行本發(fā)明的一個方法的步驟的一個實施方式；圖25C顯示了根據(jù)一個示例性實施方式，包含在大量反應(yīng)容器內(nèi)的微珠的圖像；圖2 顯了根據(jù)一個例性實施方式，包含大量微珠(其中有一些在施行本發(fā)明的方法之后結(jié)合于分析物分子)的陣列的熒光圖像；圖26顯示了根據(jù)一個示例性實施方式，光學(xué)密度對比TNF-α濃度的作圖；圖27顯示了對大量人類受試者確定的PSA濃度的作圖；圖28顯示了根據(jù)本發(fā)明一個實施方式，一個測定法中反應(yīng)容器的平均熒光強度的直方圖；圖29Α顯示了在第一個波長獲取的含有微珠的反應(yīng)容器陣列的一部分的熒光圖像；圖29Β是在第一個波長獲取的含有微珠的反應(yīng)容器陣列的一部分的熒光圖像，其中微珠與突光實體相結(jié)合；圖29C是在第二個波長獲取的來自圖29Β的陣列的一部分的熒光圖像；圖29D顯示了在不同分析物分子濃度下對(i)微珠以及(ii)與熒光實體相結(jié)合的微珠的作圖；圖30A和30B顯示了根據(jù)一些實施方式的免疫復(fù)合物隨時間的解離情況的作圖；圖31顯示了根據(jù)一些實施方式，每個微珠的平均分析物分子數(shù)量對比分析物分子濃度的作圖。發(fā)明詳述本文描述的是可在特定實施方式中用于檢測和/或定量樣品中的分析物分子、顆粒(如細胞、細胞器和其他生物學(xué)或非生物學(xué)微粒)等等的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明的主題內(nèi)容在一些情況下涉及相關(guān)產(chǎn)品、對特定問題的備選解決方案以及/或一種或多種系統(tǒng)和/或物品的大量不同用途。要理解的是，盡管下文的討論中大部分針對的是分析物分子，但是這僅僅是通過實例的方式，也可檢測和/或定量其他材料例如微粒形式的分析物。一些示例性分析物分子和顆粒在本文有所描述。與用于進行類似測定的一般的常規(guī)系統(tǒng)和方法相比，在特定情況下，本發(fā)明的系統(tǒng)和方法可幫助減少非特異性結(jié)合對檢測靈敏度的負面效應(yīng)。非特異性結(jié)合是在測定法中一種組分與測定中另一種不希望與其相互作用的組分以非特異性的形式的結(jié)合或連接。例如，與其具有結(jié)合特異性的分析物分子或顆粒相反，結(jié)合配體與基底或測定材料產(chǎn)生了連接、結(jié)合或固定化。非特異性結(jié)合可導(dǎo)致假陽性信號。非特異性結(jié)合可以不僅影響測定量度的精確性，還限制了檢測的最低水平。因此，本發(fā)明的特定方法和/或系統(tǒng)提供了非特異性結(jié)合水平上的改善，這可使得其與一般的常規(guī)技術(shù)相比能夠檢測/或定量樣品中的分析物分子時有更低的最低檢測限水平。此外，本發(fā)明的特定方法和/或系統(tǒng)還可使得能夠在先前由于這些分析物分子存在濃度很低而未檢測到或無法定量的特定樣品中檢測和/或定量分析物分子。本發(fā)明的特定方法可用于鑒定樣品中的分析物分子。在一些情況下，這些方法可用于檢測和/或定量疑似含有至少一種類型的分析物分子的流體樣品中分析物分子，因為如下文詳細說明的，本發(fā)明的測定法是這樣設(shè)計的，使得所拾取(interrogate)的包含含有分析物分子的捕獲物(例如，提供了捕獲表面的微珠、表面，等等)的位置(例如，孔、反應(yīng)點、表面上的區(qū)域等等)的數(shù)量(或等同地，比例)，或更一般地為包含分析物分子的總拾取群體的拾取捕獲物的數(shù)量或比例與流體樣品中分析物分子的濃度相關(guān)。因此本發(fā)明的特定實施方式提供了至少部分基于例如基底上的包含結(jié)合分析物分子的捕獲物的位置的數(shù)量或比例的流體樣品中分析物分子濃度的量度。在一些情況中，所述數(shù)量/比例可與包含捕獲物(例如，具有或不具有相結(jié)合的分析物分子或標(biāo)記試劑)的位置總數(shù)和/或與所拾取的位置總數(shù)相關(guān)。如何使用本發(fā)明的實施方式定量流體樣品中分析物分子的具體方法和計算在下文有更多的討論。在特定實施方式中，用于檢測和/或定量樣品中分析物分子(或顆粒)的方法包括使大量分析物分子固定化于各自包括對至少一種類型的分析物分子(或顆粒)有親和力的結(jié)合表面的大量捕獲物。例如，捕獲物可包括大量的微珠，其包含大量的捕獲組分(例如，對目的分析物分子有特異性親和力的抗體，等等)。至少一些捕獲物(例如，與至少一個分析物分子結(jié)合的至少一些捕獲物)可在空間上劃分/分離入大量位置，這些位置中至少有一些可以被指認/拾取。對流體樣品中分析物分子的濃度的量度可基于指認這些位置時獲得的信息而確定。在一些情況下，對濃度的量度至少部分地基于確定含有捕獲物或與至少一個分析物分子相結(jié)合的位置的數(shù)量。在其他情況下及/或在不同的條件下，對濃度的量度可至少部分地基于一個或多個所指認的位置處的至少一種表示大量分析物分子和/或與分析物分子相結(jié)合的捕獲物存在的信號的強度水平。在一些實施方式中，也可確定含有捕獲物但不含有分析物分子的位置的數(shù)量/比例，且/或也可確定不含有任何捕獲物的位置的數(shù)量/比例。在這些實施方式中，流體樣品中分析物分子濃度的量度可至少部分地基于確定含有與分析物分子結(jié)合的捕獲物的位置數(shù)量相對確定含有不與分析物分子結(jié)合的捕獲物的位置總數(shù)的比率，且/或流體樣品中分 析物分子濃度的量度可至少部分地基于確定含有與分析物分子結(jié)合的捕獲物的位置數(shù)量相對確定不含有任何捕獲物的位置數(shù)量的比率。在其他實施方式中，流體樣品中分析物分子濃度的量度可至少部分地基于確定含有捕獲物及分析物分子的位置數(shù)量相對所指認和/或分析的位置總數(shù)的比率。在一些實施方式中，可將至少一些捕獲物(例如，至少一些與至少一個分析物分子結(jié)合的捕獲物)在空間上劃分/分離入大量位置，例如，陣列形式中的大量反應(yīng)容器。所述大量反應(yīng)容器可形成于任何合適材料之中、之上和/或以其制造形成，在一些情況下，反應(yīng)容器可被密封或在基底與密封組分匹配時形成，在下文有詳細討論。在特定實施方式中，尤其是在需要對結(jié)合至少一個分析物分子的捕獲物進行定量時，對捕獲物的分區(qū)可以這樣進行，使得至少一些(例如，統(tǒng)計學(xué)顯著比例)的反應(yīng)容器包含至少一個或在特定情況下只有一個與至少一個分析物分子相結(jié)合的捕獲物，且至少一些(例如，統(tǒng)計學(xué)顯著比例)的反應(yīng)容器包含不與任何分析物分子相結(jié)合的捕獲物?？稍谔囟▽嵤┓绞街袑εc至少一種分析物分子相結(jié)合的捕獲物進行定量，這樣使得能夠通過本文詳述的技術(shù)對流體樣品中的分析物分子進行檢測和/或定量。圖I中示例說明了本發(fā)明的測定法的一個示例性實施方式。提供了大量的捕獲物2(步驟(八))。在此具體實施方式
中，所述大量捕獲物包含大量的微珠。這些微珠與含有大量分析物分子3的流體樣品相接觸(例如,微珠2與分析物分子3 —同孵育)。將至少一些分析物分子固定化于微珠。在此實施例中，分析物分子是以這樣的方式(例如以某個濃度)提供的，使得統(tǒng)計學(xué)顯著比例的微珠與單個分析物分子結(jié)合且統(tǒng)計學(xué)顯著比例的微珠不結(jié)合與任何分析物分子。例如，如步驟(B)中所示，將分析物分子4固定化于微珠5上，由此形成復(fù)合物6，而一些微珠7不與任何分析物分子相結(jié)合。要理解的是，如本文所描述的，在一些實施方式中，超過一種分析物分子與至少一些微珠相結(jié)合。所述大量微珠中至少有一些(例如，與單個分析物分子結(jié)合或不結(jié)合與任何分析物分子的那些微珠)可以隨后在空間上被劃分/分離為大量位置。如步驟(C)中所示，所述大量位置示例顯示為包含大量孔/反應(yīng)容器9的基底8。在此實施例中，各反應(yīng)容器包含零個或一個微珠。然后(例如，光學(xué)地或通過其他檢測方式)指認至少一些反應(yīng)容器以確定包含分析物分子的位置數(shù)量。例如， 如步驟(D)中所顯示的，用光源15對大量反應(yīng)容器進行光拾取，其中每個反應(yīng)容器都接觸電磁輻射(由箭頭10表示)。用檢測器15 (在此實施例中，其與光源15裝配在相同的系統(tǒng)中)確定從各個反應(yīng)容器發(fā)射的光(由箭頭11表示)?；趶姆磻?yīng)容器中檢測到的光確定含有分析物分子的反應(yīng)容器(例如，反應(yīng)容器12)數(shù)量。在一些情況下，還確定了含有不結(jié)合與任何分析物分子的微珠的反應(yīng)容器(例如，反應(yīng)容器13)的數(shù)量、不含微珠的孔(例如，反應(yīng)容器14)的數(shù)量和/或所指認的孔的總數(shù)。然后可使用這些結(jié)果確定流體樣品中分析物分子的濃度的量度。統(tǒng)計學(xué)顯著比例的含有至少一個分析物分子(或不含分析物分子)的捕獲物一般可使用具體的檢測系統(tǒng)再現(xiàn)性地檢測和定量，且一般在背景噪音(例如，非特異性結(jié)合)之上，背景噪音是在用不含任何分析物分子的樣品進行測定時確定的，除以所指認的捕獲物(或位置)的總數(shù)。如本文用于本實施方式的“統(tǒng)計學(xué)顯著比例”可根據(jù)公式I進行估算n >(公式 I)其中η為就選定類別的事件中確定的事件數(shù)量。即，當(dāng)事件的數(shù)量大于事件數(shù)量平方根的三倍時為統(tǒng)計學(xué)顯著的比例。例如，為確定不結(jié)合任何分析物分子或顆粒的捕獲物的統(tǒng)計學(xué)顯著比例，η為所檢測到的不結(jié)合任何分析物分子或顆粒的捕獲物數(shù)量。另一個實例中，為確定結(jié)合至少一個分析物分子或顆粒的捕獲物的統(tǒng)計學(xué)顯著比例，η為所檢測到的確定與分析物分子結(jié)合的捕獲物數(shù)量。在一些實施方式中，統(tǒng)計學(xué)顯著比例的結(jié)合至少一個分析物分子(或在一些情況下為單個分析物分子，其中捕獲物對分析物分子的混合比率在統(tǒng)計學(xué)上導(dǎo)致只有零個或一個分析物分子結(jié)合每個捕獲物)捕獲物(例如，微珠)相對捕獲物(例如，微珠)的總數(shù)的比率低于大約1:2、低于大約1:3、低于大約1:4、低于大約2:5、低于大約1:5、低于大約1:10、低于大約1:20、低于大約1:100、低于大約1:200或低于大約1:500。因此，在這些實施方式中，不結(jié)合任何分析物分子的捕獲物(例如，微珠)相對捕獲物(例如，微珠)的總數(shù)的比率至少為大約1:100、大約1:50、大約1:20、大約1:10、大約1:5、大約1:4、大約1:3、大約1:2、大約I: I、大約2: I、大約3: I、大約4: I、大約5: I、大約10: I、大約20: I、大約50: I、大約100:1,
在一些實施方式中，結(jié)合至少一個分析物分子(或在一些情況下為單個分析物分子，其中捕獲物對分析物分子的混合比率在統(tǒng)計學(xué)上導(dǎo)致只有零個或一個分析物分子結(jié)合于每個捕獲物)捕獲物(例如，微珠)的百分比為捕獲物總數(shù)的低于大約50%、低于大約40%、低于大約30%、低于大約20%、低于大約10%、低于大約5%、低于大約2%、低于大約1%、低于大約O. 5%、低于大約O. 01%，等等。在一些實施方式中，不結(jié)合分析物分子的捕獲物(例如，微珠)占捕獲物(例如，微珠)總數(shù)的百分比為捕獲物總數(shù)的至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%等等。在一些實施方式中，在空間劃分大量捕獲物之前可將捕獲物與大量對至少一種類型的分析物分子(或顆粒)具有親和力的結(jié)合配體相接觸。如本文所使用的，“結(jié)合配體”為特異性結(jié)合或特異性連接于分析物分子并幫助檢測分析物分子的任何分子、顆粒，等等。在其中至少一些捕獲物連接超過一個分析物分子(例如，兩個、三個、四個、五個或更多分析物分子)的實施方式中，結(jié)合配體尤其有用。在一些情況下，結(jié)合配體可以這樣的方式(例如以某種濃度水平)提供，使得統(tǒng)計學(xué)顯著比例的包含至少一個分析物分子的捕獲物與至少一個結(jié)合配體結(jié)合(或在一些情況下為單個結(jié)合配體)，且統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物(例如，與至少一個分析物分子結(jié)合或不結(jié)合與任何分析物分子的捕獲物)不結(jié)合任何結(jié)合配體。統(tǒng)計學(xué)顯著比例的包含連接于至少一個分析物分子和單個結(jié)合配體的捕獲物(例如，微珠)的位置大于或等于能夠用特定檢測系統(tǒng)再現(xiàn)地確定(即，對于多個基本上一致的含有連接于分析物分子和/或結(jié)合配體的捕獲物的流體樣品得到幾乎類似的結(jié)果)含有連接單個結(jié)合配體的捕獲物(例如，微珠)的位置的最小數(shù)量，其高于背景噪音(例如，非特異性結(jié)合)，背景噪音是在用不含任何分析物分子和/或結(jié)合配體的樣品進行測定時確定的，除以位置的總數(shù)?？筛鶕?jù)公式I確定統(tǒng)計學(xué)顯著比例的包含結(jié)合至少一個分析物分子及單個結(jié)合配體的捕獲物的位置?？梢砸曰旧纤胁东@物都連接零個或單一分析物分子的方式提供捕獲物數(shù)量相對分析物分子和/或結(jié)合配體的比率，可如本文所描述的方法，使用泊松分布調(diào)整計算此比率。在一些實施方式中，連接于至少一個分析物分子及至少一個結(jié)合配體的捕獲物(例如，微珠)相對捕獲物(例如，微珠)的總數(shù)的統(tǒng)計學(xué)顯著的比例低于大約1:2、低于大約1:3、低于大約1:4。低于大約2:5、低于大約1:5、低于大約1:10、低于大約1:20、低于大約1:100、低于大約1:200，或低于大約1:500。在一些情況下，不連接任何結(jié)合配體的捕獲物(例如，微珠)相對捕獲物總數(shù)的統(tǒng)計學(xué)顯著的比例為至少大約1:100、大約1:50、大約1:20、大約1:10、大約1:5、大約1:4、大約1:3、大約1:2、大約I: I、大約2: I、大約3: I、大約4:1、大約5: I、大約10: I、大約20: I、大約50: I、大約100:1，等等。在一些實施方式中，連接于至少一個分析物分子及至少一個結(jié)合配體的捕獲物(例如，微珠)相對捕獲物(例如，微珠)總數(shù)的百分比為低于大約50%、低于大約40%、低于大約30%、低于大約20%、低于大約10%、低于大約5%、低于大約2%、低于大約1%、低于大約
O.5%、低于大約O. 01%,或更低。在一些實施方式中，不連接任何結(jié)合配體的捕獲物(例如，微珠)相對捕獲物總數(shù)的百分比為至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、至少大約90%、至少大約95%、至少大約98%，或更高。
在圖2中示例說明了捕獲物連接超過一個分析物分子的實施方式的一個非限制性實例。提供了大量捕獲物20(步驟(A))。在此實施例中，所述大量捕獲物包含大量微珠。所述大量微珠與含有大量分析物分子21的流體樣品相接觸(例如，微珠20與分析物分子21一同孵育)。將至少一些的分析物分子固定化于微珠。例如，如步驟(B)中所示，將分析物分子22固定化于微珠24，由此形成復(fù)合物26。還示例說明的是包含固定化于三個分析物分子的微珠的復(fù)合物30，以及包含固定化于兩個分析物分子的微珠的復(fù)合物32。此外，在一些情況下，一些微珠可以不連接任何分析物分子(例如，微珠28)。將來自步驟(B)的大量微珠與大量結(jié)合配體31接觸。如步驟(C)中所示，將配體與固定化于微珠的一些分析物分子連接。例如，復(fù)合物40包含微珠34、分析物分子36和結(jié)合配體38。結(jié)合配體是以這樣的方式提供的，以使統(tǒng)計學(xué)顯著比例的包含至少一個分析物分子的微珠與至少一個結(jié)合配體(例如，一個、兩個、三個，等等)連接，且統(tǒng)計學(xué)顯著比例的包含至少一個分析物分子的微珠(即，如上文公式I所得)不與任何結(jié)合配體連接。然后將來自步驟(C)的大量微珠中的至少一部分在空間上劃分到大量位置。如步驟(D)中所示，在此實例中，這些位置包含位于基底42上的大量反應(yīng)容器41。所述大量反應(yīng)容器可與來自步驟(C)的大量微珠接觸，使得各個反應(yīng)容器包含零個或一個微珠。然后可對基底進行分析以確定包含結(jié)合配體的反應(yīng)容器(例如，反應(yīng)容器43)數(shù)量，其中數(shù)量可以與流體樣品中分析物分子的濃度的量度相關(guān)。在·量、不包含微珠的反應(yīng)容器(例如，反應(yīng)容器45)的數(shù)量、和/或所指認/分析的反應(yīng)容器總數(shù)。然后可用這些結(jié)果確定流體樣品中分析物分子的濃度的量度。前述示例性方法可使用本發(fā)明不同實施方式的大量不同測定方式、不同反應(yīng)條件和/或檢測系統(tǒng)而進行，下文描述了這些方式的幾個實施例。在本發(fā)明的范圍內(nèi)可使用另外的組分和/或方法步驟作為本文描述的示例性方法及組分的替代，及/或與其組合使用。應(yīng)當(dāng)理解的是，本文特定的討論聚焦于基底中包含大量孔/反應(yīng)容器的大量位置，然而這決不是限制性的，而且其他材料可用于將捕獲物/分子空間劃分入大量空間上不同的位置(例如，水合膠中/上的區(qū)域，平面基底表面上的點/區(qū)域，等等)。再如，盡管本文的大量討論都聚焦于包含大量微珠的大量捕獲物，然而這決不是限制性的，在其他實施方式中捕獲物可以采取其他物理形式(例如，納米管、盤片、環(huán)、微流滴，等等)。示例性測定形式本發(fā)明的測定法可根據(jù)非常廣泛的多種基本操作流程和形式進行。所選擇的特定形式可基于分析物分子的性質(zhì)、含有分析物分子的流體樣品的性質(zhì)以及分析物的連接伴侶的可及性和特性以及其他因素。前文中在對圖1-2進行討論的上下文中對幾個示例性基本形式有所討論。本公開提供的教義的益處會使本領(lǐng)域技術(shù)人員明白，本發(fā)明可備選地根據(jù)未在發(fā)明詳述中闡述的具體的、示例性實施方式中的具體描述的操作流程/形式而進行，但這些操作流程/形式在實踐時不需要不當(dāng)負擔(dān)或試驗。如上文所描述的，一種示例性的基礎(chǔ)測定形式/操作流程包括使大量構(gòu)造為捕獲分析物分子或顆粒的捕獲物(例如，微珠)與含有或疑似含有這些分析物分子(或顆粒)的樣品相接觸。這些分析物分子中至少有一些會固定化于捕獲物之。所述大量捕獲物可各自包括對至少一種類型的分析物分子具有親和力的結(jié)合表面。然后將至少一部分的捕獲物在空間上分隔入大量的位置(例如，反應(yīng)容器/孔)。至少部分地基于對包含含有至少一個分析物分子的捕獲物的位置數(shù)量的確定，可確定對分析物分子濃度的量度?，F(xiàn)在將討論此基礎(chǔ)測定形式的多個其他方面，包括大量有關(guān)材料、濃度、溶液、步驟等方面的考慮因素。在特定實施方式中，將大量捕獲物與含有或疑似含有至少一種類型的分析物分子的樣品相接觸，其中所述大量捕獲物包含對所述至少一種類型的分析物分子具有親和力的結(jié)合表面。在一些情況下，結(jié)合表面可包含大量捕獲組分。如本文所使用的，“捕獲組分”為任何置于固體支持物上的分子、其他化學(xué)/生物學(xué)實體或固體支持物修飾物，其能夠用于特異性附著、結(jié)合或捕獲靶標(biāo)分子或顆粒(例如，分析物分子)，而使得靶標(biāo)分子/顆粒固定化于捕獲組分和支持物。如本文所描述的，固定化可由分析物分子與捕獲物表面上的捕獲組分的連接引起。如本文所使用的，“固定化的”指的是捕獲、附著、結(jié)合或粘貼以防止靶標(biāo)分子/顆粒的解離或丟失，但不要求絕對地固定化于捕獲分子或捕獲物。固定化于捕獲物的分析物分子的數(shù)量可取決于樣品中分析物分子總數(shù)相對所提供的捕獲物的捕獲組分的總數(shù)、大小和/或表面密度中至少一項的比率。在一些實施方式中，固定化于單個捕獲物的分子或顆粒的數(shù)量可以遵循標(biāo)準(zhǔn)泊松分布。在一些情況下， 統(tǒng)計學(xué)顯著數(shù)量的捕獲物連接于單個分析物分子而統(tǒng)計學(xué)顯著數(shù)量的捕獲物不連接于分析物分子。所提供的捕獲物總數(shù)可為大約10，000-大約10，000, 000、大約50，000-大約5，000, 000、或大約100，000-大約1，000, 000。在一些情況下，所提供的捕獲物總數(shù)為至少大約10，000、至少大約50，000、至少大約100，000、至少大約1，000，000、至少大約5，000, 000、或至少大約10，000, 000。在一些情況下，流體樣品中分析物的數(shù)量相對所提供的捕獲物的比率為大約10:1-大約1:10，000，000、大約8:1-大約1:10，000，000、大約10:1-大約2:1、大約2:1-大約1:10、或低于大約1:10(例如，大約1:20、大約1:30等等)。流體樣品中分析物的數(shù)量相對所提供的捕獲物的比率可影響為確定流體樣品中分析物分子濃度的量度而進行的測定步驟和/或分析，如本文的定量一節(jié)中描述的。在一些情況下，幾乎所有樣品中所提供的分析物分子會固定化于捕獲物。S卩，樣品中超過大約90%、超過大約95%、超過大約97%、超過大約98%或超過大約99%的分析物分子會固定化于捕獲物。然而在一些情況下，樣品中只有一部分分析物分子會固定化于捕獲物。即，在一些情況下，樣品中所提供的大約1%_大約90%、大約10%-大約90%、大約20%-大約80%或大約30%-大約70%的分析物分子固定化于捕獲物分子。在一些實施方式中，至少大約10%、大約20%、大約30%、大約40%、大約50%、大約60%、大約70%、大約80%或大約90%、或大約95%的分析物分子固定化于捕獲物分子。在測定的一些形式中，固定化后可將大量捕獲物(例如，至少一些連接于至少一個分析物分子的捕獲物)與大量結(jié)合配體接觸。至少一些固定化于捕獲物的分析物分子可連接于結(jié)合配體。(例如，通過分析物分子)連接捕獲物的結(jié)合配體數(shù)可取決于固定化于單個捕獲物的分析物分子總數(shù)相對接觸捕獲物的結(jié)合配體總數(shù)的比率。例如，在基本上所有捕獲物都連接零個或一個分析物分子的實施方式中，可選擇條件以使基本上所有分析物分子都連接單個結(jié)合配體，這樣每個連接于單個分析物分子的捕獲物會(例如通過分析物分子)與單個結(jié)合配體連接。因此，含有單個分析物分子的位置(如反應(yīng)容器)的數(shù)量可通過確定包含結(jié)合配體的位置(例如，反應(yīng)容器)的數(shù)量而確定。在這些實施方式(例如，其中零個或至少一個分析物分子與各捕獲物連接)中，(例如在混合步驟中)所提供的結(jié)合配體與固定化于捕獲物的分析物分子總數(shù)的比率可為大約20: I、大約10: I、大約5: I、大約2:1或大約1:1。然而，在一些實施方式中，單個捕獲物可以連接于零個、一個或超過一個(例如，兩個、三個、四個，等等)分析物分子。在這些實施方式中，所提供的結(jié)合配體的濃度可使得統(tǒng)計學(xué)顯著比例的包含至少一個分析物分子的捕獲物只與單個結(jié)合配體連接，且統(tǒng)計學(xué)顯著比例的包含至少一個分析物分子的捕獲物不與任何結(jié)合配體連接。然而，在其他實施方式中，所提供的結(jié)合配體的濃度可使得統(tǒng)計學(xué)顯著比例的包含至少一個分析物分子的捕獲物與至少一個(例如，兩個、三個、四個，等等)結(jié)合配體連接，且統(tǒng)計學(xué)顯著比例的包含至少一個分析物分子的捕獲物不與任何結(jié)合配體連接。然后可確定流體樣品中分析物分子的濃度，可使用至少部分基于含有與結(jié)合配體連接的捕獲物的位置數(shù)量的分析(例如，通過將流體樣品中分析物分子濃度與包含結(jié)合配體的位置數(shù)量相關(guān))，還/或可使用至少部分基于指示了所指認位置處結(jié)合配體數(shù)量的信號的讀取強度的分析(例如，如本文所描述的，在其中至少一些捕獲物包含超過一個分析物分子和/或超過一個結(jié)合配體的實施方式中的情況)。在這些實施方式中(例如，其中超過一個分析物分子可固定化于各個捕獲物)，溶液中所提供的結(jié)合配體數(shù)量相對固定化于捕獲物的分析物分子數(shù)量的比率可以為大約1:50、大約1:40、大約1:30、大約1:20、大約1:10、大約1:5、大約1:3、大約1:2、大約1: 1，等等。在一些情況下，溶液中提供的結(jié)合配體數(shù)量的比率可基于所提供的捕獲物數(shù)量而計算。在一 些情況下，所提供的結(jié)合配體相對于捕獲物數(shù)量的比率為大約1:50、大約1:40、大約1:30、大約1:20、大約1:10、大約1:5、大約1:3、大約1:2、大約1:1，等等。在其他情況下，捕獲物數(shù)量相對所提供的捕獲物數(shù)量的比率為大約1:50、大約1:40、大約1:30、大約1:20、大約1:10、大約1:5、大約1:3、大約1:2，等等。在一些實施方式中，如本文所描述的，定量確定可包含泊松分布調(diào)整。在一些實施方式中，可選擇測定中所使用的結(jié)合配體濃度以最小化結(jié)合配體過量存在時發(fā)生的特定事件，例如，結(jié)合配體的非特異性連接。在一些情況下，如果結(jié)合配體的濃度太高，可以會由于非特異性相互作用(例如，與捕獲物、反應(yīng)容器等相互作用)產(chǎn)生背景讀數(shù)增加。在一些情況下，可選擇結(jié)合配體濃度(在分析物分子濃度未知的情況下為估計)以使僅僅一部分固定化于捕獲物的分析物分子與結(jié)合配體連接(例如，大約O. 1%、大約1%、大約2%、大約3%、大約4%、大約5%、大約10%、大約20%、大約30%、大約40%、大約50%或更高)。這在其中連接于至少一個分析物分子的捕獲物的百分比相對高的實施方式中尤其有用(例如，超過大約20%、超過大約30%、超過大約40%、超過大約50%、超過大約60%、超過大約70%、超過大約80%、超過大約90%，或更多)。在一些情況下，通過提供較低濃度的結(jié)合配體，使得并非每個固定化于捕獲物的分析物分子都與結(jié)合配體連接，這對于定量是有利的，例如，當(dāng)檢測需要結(jié)合配體的存在時，尤其是當(dāng)使用數(shù)字/ 二進制讀取技術(shù)時。例如，如果連接于分析物分子的捕獲物的百分比為大約50%或更高，可提供數(shù)量減少的結(jié)合配體，這樣不會所有的固定化的分析物分子都連接于結(jié)合配體。在其他情況下，可通過降低與分析物分子一同孵育的時間而減少連接于分析物分子的結(jié)合配體百分比，例如，限制接觸的時間以使只有一部分的固定化的分析物分子與分析物分子連接。溶液中分析物分子/結(jié)合配體/捕獲物/等等的總數(shù)可通過使用已知的溶液中分析物分子/結(jié)合配體/捕獲物/等等的濃度進行計算而確定。例如，溶液中結(jié)合配體的總數(shù)可根據(jù)公式2進行確定
#結(jié)合配體的數(shù)量=NaX [結(jié)合配體]X體積(公式2)其中Na為阿伏伽德羅數(shù)(6. 022xl023mor1)，[結(jié)合配體]為溶液中結(jié)合配體的濃度(摩爾/升)，體積為所使用的溶液總體積(升)?？蓪ζ渌M分(例如(如校準(zhǔn)樣品中的)分析物分子、捕獲物等等)進行類似的計算。在大量分析物分子固定化于大量捕獲物后，且在一些情況下結(jié)合配體連接至至少一些所述的固定化分析物分子，至少一部分的捕獲物可在空間上劃分入大量位置?？臻g上劃分入大量位置的捕獲物的百分比會隨著大量因素影響而變動，包括但不限于捕獲物數(shù)量相對位置總數(shù)的比率、空間劃分捕獲物的方法，和/或捕獲物接觸這些位置的時間長度。在一些情況下，至少大約O. 5%、至少大約1%、至少大約2%、至少大約5%、至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約 80%、至少超過90%或更多的捕獲物在空間上劃分入大量位置。在一些情況下，大約O. 1%-大約50%、大約O. 1%-大約30%,大約O. 5%-大約20%,大約O. 5%-大約10%,大約O. 5%-大約5%,大約1%-大約10%、或大約O. 5%、大約1%、大約2%、大約4%、大約5%、大約10%、大約20%、大約30%、大約50%、大約70%或大約90%的捕獲物在空間上被劃分入大量位置中。在將至少一部分的捕獲物劃分入大量位置中后，可指認至少一部分的位置。所指認的位置數(shù)量可為位置總數(shù)的大約O. 5%、大約1%、大約2%、大約3%、大約5%、大約10%、大約20%、大約30%、大約40%、大約50%、大約60%、大約70%、大約80%、大約90%、大約95%或更多?？芍刚J一部分的位置以確定含有分析物分子，或在一些情況下含有結(jié)合配體的位置數(shù)量。在一些情況下，也可確定含有不連接于分析物分子(或結(jié)合配體)的捕獲物的位置數(shù)量、含有及/或不含有捕獲物的位置數(shù)量，及/或所分析/確定的位置總數(shù)?？芍辽俨糠只诖_定含有分析物分子(或結(jié)合配體)的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子的濃度的量度。在一些情況下，可至少部分地基于含有連接于分析物分子的捕獲物的位置數(shù)量相對所指認的位置總數(shù)或所指認的含有捕獲物的位置總數(shù)的比率而確定流體樣品中分析物分子的濃度的量度。在其他情況下，可至少部分地基于含有連接于分析物分子的捕獲物的位置數(shù)量相對含有不連接于分析物分子的捕獲物的位置數(shù)量的比率而確定流體樣品中分析物分子的濃度的量度?？捎糜诖_定流體樣品中分析物分子的濃度的量度的具體方法和計算在下文有詳細討論。本文描述的有關(guān)第一種組分對第二種組分(例如，分析物分子/捕獲物、結(jié)合配體/捕獲物、結(jié)合配體/分析物分子、捕獲物/位置、前體標(biāo)記試劑/結(jié)合配體，等等)的數(shù)量/量/比率的比率、百分比和其他參數(shù)可根據(jù)需要而調(diào)整，以產(chǎn)生想要的每個捕獲物所捕獲的分析物分子/結(jié)合配體比率，且/或可在本說明書提供的教義和指導(dǎo)下使用常規(guī)試驗方法、計算(在一些情況下，包括采用泊松分布)、篩選測試等等進行控制或確定。例如，已知如果所提供的捕獲物數(shù)量(如，使用等式I中類似的公式確定)，可根據(jù)所需要的捕獲物相對結(jié)合配體的比率確定需要提供的結(jié)合配體數(shù)量，由此可確定應(yīng)當(dāng)提供的結(jié)合配體的摩爾數(shù)。另一個例子是，在未知分析物分子濃度的情況下，如果第一種測定法顯示有顯著數(shù)量的捕獲物包含超過一個分析物分子(例如，所有或顯著數(shù)量的位置確定為含有分析物分子或少于統(tǒng)計學(xué)顯著數(shù)量的微珠確定為不連接于分析物分子)，則可將流體樣品稀釋且/或可增加捕獲物數(shù)量以使包含至少一個分析物分子的捕獲物的數(shù)量可以降低?，F(xiàn)在將詳細討論測定的其他方面。應(yīng)當(dāng)理解的是，在本文描述的特定示例性測定形式中，以下步驟中的一部分或全部步驟可至少進行一次?？蛇M行但未描述的其他步驟的非限制性實例包括但不限于，洗滌和/或接觸另外的結(jié)合配體、前體標(biāo)記試劑和/或標(biāo)記試
齊Li，等等。在一些實施方式中，可在空間上將大量捕獲物中的至少一些劃分入大量位置之前、同時和/或之后，將大量捕獲物(例如，其中至少有一些與至少一個分析物分子連接)與至少一種其他的反應(yīng)組分相接觸。在一些情況下，捕獲物可接觸大量結(jié)合配體。在特定實施方式中，可將結(jié)合配體調(diào)整為直接進行檢測(例如，結(jié)合配體包含可檢測的分子或部分)或可調(diào)整為間接檢測(例如，包括能將前體標(biāo)記試劑轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑的組分)，下文進行更詳細的討論。在任何測定法中，都可采用超過一種類型的連接方式，例如，第一種類型的結(jié)合配體和第二種類型的結(jié)合配體。在一個實例中，第一種類型的結(jié)合配體能夠與第一種類 型的分析物分子連接，而第二種類型的結(jié)合配體能夠與第一種類型的分析物分子連接。在另一個實例中，第一種類型的結(jié)合配體和第二種類型的結(jié)合配體都可與單個分析物分子的相同或不同表位連接，在下文有所描述。特定的結(jié)合配體可包含能夠直接或間接地幫助檢測的組分。在其中組分包含可測量特性(例如，熒光發(fā)射、顯色，等等)的實施方式中可采用直接檢測組分。所述組分可通過例如將前體標(biāo)記試劑轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑(例如，在測定中進行檢測的試劑)而幫助直接檢測?！扒绑w標(biāo)記試劑”為任何可在接觸合適的轉(zhuǎn)化試劑(例如，酶組分)時被轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑的分子、顆粒等等。“標(biāo)記試劑”為任何在使用選定的檢測技術(shù)時作為檢測實體而幫助檢測的分子、顆粒等等。在一些實施方式中，至少有一個結(jié)合配體包含酶組分。在一些實施方式中，分析物分子可包含酶組分。酶組分可將前體標(biāo)記試劑(例如，酶底物)轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑(例如，可檢測產(chǎn)物)。然后至少部分地基于確定含有標(biāo)記試劑的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子濃度的量度(例如，通過將含有標(biāo)記試劑的位置數(shù)量與含有分析物分子的位置數(shù)量相關(guān))。酶或酶組分的非限制性實例包括辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。用于檢測的系統(tǒng)或方法的其他非限制性實例包括其中核酸前體被復(fù)制成多個拷貝或轉(zhuǎn)化為能容易檢測的核酸的實施方式，如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、滾環(huán)擴增(RCA)、連接、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增(LAMP)等。這些系統(tǒng)和方法對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知，例如在“DNAAmpIifixation:Current Technologies and Applications, , Vadim Demidov等人，2004 中有描述。如圖3所示的包括使用前體標(biāo)記試劑的測定法的一個實例中，所提供的基底100包含大量位置，其中位置包含反應(yīng)容器。在反應(yīng)容器101 (例如，位置)中，分析物分子102固定化于微珠103 (例如，捕獲物)。結(jié)合配體104與分析物分子102連接。結(jié)合配體包含酶組分(未顯示)。前體標(biāo)記試劑106 (在接觸酶組分時)轉(zhuǎn)換為標(biāo)記試劑108。使用本文描述的方法檢測標(biāo)記試劑108。相反,反應(yīng)容器111含有固定化于微珠110的分析物分子112。在這個反應(yīng)容器中，分析物分子112不與包含酶組分的結(jié)合配體連接。因此，在反應(yīng)容器中，前體標(biāo)記試劑114不會轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑。因此，與其中前體標(biāo)記試劑轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑的反應(yīng)容器101相比，這個反應(yīng)容器會給出不同的信號。在一些情況下，還可以有含有不連接于分析物分子的微珠的反應(yīng)容器，例如，反應(yīng)容器121含有微珠116。另外，反應(yīng)容器中的一些可以不包含任何微珠，例如，反應(yīng)容器123。與反應(yīng)容器101相比，反應(yīng)容器121和123可以給出不同信號，因為其中可以不存在標(biāo)記試劑。然而，反應(yīng)容器121和123可以含有前體標(biāo)記試劑117。在任何給定的反應(yīng)容器中都可以存在超過一種前體標(biāo)記試劑。在特定實施方式中，可采用溶解的或重懸的前體標(biāo)記試劑，其中前體標(biāo)記試劑轉(zhuǎn)化為不可溶于液體和/或在此位置中/附近(例如，在標(biāo)記試劑形成的反應(yīng)容器中)固定化的標(biāo)記試劑。這些前體標(biāo)記試劑和標(biāo)記試劑及其用途描述于Duffy等人提交于2008年9月23日的共有美國專利申請序列號12/236，484,題名為“High Sensitivity Determinationof the Concentration of Analyte molecules in a Fluid Sample, ”,其通過弓I用并入本文。在一些實施方式中，在測定過程中至少會進行一次洗滌步驟。在一個例子中，可在捕獲物接觸一種或多種包含分析物分子、結(jié)合配體、前體標(biāo)記試劑等的溶液之后洗滌大量捕獲物。例如，在分析物分子固定化于大量捕獲物后，大量捕獲物可經(jīng)歷洗滌步驟，由此移除任何非特異性固定化于捕獲物的分析物分子。在特定實施方式中，選擇洗滌溶液使得其 不引起捕獲物分子和/或分析物分子的構(gòu)象的顯著變化并/或不破壞測定中至少兩種組分(如，捕獲組分和分析物分子)之間的特異性連接相互作用。在其他情況下，可選擇化學(xué)上于一種或多種測定組分相互作用的洗滌溶液。如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所理解的，洗滌步驟可在本發(fā)明的方法中的任何合適時間點進行。在一些實施方式中，所實施的測定法不包括使用包含用于至少一種類型的分析物分子的結(jié)合表面的大量捕獲物和/或這些捕獲物空間劃分入其中的大量位置。例如，在特定實施方式中根據(jù)本發(fā)明的測定可使用任何適當(dāng)?shù)姆椒?，其能夠分離單個分析物分子和/或連接一個或多個分析物分子的捕獲物，使得它們能夠被單獨指認用于檢測。例如，測定法可以包括提供大量捕獲物，其各自連接于單個分析物分子或不連接任何分析物分子。至少一部分的捕獲物可進行單獨指認以確定連接于分析物分子或顆粒的捕獲物數(shù)量。至少部分地基于確定連接于分析物分子的捕獲物的數(shù)量，可確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。圖4A示例說明了一個非限制性實施方式，其中單個分析物分子被空間劃分入大量液滴中。在圖4A中，提供了大量分析物分子70，如步驟(A)所示。在此實施例中，能夠?qū)Ψ治鑫锓肿?0進行光學(xué)檢測(例如，可使用光拾取直接檢測分析物分子)。這些大量分析物分子70中至少有一些是包含在液滴72之內(nèi)的(例如，使用微流體技術(shù))，液滴72包括流體71，如步驟(B)中所示。另外，可以存在一些不含有任何分析物分子的微滴(例如，包含流體71的微滴74)。大量微滴75基本上由流體73包圍，而后者幾乎與流體71不相溶。通過將微滴注入柱子74使得每個微滴單列通過光學(xué)檢測系統(tǒng)(例如，包含光源76和檢測器78)的形式而對大量的微滴75進行光拾取，如步驟(C)所示。在光學(xué)信號有變化(例如，由于微滴中存在分析物分子引起的光學(xué)信號變化)時，可確定微滴各自含有分析物分子。如圖4B中示例說明的另一個實施例中，提供了大量分析物分子80，如步驟(A)所示。在此實施例中，分析物分子70不能進行光學(xué)檢測，必須進行間接檢測(如本文所描述的)。將大量分析物分子80與大量結(jié)合配體82相接觸，使至少一種結(jié)合配體連接顯著比例的分析物分子，如步驟(B )中所示，形成復(fù)合物83，如步驟(B )中所示。在此實施例中，每個結(jié)合配體82都包含酶組分84。至少一部分的復(fù)合物83可包含在微滴85之內(nèi)(例如，使用微流體技術(shù))，如步驟(C)中所示，其包含液體79。此外，可以存在不含任何復(fù)合物的一些微滴(例如，包含流體79的微滴86)。大量微滴91基本上都由流體87包圍，而后者幾乎與流體79不相溶。液滴85和86可另外包含前體標(biāo)記試劑86，其在接觸酶組分84時會轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑88，如箭頭87所示。通過將大量微滴注入柱子89使得每個微滴單列通過光學(xué)檢測系統(tǒng)(例如，包含光源90和檢測器92)式而對大量的微滴91進行光拾取，如步驟(D)所不。在光學(xué)信號有變化(例如，由于微滴中存在標(biāo)記試劑引起的光學(xué)信號變化)時，可確定微滴各自含有分析物分子。作為另一個實例，圖4C示例說明了一個實施方式，其中單個分析物分子282通過捕獲組分274與目標(biāo)280連接。此外，在此實例中，固定化的分析物分子連接于結(jié)合配體284。通過將微滴注入柱子287使得每個微滴單列通過光學(xué)檢測系統(tǒng)(例如，包含光源286和檢測器288)而對這些微滴進行光拾取。 在光學(xué)信號有變化(例如，由于微滴中存在結(jié)合配體引起的光學(xué)信號變化)時，可確定微滴各自含有結(jié)合配體。以下章節(jié)提供了和可用于實踐上文描述的測定法的方法步驟、材料和參數(shù)有關(guān)的其他息。捕獲物和用于捕獲物分隔的空間位置在一些實施方式中，本發(fā)明的方法和系統(tǒng)采用了大量捕獲物，其各自包括對至少一種類型的分析物分子具有親和力的結(jié)合表面。所述大量捕獲物可構(gòu)造為能夠在空間上彼此分隔，即，捕獲物可以這樣的形式提供，使得捕獲物能夠在空間上劃分入大量位置。例如，大量捕獲物可包含大量微珠(可以為任何形狀，例如，球狀、盤狀、環(huán)狀、立方體狀等等)、微粒的分散液或懸液(例如，在液體中重懸的大量顆粒)、納米管，等等。在一些實施方式中，大量捕獲物在測定使用的溶劑或溶液中不可溶或幾乎不可溶。在一些情況下，捕獲物為固態(tài)或幾乎是固態(tài)的(例如，基本上沒有孔)，然而，在一些情況下，大量的捕獲物可以為多孔的或基本上多孔的、空心或部分空心的，等等。大量的捕獲物可以為非吸收性的、基本上吸收性的或吸收性的。在一些情況下，所述大量捕獲物可包含磁性材料，其在本文有所描述，可以有助于測定的特定方面(例如，洗滌步驟)。在一些情況下，捕獲物表面還可以包含保護性或鈍化層，這些能夠減少或最小化非特異性連接事件(例如，分析物分子、結(jié)合配體等等)。在一些實施方式中，捕獲物各自包括對至少一種類型的目的分析物分子具有親和力的結(jié)合表面。可根據(jù)捕獲物的物理形狀/特征或特性(例如，大小，形狀)和測定的形式來選擇或構(gòu)造包含結(jié)合表面的部分捕獲物。在一些實施方式中，基本上所有的捕獲物的外表面都形成結(jié)合表面?？赏ㄟ^將大量捕獲組分與捕獲物連接而形成對至少一種類型的分析物分子具有親和力的結(jié)合表面。在一些情況下，分析物分子可通過形成至少一種化學(xué)鍵及/或通過物理吸附或二者的組合而連接(例如，固定化于)捕獲組分?；瘜W(xué)鍵的類型的非限制性實例包括離子鍵、共價鍵(例如，碳-碳、碳-氧、氧-硅、硫-硫、磷-氮、碳-氮、金屬-氧或其他共價鍵)、氫鍵(例如，在羥基，胺基，羧基，巰基，和/或類似的功能基團之間)、配位鍵(例如，金屬離子和單配位鍵或多配位鍵配體之間形成的復(fù)合或螯合)、范德華相互作用，等等。用于或可能用于實踐本發(fā)明特定方面和實施方式的捕獲組分在下文有更詳細的討論。至少一些分析物分子在接觸包含大量捕獲組分的大量捕獲物時會固定化于捕獲組分。在特定實施方式中，基本上所測試的流體中所有的大量分析物分子會固定化于捕獲組分(并由此固定化于捕獲物)。不希望受任何理論的約束，相比于其中分析物自身被分隔開進行檢測而不需接觸并固定化于捕獲物的測定，本發(fā)明特定實施方式中捕獲步驟的使用有助于增加檢測和定量樣品中分析物濃度的速度和/或效率，其中具有大的結(jié)合表面的大量捕獲物接觸含有分析物或顆粒的流體樣品，使得分析物分子/顆粒固定化于捕獲物。如果攪拌(例如，攪動)所述溶液(大量分析物分子和捕獲物在其中孵育以進行捕獲)以增加大量捕獲物(例如，微珠)和分析物分子的碰撞頻率和傳質(zhì)速率(例如，在與包含靜態(tài)表面的基底(例如，微量滴定板)對撞時)，所述結(jié)合速率和效率上的增加可得到進一步增強。用于分析物捕獲的大量捕獲物可以為任何合適的大小或形狀。合適的形狀的非限制性實例包括球體、立方體、橢圓體、管狀、層狀等等。在特定實施方式中，捕獲物的平均直徑(如果基本上是球體)或平均最大橫截面尺寸(對于其他形狀)可超過大約O. Ium(微米)、超過大約lum、超過大約10um、超過大約lOOum、超過大約Imm等等。在其他實施方式中,捕獲物平均直徑或捕獲物的最大尺寸在一維方向上可以為大約O. Ium-大約lOOum，大約Ium-大約IOOum,大約IOum-大約IOOum,大約O. Ium-大約Imm,大約Ium-大約IOmm,大約O. Ium-大約10um，等等。如本文所使用的，大量捕獲物的“平均直徑”或“平均最大橫截面尺寸”是捕獲物的直徑/最大橫截面尺寸的算術(shù)平均值。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員能夠確定捕獲物群體的 平均直徑/最大橫截面尺寸，例如，使用激光光散射，顯微鏡檢查，篩分析或其他已知技術(shù)。例如，在一些情況下，可使用庫爾特計數(shù)器以確定大量微珠的平均直徑。用于分析物捕獲的捕獲物可由一種或多種適當(dāng)?shù)牟牧线M行制作，例如，塑料或合成的多聚物(例如，聚乙烯、聚丙烯，聚苯乙烯、聚酰胺、聚氨酯、酚醛聚合物或硝酸纖維素等)、天然衍生多聚物(膠乳橡膠、多糖、多肽等)、復(fù)合材料、陶瓷、硅或硅基材料、碳、金屬或金屬化合物(例如，包括金、銀、鋼、鋁、銅等)、無機玻璃、硅土、以及各種各樣的其他合適的材料?？赡芎线m的構(gòu)造的非限制性實例包括微珠(例如磁珠)、管(例如，納米管)、板、盤片、試紙，或諸如此類。在一些情況下，可選擇捕獲物以使捕獲物自身能夠被系統(tǒng)檢測。這一點可用于其中要確定連接一個分析物分子的捕獲物比例或百分比的實施方式中(例如，當(dāng)所拾取和檢測的捕獲物總數(shù)被用于確定連接于分析物分子的捕獲物的比例時)。例如，捕獲物的特征在于其具有的發(fā)射或吸收光譜，可以用于檢測，以便捕獲物可被拾取而確定哪個空間位置包含捕獲物?？梢赃@樣選擇發(fā)射光譜的性質(zhì)(例如，(多個)波長、強度等)，使得捕獲物所產(chǎn)生的發(fā)射光不會顯著改變和/或干擾在測定中使用的組分的任何其他發(fā)射光(例如，任何用于確定分析物分子存在或不存在的標(biāo)簽的發(fā)射光)。在一些情況下，可使用存在于捕獲物表面上的結(jié)合配體，將染料分子與捕獲物連接(例如，染料分子可通過鍵或相互作用與捕獲組分連接)。在一些情況下，有大約I-大約50，000、或大約1000-大約50. 000、或大約1000-大約20. 000、或大約10，000-大約20，000、或大約1，000-大約10，000、或大約10，000-大約30，000、或大約I-大約10，000個染料分子(例如，熒光染料分子)與每個捕獲物連接。見例如，實施例21。在一些情況下，在結(jié)合配體附著于捕獲物之前，染料分子可以首先與捕獲物連接。這種方法減少了染料分子附著降低結(jié)合配體親和力的幾率。在一些情況下，染料分子附著于惰性的“封閉”蛋白質(zhì)(例如，牛血清白蛋白)，在結(jié)合配體附著于捕獲物后，將染料標(biāo)記的惰性蛋白質(zhì)用于封閉微珠。應(yīng)當(dāng)理解的是，在一些情況下，可使用白光檢測和定量捕獲物(如本文所描述的，例如使用明場，暗場和/或相差成像)。在一些實施方式中，對于分析物捕獲可使用超過一種類型的捕獲物。在一些情況下，每種類型的捕獲物可包括具有不同結(jié)合特異性的表面。在這些實施方式中，在單次的復(fù)合測定法中可以定量和/或檢測超過一種類型的分析物分子。例如，用于分析物捕獲的大量捕獲物可包括大量的第一種類型的捕獲物(包含對第一種類型的分析物分子的親和力的結(jié)合表面)以及大量的第二種類型的捕獲物(包含對第二種類型的分析物分子的親和力的結(jié)合表面)。在接觸含有第一種類型的分析物分子及第二種類型的分析物分子的樣品時，第一種類型的分析物分子會固定化于第一種類型的捕獲物而第二種類型的分析物分子會固定化于第二種類型的捕獲物。可以通過包括差異化的檢測特性編碼第一種類型的捕獲物和第二種類型的捕獲物以在彼此間進行區(qū)分(例如，有助于檢測時的分化)。例如，每種類型的捕獲物可具有差異化的熒光發(fā)射、光譜反射率、形狀、光譜吸收或FTIR發(fā)射或吸收。在一個具體的實施方式中，每種類型的捕獲物可包含一種或多種染料化合物(例如，熒光染料)，但是其為不同的濃度水平，這樣每種類型的捕獲物就具有可區(qū)分的信號(例如，基于熒光發(fā)射的強度)。在捕獲步驟后將捕獲物空間劃分入大量位置用于檢測時，可通過差異化特性的檢測將包含連接第一種類型分析物分子的第一種類型的捕獲物的位置可與包含連接第二種類型分析物分子的第二種類型的捕獲物的位置相區(qū)分。可以確定包含每種類型的捕獲物的 位置數(shù)量和/或連接于分析物分子的捕獲物數(shù)量，使得能夠至少部分地基于這些數(shù)量而確定流體樣品中第一種類型的分析物分子和第二種類型的分析物分子的濃度的量度。例如，如圖5中所示例說明的，步驟(A)大量的第一種類型的捕獲物132 (包含第一種類型的捕獲組分134)和大量的第二種類型的捕獲物136 (包含第二種類型的捕獲組分138)。將所述大量捕獲物與包含大量第一種類型分析物分子140和第二種類型分析物分子142的流體樣品相接觸。如步驟(B)中所示，至少一些第一種類型的分析物分子140可通過捕獲組分134連接于第一種類型捕獲物132，而至少一些第二種類型的分析物分子142可通過捕獲組分138連接于第二種類型捕獲物136。有一些第一種類型的捕獲物和第二種類型捕獲物可以不連接任何第一種類型或第二種類型的分析物分子。來自步驟(B)的大量捕獲物中至少有一些空間劃分入大量位置(由基底146中形成的反應(yīng)容器142表示，如步驟(C)中所示)。一些反應(yīng)容器可以不包含任何捕獲物。然后，可分析所述大量的反應(yīng)容器(例如，如圖I的步驟(D)中所闡述)以確定含有連接第一種類型的分析物分子的第一種類型的捕獲物的反應(yīng)容器數(shù)量(例如，反應(yīng)容器144)和含有連接第二種類型的分析物分子的第二種類型的捕獲物的反應(yīng)容器數(shù)量(例如，反應(yīng)容器145)。此外，還可確定含有不連接任何分析物分子的第一種類型的捕獲物或第二種類型捕獲物的位置數(shù)量?？芍辽俨糠值鼗谒鶛z測的第一種類型(或第二種類型)的分析物分子的數(shù)量而確定對第一種類型(或第二種類型)的分析物分子的濃度的度量。備選地，流體樣品中第一種類型(或第二種類型)的分析物分子的濃度的度量可基于包含連接第一種類型(或第二種類型)的分析物分子的第一種類型(或第二種類型)的捕獲物的反應(yīng)容器數(shù)量相對包含不連接任何分析物分子的第一種類型(或第二種類型)的捕獲物的反應(yīng)容器數(shù)量的比率。另外的用于確定流體樣品中第一種類型和/或第二種類型的分析物分子的濃度的方法可使用類似于本文描述的方法而進行，用于包含單一類型的分析物分子的樣品。使用光學(xué)檢測時，第一種類型的捕獲物可以在第一個波長處具有最大發(fā)射波長而第二種類型的捕獲物可以在第二個波長處具有最大發(fā)射波長，因此使得含有第一種類型捕獲物的反應(yīng)容器可與含有第二種類型捕獲物的反應(yīng)容器相區(qū)分。
備選地或組合地，如上文所描述的，在一些復(fù)用的測定中使用編碼的捕獲物用于復(fù)用，可使用類似的捕獲物類型，其在特定情況下可以各自包括特異于多種類型分析物的捕獲組分。在特定的這些測定中，第一種類型的結(jié)合配體(如，對第一種分析物分子類型具有親和力)和第二、第三等等類型的結(jié)合配體(分別對第二、第三等等類型的分析物分子具有親和力并被構(gòu)造為能可檢測地相互區(qū)分(如通過使用差異化的檢測標(biāo)記物、酶組分和/或標(biāo)記試劑，等等))可與測定法相結(jié)合而使用，而對不同類型結(jié)合配體的檢測/定量可與流體樣品中不同類型分析物分子的存在情況/濃度相關(guān)聯(lián)。在一個特定的實施方式中，用于分析物捕獲的大量捕獲物包 含大量微珠。這些微珠可以各自包含大量捕獲組分，大量分析物分子可通過這些組分固定化。所述大量捕獲物組分可存在于微珠表面。在一些實施方式中，微珠可以為磁珠。微珠的磁學(xué)特性可以幫助將微珠從溶液中(例如，包含大量未連接的分析物分子)和/或在(例如，移除多余流體樣品、標(biāo)記試劑等等的)洗滌步驟中分離。潛在的合適的微珠(包括磁珠)可獲自大量供應(yīng)商。如上所述，有很多其他用于分析物捕獲的潛在的合適捕獲物的實例，包括納米管(如碳納米管)、微流體微滴(如，基本上由第二種液體包圍的第一種液體的微滴)，等等。本領(lǐng)域一般技術(shù)人員會知曉用于將大量捕獲物與含有或疑似含有分析物分子的流體樣品相接觸用于初步分析物捕獲的方法和技術(shù)。例如，可直接向流體樣品中加入大量捕獲物(例如，以固體形式、以溶液形式)。作為另一個例子，可向(如溶液形式，固體形式的)大量捕獲物加入流體樣品。在一些例子中，可對溶液進行攪拌(例如，攪動、搖動，等等)。在分析物分子固定化于大量捕獲物之后，捕獲物可經(jīng)歷至少一次洗滌步驟。洗滌步驟可幫助從溶液中移除任何未連接的分子(例如，分析物分子或其他反應(yīng)組分)。例如，參考圖1，在分析物分子4固定化于微珠6之后，如步驟(B)所示，可進行洗滌步驟以移除未固定化于分析物分子的任何未結(jié)合的分析物分子。作為另一個實例，參考圖2，在將配體31與分析物36連接后，如步驟(C)所示，可進行洗滌步驟以移除任何未結(jié)合的結(jié)合配體。洗滌步驟可使用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的任何合適的技術(shù)而進行，例如，通過將捕獲物與洗滌溶液一同孵育，隨后對包含捕獲物的溶液進行離心，棄去液體，或通過使用過濾技術(shù)。在其中大量捕獲物包含大量磁珠的實施方式中，可在磁鐵的作用下將微珠從總?cè)芤褐蟹蛛x?？稍趯⒋罅坎东@物空間劃分入大量位置用于檢測之前，將捕獲步驟后的大量捕獲物(例如，至少有一些連接于至少一個分析物分子)與一種或多種另外的反應(yīng)劑相接觸。例如，如前所述，捕獲物可接觸大量結(jié)合配體，其中至少有一些連接于固定化的分析物分子。如上所述，這些捕獲物可接觸超過一種類型的結(jié)合配體(例如，第一種類型的結(jié)合配體和第二、第三等等類型的結(jié)合配體)。結(jié)合配體與固定化的分析物分子的連接有助于對分析物分子的檢測，如本文所描述的。在一些實施方式中，除了用于分析物捕獲的大量捕獲物之外，還可提供和/或采用大量對照物。對照物可用于多種目的，包括但不限于，(例如在大量位置以反應(yīng)點陣列、反應(yīng)容器等等形式形成的情況下)鑒別大量位置的方向以幫助確定測定的質(zhì)量，且/或幫助校準(zhǔn)檢測系統(tǒng)(例如，光拾取系統(tǒng))，如下文所描述的。應(yīng)當(dāng)理解的是，在任何測定形式中可存在超過一種類型的對照物(例如，第一種類型的對照物以確定測定的質(zhì)量而第二種類型的對照物作為位置標(biāo)記物)，或單一類型的對照物可具有超過一種的上述功能。在一些情況下，對照物是用于識別陣列上大量位置(例如，反應(yīng)容器、位點等等)的方向(例如，作為陣列的位置標(biāo)記物)。例如，對照物可在陣列上隨機或特異分布，并可提供一個或多個參考位置用于確定陣列的方向/位置。這一特征可以在比較多個不同時間間隔的陣列的部分圖像時有作用。也就是，陣列中對照物的位置可用于登記這些圖像。在一些情況下，在其中組合大量小的重疊區(qū)域的圖像形成較大圖像的實施方式中，對照物可用于提供參考位置。在測定中的對照物的存在情況可提供關(guān)于測定質(zhì)量的信息。例如，如果發(fā)現(xiàn)一個位置含有包含酶組分的對照物而不存在標(biāo)記試劑時(例如，在包含酶組分的對照物接觸前體標(biāo)記試劑時會出現(xiàn)其產(chǎn)物)，這表示測定的一些方面可以沒有正常運行。例如，反應(yīng)劑的質(zhì)量可以有損害(例如，前體標(biāo)記試劑濃度太低、前體標(biāo)記試劑降解，等等)，且/或可以不是全部的位置都接觸到了前體標(biāo)記試劑。在一些實施方式中，對照物可用于校準(zhǔn)檢測系統(tǒng)。例如，對照物可輸出光學(xué)信號，以用于校準(zhǔn)光學(xué)檢測系統(tǒng)。在一些實施方式中，可定性對照物并檢驗其具體的特征(例如，熒光、顏色、光吸收等等)，這些特征可作為檢測系統(tǒng)性能的質(zhì)量控制檢查。 在一些情況下，對照物可用于標(biāo)準(zhǔn)化或歸一化系統(tǒng)，以考慮到不同系統(tǒng)組分(例如，檢測系統(tǒng)、陣列、反應(yīng)劑等等)在不同測定中、在一段時間內(nèi)等等，在測試中所使用的陣列不同部分之間和/或兩個不同陣列之間在性能和/或特征上的變動的影響。例如，實驗設(shè)置、參數(shù)和/或變化可導(dǎo)致在不同時間點產(chǎn)生自單個陣列、或在同時或不同時間點在至少兩個陣列之間的信號(例如，熒光信號)強度的變化。此外，在單個陣列中，陣列的不同部分可以產(chǎn)生不同的背景信號。這些變化可導(dǎo)致陣列之間、陣列的不同部分之間或多個時間處的校準(zhǔn)信號(例如，對平均微珠信號的確定)的變化，這可導(dǎo)致一些情況下產(chǎn)生不準(zhǔn)確的結(jié)果?？梢鹱兓姆窍拗菩詫嵗?biāo)記試劑濃度、溫度、聚焦、檢測光強度、陣列中位置的深度和/或尺寸，等等?？紤]到這些變動中的一些或全部的效應(yīng)，在一些實施方式中，可使用大量對照物。在特定的例子中，這些對照物基本上不連接于分析物分子或顆粒。在特定實施方式中，低于大約20%、大約10%、大約5%、大約1%等等的對照物連接于分析物分子或顆粒。對照物可與捕獲物相區(qū)分(例如，其可分別產(chǎn)生可區(qū)分的信號)，且系統(tǒng)可配置為任何連接對照物的分析物分子不計在對分析物分子的濃度確定之內(nèi)。來自對照物的信號可用于將不同陣列之間或單個陣列不同區(qū)域之間的拾取值進行歸一化。例如，因為來自對照物的信號應(yīng)當(dāng)在陣列之間和/或?qū)τ趩蝹€陣列為近似相等的，所以對照物信號可歸一化至一個恰當(dāng)?shù)闹担菍φ瘴?例如，連接于分析物分子的捕獲物)的信號也作相應(yīng)的調(diào)整。在接觸含有分析物分子的流體樣品之前，可與用于分析物捕獲的大量捕獲物一起提供對照物，或可在測定中的另一個時間點加入對照物(例如，在接觸大量分析物分子和/或結(jié)合配體之后，和/或在將大量捕獲物空間劃分入大量位置之前)。可使用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的技術(shù)將對照物和捕獲物相區(qū)分。例如，在一些實施方式中，對照物相比于含有對分析物分子的結(jié)合表面的捕獲物可包含獨特的屬性(例如，有編碼)。例如，與捕獲物相t匕，對照物可具有不同的熒光發(fā)射、光譜反射率、形狀、光譜吸收或者FTIR發(fā)射或吸收。測定中的對照物對物質(zhì)(例如，捕獲物和對照物)總數(shù)的百分比為大約O. 0001%、大約O. 0005%、大約O. 001%、大約O. 005%、大約O. 01%、大約O. 05%、大約O. 1%、大約O. 5%、大約1%、大約5%,
坐坐寸寸ο在一些實施方式中，將對照物配置為陰性結(jié)合對照，可以與用于固定化分析物分子的捕獲物有類似的形狀和尺寸，然而，對照物可以缺少用于分析物分子的結(jié)合表面(例如，大量捕獲組分)。例如，對照物可包含大量微珠，而用于固定化分析物分子的捕獲物可以包含相同或類似的微珠，并另外包含至少一種包含大量捕獲組分的表面。在一個實施方式中，對照物可包含陽性對照并包括酶組分。前體標(biāo)記試劑可在接觸酶組分時轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑。在一些情況下，酶組分可與用于檢測流體樣品中分析物分子的酶組分(例如，包含在測定的另一種組分中，例如，包含在結(jié)合配體、分析物分子中的酶組分，等等)相同。在這些實施方式中，對照物可與捕獲物相區(qū)分，這樣可以分析具有陽性信號的反應(yīng)容器以確定所述反應(yīng)容器是否包含對照物(例如，具有第一種可檢測信號)或捕獲物(例如，具有可區(qū)分于第一種可檢測信號的第二種可檢測信號)。在其他情況下，酶組分可以與用于檢測流體樣品中分析物分子的酶組分(例如，包含在測定的另一種組分中，例如，包含在結(jié)合配體、分析物分子中的酶組分，等等)不同。在此實施方式中，對照物可以可區(qū)分于捕獲物，也可以不可區(qū)分于捕獲物?？上蚍磻?yīng)容器中提供第一種類型和第二種類型的前體標(biāo)記試劑，且第一種類型的前體標(biāo)記試劑可在接觸連接于對照微珠的酶組分時轉(zhuǎn)化為第一種類型的標(biāo)記試劑，而第二種類型的前體標(biāo)記試劑可在接觸連接于另一種酶組分(例如，包含在結(jié)合配體/分析物分子/等等之內(nèi))時轉(zhuǎn)化為第二種類型的標(biāo)記試劑。含有第一種類 型的標(biāo)記試劑的反應(yīng)容器對應(yīng)含有對照物的反應(yīng)容器而含有第二種類型的標(biāo)記試劑的反應(yīng)容器對應(yīng)含有結(jié)合配體/分析物分子/等等的反應(yīng)容器?？捎^察含有對照微珠的大量位置以分析例如酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)的效率。多種方法可用于制備對照物，例如，本發(fā)明描述的與用于捕獲物(例如包含大量捕獲組分的微珠)的類似方法。在一些情況下，一些對照物可包含酶組分。對照物可以這樣的方式制備，使得I)大多數(shù)對照物各自包含至少一種(例如，一種、兩種、三種、四種，等等)酶組分或2) —些對照物包含單一的酶組分，而其余的對照物不包含任何酶組分。在第一種情況下，對照物的形成過程中，溶液中提供的酶組分相對對照物的比率超過I: I、超過大約2:1、超過大約5:1、超過大約10:1等等。在這些情況下，可以預(yù)期，在將對照物在基底上分區(qū)之后，每個包含對照物的位置會在接觸到前體標(biāo)記試劑時給出陽性信號。在第二種情況下，對照物的形成過程中，溶液中提供的酶組分相對對照物的比率低于1:5、低于大約1:10、低于大約1:20、低于大約1:50等等。在這些情況下，可以預(yù)期，包含對照物并給出陽性信號的位置數(shù)量相對包含對照物而不給出陽性信號的位置數(shù)量的比率近似地類似于對照物形成過程中酶組分相對對照物的比率，且/或可遵循泊松分布。如上文所描述的，在分析物捕獲步驟中大量分析物分子固定化于大量捕獲物之后，可將至少一部分的捕獲物空間劃分入例如在基底上的大量位置。例如，進行空間劃分的捕獲物部分中的各捕獲物可定位于且/或連接在一個位置(例如，在基底表面和/或體內(nèi)的點、區(qū)域、孔等等)中，這些位置在空間上與其他各捕獲物所定位的位置相區(qū)分，這樣捕獲物和位置都可通過用于指認這些位置的分析檢測系統(tǒng)單個地進行解析。作為一個實例，捕獲物的一部分中每個都可空間劃分入基底上的反應(yīng)容器陣列，這樣在統(tǒng)計學(xué)上只有零個或一個捕獲物定位在至少一些反應(yīng)容器中，在特定情況下，在幾乎每個反應(yīng)容器中。每個位置相對于其他位置可單獨地被指認。此外，這些位置的排列方式可以使得大量位置基本上同時被指認，如本文所描述的，而同時仍然保留解析單個位置和捕獲物的能力。應(yīng)當(dāng)理解的是，盡管本文多數(shù)討論都聚焦于含有單個捕獲物的位置，然而這決不是限制性的，在一些實施方式中，在單一位置可以含有超過一個捕獲物。在這些實施方式中，捕獲物對分析物分子的比率可為使得大量捕獲物空間劃分入大量位置之后，統(tǒng)計學(xué)顯著比例的位置不含分析物分子，且統(tǒng)計學(xué)顯著比例的位置含有至少一個分析物分子。也就是說，盡管單個位置可以含有大量捕獲物，然而在一些情況下，這些捕獲物都不連接任何分析物分子，而且所指認的位置中只有單一的捕獲物連接于至少一個分析物分子。如上所述，在一些實施方式中，大量位置包含基底上的大量反應(yīng)容器/孔。在特定實施方式中，反應(yīng)容器可配置為只接收并含有單個用于分析物捕獲的捕獲物。在一些情況下，所述大量捕獲物可通過大量這種(例如，配置為基底上的反應(yīng)容器陣列的)反應(yīng)容器而分區(qū)，這有助于通過在下文和實施例中有進一步詳細討論的方法對流體樣品中分析物分子濃度的度量的確定。在本發(fā)明的一些實施方式中，可在例如弓I入用于分析物捕獲的捕獲物之后密封所述大量反應(yīng)容器，例如通過將第二種基底和密封組分進行匹配。反應(yīng)容器的密封可以使得各個反應(yīng)容器的內(nèi)容物不能在余下的測定中脫離反應(yīng)容器。在一些情況下，可在在加入捕獲物(可選地，加入前體標(biāo)記試劑)以幫助檢測分析物分子后密封反應(yīng)容器。對于采用了前體標(biāo)記試劑的實施方式，通過將內(nèi)容物密封在一些或每個反應(yīng)容器中，產(chǎn)生可檢測的標(biāo)記試劑的反應(yīng)能在密封的反應(yīng)容器中進行，由此產(chǎn)生可檢測量的標(biāo)記試劑，其留存在反應(yīng)容器中用于檢測的目的。包含大量反應(yīng)容器的大量位置可使用多種方法和/或材料形成。在一些情況下，所述大量反應(yīng)容器以小窩的陣列形式形成于第一個表面上。然而，在其他情況下，大量反應(yīng)容器可通過將包含大量小窩的密封組分與基底相匹配而形成，這些基底可以具有平滑表面 或其包括的小窩與密封組分上的那些相并列。這些設(shè)備組分，例如基底或密封組分中的任何一項都可由順應(yīng)材料制造，如彈性聚合物材料，以幫助密封。這些表面可以是(或被制造成)疏水的或含有疏水區(qū)域，以使水溶液樣品從微孔中發(fā)生最少的滲漏。在一些情況下，密封組分可以能夠接觸到微孔陣列的外部表面(例如，如下文更詳細描述的光纖束包層)，這樣各個反應(yīng)容器都被密封或分離，使得各個反應(yīng)容器的內(nèi)容物不能脫離反應(yīng)容器。根據(jù)一個實施方式，密封組分可以為硅膠彈性體墊，其可以在對整個基底施加基本上一致的壓力時被置于微孔陣列上。在一些情況下，可在加入用于分析物捕獲的大量捕獲物以及可選地加入能用于幫助檢測分析物分子的任何前體標(biāo)記試劑分子之后密封反應(yīng)容器。圖6中描繪了基底上/中的含有測定溶液的大量反應(yīng)容器的形成。圖6，板塊(A)顯示了包含大量微孔139的表面，其已經(jīng)接觸了測定溶液141 (例如，在進行分析物捕獲步驟和任何洗滌步驟后的含有用于分析物捕獲的捕獲物和/或?qū)φ瘴锏娜芤?，以及密封組分143。此實施例中的密封組分143包含基本上平的底表面。將基底139和密封組分143匹配形成了大量的密封反應(yīng)容器145?？尚揎椃磻?yīng)容器148之間的區(qū)域以助于在反應(yīng)容器之間形成緊密的密封。圖6板塊(B)中顯不了第二個實施方式，其中密封組分162包含大量微孔163,其與基本上平的表面158相匹配，后者已經(jīng)接觸了測定溶液162，由此形成了大量的反應(yīng)容器164。在第三個實施方式中，如圖6板塊(C)所75,基底表面166包含大量微孔167,其與密封組分170匹配，后者也含有大量微孔171。在此實施方式中，基底中的微孔和密封組分中的微孔基本上是并列的，這樣所形成的每個反應(yīng)容器172都包含來自密封組分的微孔的一部分以及來自基底的微孔的一部分。在圖6板塊(D)中，微孔不是并列的，這樣每個反應(yīng)容器包含來自密封組分173的微孔，或來自基底175的微孔。密封組分可以與基底是基本上相同的尺寸，或可以為不同尺寸。在一些情況下，密封組分與基底是近似相同的尺寸，并與整個基底表面基本上匹配。在其他情況下，如圖6板塊(E)中闡明的，密封組分176比基底174小，且密封組分只與基底的178部分進行匹配。在另一個實施方式中，如圖6板塊(F)中闡明的，密封組分182比基底180大，且只有密封組分的184部分與基底180進行匹配。在一些實施方式中，反應(yīng)容器可全部具有近似相同的體積。在其他實施方式中，反應(yīng)容器可具有不同的體積?？蓪γ總€單個的反應(yīng)容器的體積進行選擇，使之適合于幫助任何特定的測定操作流程。例如，在一組實施方式中，其中需要限制每個管道中用于分析物捕獲的捕獲物數(shù)量為小的數(shù)目，反應(yīng)容器的體積可以為從阿升到更小至納升或更大的范圍，這取決于捕獲物的本質(zhì)、檢測技術(shù)和所采用的設(shè)備、基底上的孔的數(shù)量和密度以及加到含 有孔的基底上的液體中捕獲物的預(yù)期濃度。在一個實施方式中，可選擇反應(yīng)容器的尺寸以使只有單一的用于分析物捕獲的捕獲物能完全包含在反應(yīng)容器之內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的一個實施方式，反應(yīng)容器可具有的體積為大約I飛升-大約I皮升、大約I飛升-大約100飛升、大約10阿升-大約100皮升、大約I皮升-大約100皮升、大約I飛升-大約I皮升、或大約30飛升-大約60飛升。在一些情況下，反應(yīng)容器的體積低于大約I皮升、低于大約500飛升、低于大約100飛升、低于大約50飛升、或低于大約I飛升。在一些情況下，反應(yīng)容器的體積為大約10飛升、大約20飛升、大約30飛升、大約40飛升、大約50飛升、大約60飛升、大約70飛升、大約80飛升、大約90飛升、或大約100飛升。在其中大量用于分析物捕獲的捕獲物包含大量微珠且大量位置包含了大量具有幾乎為圓柱體的形狀的反應(yīng)容器的實施方式中，反應(yīng)容器的尺寸可基于微珠的尺寸，并可被設(shè)計為確保含有超過一個單一的微珠的孔的數(shù)量得到最小化。在一些情況下，所允許的最大孔徑可根據(jù)公式3計算 2*微珠半徑+W (3*微珠半徑2-孔深*+ 2·孔深*微珠半徑)(公式3)且/或所允許的最大孔深可根據(jù)公式4計算半徑+/ (4*微珠半徑*孔直徑2-孔直徑2)^ (公式4)確保單個微珠可包含在孔內(nèi)的最小許可孔深和最小許可孔徑在大多數(shù)實施方式中不會小于微珠的平均直徑。具有合適尺寸(允許不超過一個單一微珠存在于反應(yīng)容器中)的反應(yīng)容器具有更好的解析單個微珠的能力，使得使用下文和實施例中有更詳細描述的方式確定流體樣品中分析物分子濃度的度量上有更高的精確度。例如，如果反應(yīng)容器太大，超過一個微珠可以填進反應(yīng)容器，這導(dǎo)致含有多個分析物分子的反應(yīng)容器數(shù)量增加，而可以對使用基于單一分子檢測(見下文)的算術(shù)/統(tǒng)計模型確定的濃度引入不精確性。然而，在一些情況下，可以需要超過一個微珠填入反應(yīng)容器。在另一方面，如果反應(yīng)容器太小，微珠可以不能填入反應(yīng)容器，這樣阻止了反應(yīng)容器的適當(dāng)密封(例如，在反應(yīng)容器被密封的實施方式中)且/或可以導(dǎo)致難以指認個體位置(例如，在其中產(chǎn)生標(biāo)記試劑以檢測的實施方式中，標(biāo)記試劑可以擴散出其產(chǎn)生的反應(yīng)容器)。在這些情況下，可以有假陽性(例如，不含有分析物分子的反應(yīng)容器可以基于擴散出其產(chǎn)生位置的標(biāo)記試劑而確定為含有分析物分子)，這可導(dǎo)致對流體樣品中分析物分子濃度測量的確定不準(zhǔn)確。在一些實施方式中，反應(yīng)容器的平均深度為微珠平均直徑的大約I. O-大約I. 7倍、大約I. O倍-大約I. 5倍、大約I. O倍-大約I. 3倍、或大約I. I倍-大約I. 4倍。在一些實施方式中，反應(yīng)容器的平均直徑為微珠平均直徑的大約I. O倍-大約I. 9倍、大約I. 2倍-大約I. 7倍、大約I. O倍-大約I. 5倍、或大約I. 3倍-大約I. 6倍。在一個具體實施方式
中，反應(yīng)容器的平均深度為微珠平均直徑的大約I. O倍-大約I. 5倍，而反應(yīng)容器的平均直徑為微珠平均直徑的大約I. O倍-大約I. 9倍。測定中所采用的位置的總數(shù)和/或位置的密度(例如，陣列中反應(yīng)容器的數(shù)量/密度)可取決于陣列的組成和用途。例如，所采用的反應(yīng)容器數(shù)可取決于所采用的捕獲物數(shù)、測定的估計濃度范圍、檢測方法、捕獲物尺寸、檢測實體的類型(例如，溶液中的游離標(biāo)記是 設(shè)計、沉淀標(biāo)記試劑，等等)?？赏ㄟ^使用多種技術(shù)和材料制造含有大約20-數(shù)十億的反應(yīng)容器(或總數(shù)的反應(yīng)容器)的陣列。在陣列中增加反應(yīng)容器數(shù)量可用于增加測定的動態(tài)范圍，或允許多種樣品或多種類型的分析物分子進行平行測定。對于每個要分析的樣品陣列可包含一千到一百萬個反應(yīng)容器。在一些情況下，陣列包含超過一百萬個反應(yīng)容器。在一些實施方式中，陣列包含大約1,000-大約50，000、大約1,000-大約1，000，000、大約1,000-大約 10，000、大約 10，000-大約 100，000、大約 100，000-大約 I, 000，000、大約 100，000-大約500，000、大約 I, 000-大約 100，000、大約 50，000-大約 100，000、大約 20，000-大約 80，000、大約30，000-大約70，000、大約40，000-大約60，000等個反應(yīng)容器。在一些實施方式中，陣列包含大約10，000、大約20，000、大約50，000、大約100，000、大約150，000、大約200，000、大約300，000、大約500，000、大約1，000, 000、或更多的反應(yīng)容器。可將反應(yīng)容器的陣列排列在基本上平面的表面或排列為非平面的三維排列。反應(yīng)容器可以規(guī)則形式列陣或隨機分布。在一個具體的實施方式中，陣列為基本上平面的表面上的規(guī)則形式的位點，允許這些位點在X-Y坐標(biāo)平面中被指認。在一些實施方式中，反應(yīng)容器形成于固體材料中。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的，反應(yīng)容器能在其中形成的潛在的合適的材料數(shù)量十分龐大，包括但不限于，玻璃(包括改性和/或功能玻璃)、塑料(包括丙烯酸樹脂、聚苯乙烯以及苯乙烯和其他材料的共聚物、聚丙烯、聚乙烯、聚丁烯、聚氨酯、環(huán)烯烴共聚物(C0C)、環(huán)烯烴聚合物(C0P)、特氟?、?、多糖、尼龍或硝酸纖維素等)、彈性體(如聚(二甲基硅氧烷)和聚氨基甲酸乙酯)、復(fù)合材料、陶瓷、硅或娃基材料(包括娃和改性娃)、碳、金屬、光纖束。一般地，可選擇的基底材料可進行光學(xué)檢測，而不產(chǎn)生顯著的自發(fā)熒光。在特定實施方式中，反應(yīng)容器可形成于柔性材料中?？墒褂枚喾N本領(lǐng)域已知的技術(shù)形成表面(例如，基底或密封組分)上的反應(yīng)容器，包括但不限于，光刻法、沖壓技術(shù)、塑型技術(shù)、蝕刻技術(shù)，諸如此類。如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員清楚的，所使用的技術(shù)可取決于支持材料的組成、形狀以及反應(yīng)容器的尺寸和數(shù)量。在一個具體實施方式
中，是通過在光纖束一端產(chǎn)生微孔并使用平面的順應(yīng)表面作為密封組分而形成反應(yīng)容器陣列。在特定的這些實施方式中，光纖束一端的反應(yīng)容器陣列可按如下方法形成。首先，將微孔陣列蝕刻入拋光光纖束一端。用于形成及蝕刻光纖束的技術(shù)和材料對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知。例如,光纖直徑、纖芯和光纖的包層區(qū)域的存在情況、尺寸和組成，以及蝕刻的深度和特異性可根據(jù)所選擇的蝕刻技術(shù)有變化，以便形成所需要的體積的微孔。在特定實施方式中，蝕刻過程通過優(yōu)先蝕刻光纖束中單個玻璃纖維的材料核心而產(chǎn)生微孔，這樣每個孔都近似并列排在單個纖維上并與臨近的孔通過包層材料分離開。光纖陣列形式的潛在優(yōu)勢為其可產(chǎn)生成千上萬的反應(yīng)容器而不需要復(fù)雜的微細加工步驟，且其能提供同時觀察并光學(xué)指認多個反應(yīng)容器的能力。每個微孔可并列排在光纖束中的一個光纖上，這樣光纖束能將激發(fā)光(發(fā)射光)帶入和出孔，能夠遠程拾取孔的內(nèi)容物。進一步地，光纖陣列可提供同時或非同時激發(fā)臨近管道中分子的能力，不產(chǎn)生纖維之間的信號“串音”。也就是，從一個纖維中傳播的激發(fā)光不會脫離至相鄰纖維中。備選地，大量反應(yīng)容器的等價結(jié)構(gòu)可使用不用光纖束末端作為基底的其他方法和材料制作。例如，陣列可以為用本領(lǐng)域已知技術(shù)產(chǎn)生的點跡的、印刻或光刻制造的基底；見例如 WO 95/25116 ;W095/35505;PCT US 98/09163;美國專利號 5，700，637、5，807，522、5，445，934,6, 406，845和6，482，593。在一些情況下，陣列可以使用塑型，壓花加工，和/或蝕刻技術(shù)制造，這些是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的。 在特定實施方式中，本發(fā)明提供了裝備有機械平臺的系統(tǒng)以將密封組分加至基底上。此平臺可位于系統(tǒng)的一個位置的下方。在所選的反應(yīng)組分已經(jīng)加入反應(yīng)容器陣列后，可將密封組分與陣列進行匹配。例如，可通過機械平臺施加的一致的壓力將密封組分夾心于平坦表面(如顯微鏡玻片)和反應(yīng)容器陣列之間。圖7中闡述了一個非限制性實施方式。密封組分300位于機械平臺302頂部。測定溶液304位于密封組分300的頂部。將機械平臺向上朝陣列306 (例如，光纖陣列)移動，這樣施加一致的壓力。如圖8所示，密封組分300與陣列306形成緊密的密封。在其他例子中，可對密封組分施加不同的壓力以使密封組分和陣列之間形成緊密的密封。如本文更多討論的，所述系統(tǒng)還可以包含另外的組分312，其可用于分析陣列(例如，顯微鏡、計算機，
寸寸7 ο可是用本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的廣泛多種技術(shù)中任意，將用于分析物捕獲的大量捕獲物劃分入大量反應(yīng)容器。在一些情況下，大量反應(yīng)容器可接觸含有大量捕獲物的溶液。在一些情況下，可對溶液和/或捕獲物施加力的作用，由此幫助捕獲物在空間上與液相分離和/或捕獲物在管道中的沉積。例如，在含有反應(yīng)容器的基底中加入含有捕獲物的測定溶液后，可對基底和溶液進行離心以幫助捕獲物沉積到反應(yīng)容器中。在其中捕獲物(例如，微珠)為磁性的實施方式中，可使用磁鐵以幫助將捕獲物包含到反應(yīng)容器內(nèi)。在一些情況下，當(dāng)大量的反應(yīng)容器形成于光纖束(或另外的平面表面)末端時，可將一種材料(例如，管子)放置在包含大量反應(yīng)容器的陣列表面邊緣的周圍，以形成容器，將溶液維持在相應(yīng)位置，而捕獲物沉淀于反應(yīng)容器中或被放置于反應(yīng)容器中(例如，在離心時)。在將捕獲物置于至少一些反應(yīng)容器后，可移除周圍的材料，并可洗滌和/或擦拭陣列的表面以移除多余的溶液/捕獲物。在一些實施方式中，基底不包括形成大量反應(yīng)容器的孔或反應(yīng)容器，而是使用/提供了其他方法以對用于分析物捕獲的大量捕獲物進行空間劃分。在一些情況下，可采用壓花的基本上平面的表面，其中壓花區(qū)域形成大量位置。在一些情況下，壓花區(qū)域可包含基本上親水的表面，其基本上由基本疏水的表面所包圍。大量捕獲物(例如，微珠)可基本上由基本親水的基質(zhì)包圍(例如，包含有水)，而這些微珠可接觸壓花表面使得微珠連接于壓花區(qū)域(例如，位置)，由此將大量微珠進行了空間劃分。例如，在一個這樣的實施方式中，基底可以為(或包括)凝膠或其他能夠提供足以阻礙質(zhì)傳的材料(例如，對流和/或擴散屏障)以防止在指認位置并完成測定所需的時間框之內(nèi)用于分析物捕獲的捕獲物和/或前體標(biāo)記試劑和/或標(biāo)記試劑從材料上(中)的一個位置移動到另一個位置并引起含有不同捕獲物的空間位置之間的干擾或串音。例如，在一個實施方式中，通過將捕獲物分散在水合膠材料上和/或之中以對大量捕獲物進行空間劃分。在一些情況下，前體標(biāo)記試劑可以已經(jīng)存在于水合膠中，因此有助于形成局部濃度的標(biāo)記試劑(例如，在接觸攜帶有酶組分的結(jié)合配體或分析物分子時)。如另一個實施方式，捕獲物可限定在一個或多個毛細管中。在一些情況下，大量捕獲物可吸收或定位于多孔或多纖的基底上，例如，濾紙。在一些實施方式中，捕獲物可空間劃分于一致的表面上(例如，平面的表面)，且可使用會轉(zhuǎn)化成基本上不可溶或沉淀的標(biāo)記試劑(其會定位于對應(yīng)的捕獲物定位處，或在其附近)的前體標(biāo)記試劑檢測捕獲物。這些基本上不可溶或沉淀的標(biāo)記試劑的用途在本文中有描述。物品和試劑盒 在本發(fā)明的一些實施方式中，提供了用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的度量的物品或試劑盒。所述物品和試劑盒可包括大量微珠以及包含大量反應(yīng)容器的基底。反應(yīng)容器的構(gòu)造可以接收并包含捕獲物。在特定實施方式中的大量微珠的平均直徑為大約O. I微米-大約100微米，反應(yīng)容器的尺寸可選擇為使得只有零個或一個微珠能夠包含在單個反應(yīng)容器內(nèi)。在一些情況下，反應(yīng)容器的平均深度為微珠平均直徑的大約1.0倍-大約I. 5倍，且反應(yīng)容器的平均直徑為微珠平均直徑的大約I. O倍-大約I. 9倍。在特定實施方式中，微珠的平均直徑為大約I微米-大約10微米、大約I微米-大約5微米或本文描述的任何尺寸范圍。所提供的大量微珠可以具有多種特性和參數(shù)，如本文所描述的。例如，微珠可以為磁性的。所述大量微珠可包含對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面(例如，大量捕獲組分)。如本文所描述的，所述大量反應(yīng)容器可在任何合適的基底中形成。在一個具體實施方式
中，所述大量反應(yīng)容器形成于光纖束的末端。所述光纖束可根據(jù)本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的方法和/或根據(jù)本發(fā)明的方法而制備(例如蝕刻)。在其他實施方式中，所述大量反應(yīng)容器形成于平板或類似的基本上平面的材料中(例如，使用印刻或其他已知技術(shù))。示例性的合適的材料在本文有描述。所述大量反應(yīng)容器的平均深度為微珠平均直徑的大約I. O-大約I. 5倍、或大約
I.I-大約I. 3倍，或本文描述的任何范圍。所述大量反應(yīng)容器的平均直徑可為微珠平均直徑的大約I. O倍-大約I. 9倍、或大約I. 3倍-大約I. 8倍，或本文描述的任何范圍。所述大量反應(yīng)容器的平均深度/或平均直徑可選擇為使得不超過一個微珠能夠包含在一個反應(yīng)容器內(nèi)。用于計算幫助單個微珠裝入的最大深度和最大直徑的方法在本文有所描述。所述大量反應(yīng)容器的平均體積可以為大約10阿升-大約100皮升、大約I飛升-大約I皮升、或任何所需的范圍。基底可以包含任何數(shù)量的反應(yīng)容器，例如，大約1，000-大約1，000, 000個反應(yīng)容器、大約10，000-大約100，000個反應(yīng)容器、或大約100，000-大約300，000個反應(yīng)容器，或任何其他所需要的范圍。
所述物品和試劑盒可包含任何數(shù)量的其他組分，其中有些在本文有詳細描述。在一些情況下，所述物品或試劑盒可進一步包含構(gòu)造為密封大量反應(yīng)容器的密封組分。在特定實施方式中，如圖7A-7F所示，所述大量反應(yīng)容器可在至少密封組分的一部分和第二種基底的一部分進行匹配時形成，其在本文有更詳細的討論。如另一個例子，試劑盒還可提供用于施行如本文所描述的測定法的溶液。所述溶液的非限制性實例包括含有一種或多種類型的結(jié)合配體劑前體標(biāo)記試劑的溶液。在一些情況下，所述物品或試劑盒可包含至少一種類型的對照微珠。在一些實施方式中，試劑盒可選地可包括指導(dǎo)所述大量微珠和大量反應(yīng)容器(以及任何其他所提供的組分)的使用的說明書。也就是，試劑盒可包括對微珠和反應(yīng)容器的用途的描述，例如，與一個系統(tǒng)配套使用以確定流體樣品中分析物分子(或顆粒)濃度的量度。如本文所使用的，“說明書”可限定說明和/或介紹的組分，一般涉及本發(fā)明包裝上或與之伴隨的書面說明書。說明書還可包括任何口頭或電子說明書，其提供形式能以任何使試劑盒的用戶能清楚地認識到說明書與所述試劑盒的相關(guān)性。此外，如本文所描述的，取決于具體的應(yīng)用，所述試劑盒可包括其他組分。如本文所描述的，“推廣的”包括本發(fā)明相關(guān)的所有商業(yè)手段，包括教育手段、醫(yī)院和其他臨床說明、科學(xué)探究，藥物發(fā)現(xiàn)或開發(fā)，學(xué)術(shù)研 究，制藥行業(yè)的活動，包括藥品銷售，以及任何廣告或者其他宣傳活動，包括書面，口頭和任何形式的電子交流。捕獲組分在本發(fā)明的一些實施方式中，捕獲物表面可提供對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面。在一些實施方式中，結(jié)合表面可包括至少一種類型的捕獲組分。一般地，捕獲組分使得分子、顆粒或復(fù)合物附著于固體支持物上(即，捕獲物的表面)以對所述分子、顆?；驈?fù)合物進行固定化、檢測、定量和/或其他分析。在一些情況下本發(fā)明使用的捕獲組分是用于將分析物分子固定化于捕獲物(例如，微珠)。如本領(lǐng)域技術(shù)人員清楚的，捕獲物組分的組成可取決于分析物分子的組成。用于多種靶標(biāo)分子的捕獲組分是已知的，或可以使用已知技術(shù)容易地發(fā)現(xiàn)或開發(fā)。例如，當(dāng)靶標(biāo)分子是蛋白質(zhì)時，捕獲組分可包含蛋白質(zhì)，尤其是抗體或其片段(例如，抗原連接片段(Fab)、Fab’片段、胃蛋白酶片段、F (ab’)2片段、全長的多克隆或單克隆抗體、抗體樣片段等)、其他蛋白質(zhì)如受體蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)A、蛋白質(zhì)C等或小分子。在一些情況下，蛋白質(zhì)的捕獲組分包含肽。例如，當(dāng)靶標(biāo)分子為酶時，合適的捕獲組分可包括酶底物和/或酶抑制齊U。在一些情況下，當(dāng)靶標(biāo)分析物為磷酸化的物類時，捕獲組分可包含磷酸結(jié)合試劑。例如，磷酸結(jié)合試劑可包含金屬離子親和基質(zhì)，如在美國專利號7，070, 921和美國專利申請?zhí)?0060121544中的那些。此外，當(dāng)靶標(biāo)分子為單鏈核酸時，捕獲組分可以為互補的合適。類似地，靶標(biāo)分子可以為核酸結(jié)合蛋白質(zhì)，且捕獲組分可以為單鏈或雙鏈核酸；備選地，當(dāng)靶標(biāo)分子為單鏈或雙鏈核酸時，捕獲組分可以為核酸連接蛋白質(zhì)。備選地，如在美國專利5，270，163,5, 475，096,5, 567，588,5, 595，877,5, 637，459,5, 683，867,5, 705，337 及相關(guān)專利中有總體描述的，可開發(fā)核酸“適體”以捕獲幾乎所有靶標(biāo)分子。還例如，當(dāng)靶標(biāo)分子為碳水化合物時，潛在的合適的捕獲組分包括例如抗體、凝集素和選擇素。如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所清楚的，任何能特異連接于目的靶標(biāo)分子的分子可以被用作捕獲組分。對特定實施方式，合適的靶標(biāo)分析物分子/捕獲組分對可包括但不限于，抗體/抗原、受體/配體、蛋白質(zhì)/核酸、核酸/核酸、酶/底物和/或抑制劑、碳水化合物(包括糖蛋白和糖脂)/凝集素和/或選擇素、蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)/小分子、小分子/小分子等。根據(jù)一個實施方式，捕獲組分為已知能多聚化的細胞表面受體的一部分(尤其是細胞外部分)，如生長激素受體，葡萄糖轉(zhuǎn)運體(特別是GLUT4受體)和T-細胞受體，而靶標(biāo)分析物分子為一個或多個受體靶向的配體。在一個具實施方式中，捕獲組分可通過連接附著于捕獲物表面，這可包含任何幫助捕獲組分附著于表面的部分、結(jié)合表面和/或捕獲組分的功能化作用或改性。捕獲組分和表面之間的連接可包含一種或多種化學(xué)或物理鍵(例如，通過范德華力的非特異性附著，氫鍵，靜電相互作用，疏水/親水相互作用，等等)和/或提供這些鍵的化學(xué)連接子。在特定實施方式中，捕獲組分包含捕獲擴展組分。在這些實施方式中，捕獲組分包含連接于分析物分子的第一個部分及可用于附著于結(jié)合表面的第二個部分。在特定實施方式中，捕獲物表面還可包含保護性或鈍化層，其能夠減少或最小化測定中非捕獲組分(例如，分析物分子、結(jié)合配體)對結(jié)合表面的非特異性附著，后者可引起檢測中的假陽性信號或?qū)е滦盘杹G失?？捎迷谔囟▽嵤┓绞街幸孕纬赦g化層的材料的實例包括但不限于排斥蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合的天然存在的聚合物，如聚(乙二醇)；具有此種特性的天然發(fā)生蛋白質(zhì)，如血清白蛋白和酪蛋白；表面活性劑，如兩性離子表面活性劑，如磺基甜菜堿，天然存在的長鏈脂質(zhì)；以及核酸，如鮭精DNA。將捕獲組分附著于捕獲物表面的方法取決于所采用的連接的類型，并可以通過多種本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的合適的偶聯(lián)化學(xué)/技術(shù)而完成。所選擇的附著的具體方式將取決于捕獲物表面的材料特征及捕獲組分的性質(zhì)。在特定實施方式中，可通過使用二者上的反應(yīng)性功能基團將捕獲組分附著于捕獲物表面。根據(jù)一個實施方式，功能基團為化學(xué)官能團。也就是，結(jié)合表面可進行衍生化，使得結(jié)合表面存在官能團，能夠與捕獲組分上官能團反應(yīng)并形成附著。用于附著的官能團的實例包括但不限于，氨基，羧基，環(huán)氧基，馬來酰亞胺基團氧代基和硫醇基?？芍苯拥鼗蛲ㄟ^使用連接子而附加官能團，其組合有時在本文中稱為“交聯(lián)劑”。交聯(lián)劑在本領(lǐng)域已知；例如已知同或異雙功能交聯(lián)劑(例如，見1994PierceChemical Company catalog, technical section on crosslinkers, pages 155-200、或 “Bioconjugate Techniques，，by Greg T. Hermanson, Academic Press, 1996)。交聯(lián)劑的非限制性實例包括烷基基團(包括被取代的烷基基團和含有雜原子部分的烷基基團)、酯、酰胺、胺、環(huán)氧基和乙烯二醇和衍生物。交聯(lián)劑還可以包括砜基，其形成磺酰胺。根據(jù)一個實施方式，官能團為光激活的官能團。即，所述官能團可由光激活而將捕獲組分附著于捕獲物表面。一個實例為PhotoLink 技術(shù),可獲自SurModics, Inc. in EdenPrairie, MN。在一些情況下，捕獲物可包含鏈霉親和素包被的表面，且捕獲組分可以生物素化。捕獲組分接觸到鏈霉親和素包被表面時，由于生物素組分和鏈霉親和素之間的相互作用，可產(chǎn)生捕獲組分與表面的連接。在特定實施方式中，不需要共價修飾捕獲物的結(jié)合表面即可影響捕獲組分對結(jié)合表面的附著。例如，可使用具有與捕獲組分發(fā)生反應(yīng)的官能團以及對結(jié)合表面具有連接親和力的基團的連接子也附著官能團將附著功能物添加至結(jié)合表面。在特定實施方式中，連接子包含能夠結(jié)合或粘附于結(jié)合表面的蛋白質(zhì)；例如，在一個這樣的實施方式中，連接子為血清白蛋白，其表面有游離的氨基基團。然后可加入第二種連接子(交聯(lián)劑)以將白蛋白的氨基基團附著于捕獲組分(例如，附著于羧基基團)。根據(jù)其中使用化學(xué)交聯(lián)劑以將捕獲組分附著于捕獲物的一個實施方式，可使用通過捕獲組分將分析物分子捕獲于捕獲物的結(jié)合表面分析物分子，其中捕獲組分是以下方式附著于結(jié)合表面的。首先，結(jié)合表面衍生有官能團，如氨基基團。其次，將交聯(lián)劑和捕獲組分接觸結(jié)合表面以使交聯(lián)劑的一端附著于氨基基團而捕獲組分附著于交聯(lián)劑的另一端。以這種方式，可附著包含蛋白質(zhì)、凝集素、核酸、有機小分子、碳水化合物的捕獲組分。一個實施方式使用了蛋白質(zhì)性質(zhì)的捕獲組分。如本領(lǐng)域已知的，可使用任何數(shù)量的技術(shù)將蛋白質(zhì)性質(zhì)捕獲組分附著于多種固態(tài)表面。“蛋白質(zhì)”或“蛋白質(zhì)性質(zhì)”在此上下文中包括蛋白質(zhì)、多肽、肽，包括例如，酶和抗體。已知有多種技術(shù)可將反應(yīng)性部分加至蛋白質(zhì)，例如，美國專利號5，620，850中概述的。蛋白質(zhì)對各種表面的附著也是已知的，例如見Heller, Acc. Chem. Res. 23:128(1990)以及許多其他類似的參考文獻。
在一些實施方式中，捕獲組分(或結(jié)合配體)可包含F(xiàn)ab’片段。與完全抗體相反，使用Fab’片段可幫助減少捕獲組分和結(jié)合配體之間的非特異性連接。在一些情況下，可(例如，蛋白裂解性地)移除捕獲組分(或結(jié)合配體)的Fe區(qū)。在一些情況下，可使用酶移除Fe區(qū)域(例如，產(chǎn)生？(&13’)2片段的胃蛋白酶，以及產(chǎn)生Fab片段的木瓜蛋白酶)。在一些例子中，可使用胺將捕獲組分附著于結(jié)合表面，或可用生物素對其修飾(例如，使用NHS-生物素)以促進對親和素或鏈霉親和素包被的捕獲物的結(jié)合。在一些情況下，？(&13’)2片段可經(jīng)過化學(xué)還原處理(例如，通過接觸2-巰基乙胺)以形成兩個具有巰基的Fab’片段。這些具有巰基的片段然后可通過與邁克爾受體如馬來酰亞胺反應(yīng)而附著。例如，然后可以用反應(yīng)劑(如，馬來酰亞胺-生物素)處理Fab’片段以附著至少一個生物素部分(即，生物素化的部分)以幫助對如上文描述的鏈霉親和素包被表面的附著。特定實施方式使用核酸作為捕獲組分，例如在分析物分子為核酸或核酸結(jié)合蛋白質(zhì)，或當(dāng)需要捕獲組分用作結(jié)合蛋白質(zhì)的適體時，這些在本領(lǐng)域已熟知。根據(jù)一個實施方式，捕獲物的每個結(jié)合表面都包含大量捕獲組分。在一些情況下，大量捕獲組分可如“草坪” 一樣隨機分布于結(jié)合表面。備選地，捕獲組分可被空間劃分入不同區(qū)域并以任何所需的方式分布。在特定實施方式中，捕獲組分和分析物分子之間的結(jié)合是特異性的，例如，當(dāng)捕獲組分和分析物分子為結(jié)合對的互補部分時。在特定的這種實施方式中，捕獲組分與分析物分子的結(jié)合既是特異的，也是直接的。通過“特異性結(jié)合”或“結(jié)合特異性”，指的是捕獲組分以足以區(qū)分分析物分子和測試樣品中其他組分或污染物的特異性結(jié)合于分析物分子。例如，根據(jù)一個實施方式，捕獲組分可以為特異性結(jié)合于分析物分子的一些部分的抗體(如抗原)。根據(jù)一個實施方式，抗體可以為任何能夠特異性結(jié)合目的分析物分子的抗體。例如，合適的抗體包括但不限于，單克隆抗體、雙特異性抗體、小分子抗體、結(jié)構(gòu)域抗體、合成抗體(有時稱為抗體模擬物)、嵌合抗體、人源化抗體、抗體綴合物(有時也稱為“抗體綴合物”)及各自的片段。作為另一個例子，分析物分子可以為抗體而捕獲組分可以為抗原。根據(jù)一個其中分析物顆粒為生物學(xué)細胞(例如，哺乳動物、鳥類、爬蟲類、其他脊椎動物、昆蟲、酵母、細菌、細胞等)的實施方式，捕獲組分可以為對細胞表面抗原具有特異性親和力的配體(如，細胞表面受體)。在一個實施方式中，捕獲組分為粘附分子受體或其部分，其對表達于靶標(biāo)細胞類型的細胞表面的細胞粘附分子具有連接特異性。在使用時，粘附分子受體結(jié)合靶標(biāo)細胞細胞外表面上的粘附分子，由此固定化或捕獲細胞。在其中分析顆粒為細胞的實施方式中，捕獲組分為纖連蛋白，其對例如包含神經(jīng)細胞的分析物顆粒具有特異性。在一些實施方式中，如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所清楚的，可以使用其對分析物分子的連接并非高度特異的捕獲組分來檢測分析物分子。例如，這些系統(tǒng)/方法可使用不同的捕獲組分如一組不同的結(jié)合配體，且對任何具體分析物分子的檢測是通過結(jié)合于此組結(jié)合配體的“簽名”而確定的，這類似于“電子鼻”的工作方式。這尤其可用于檢測特定的小分子分析物。在一些實施方式中，分析物分子和捕獲組分之間的親和力應(yīng)當(dāng)足以在測定條件下，包括在移除非特異性連接的分子或顆粒的洗滌步驟中都保持連接狀態(tài)。在一些情況下，例如在檢測特定生物分子時，分析物分子對其互補捕獲組分的結(jié)合常數(shù)為至少大約IO4-大約IO6M'至少大約IO5-大約IO9M'至少大約IO7-大約IO9M'超過大約ΚΛΤ1等等。例如，IgG抗體對其抗原的一般親和力在IO5-IOkT1的范圍內(nèi)。生物素對鏈霉親和素的親和力為IO15M'
在特定實施方式中，所選擇的捕獲組分能夠結(jié)合于對應(yīng)的連接或附著于分析物分子的結(jié)合伴侶。例如，根據(jù)一個實施方式的捕獲組分是如上所述的化學(xué)交聯(lián)劑，能普遍結(jié)合蛋白質(zhì)。根據(jù)一個實施方式，流體樣品中的每個蛋白質(zhì)分子都包含附著于這樣的化學(xué)交聯(lián)劑的分析物分子。在另一個實施例中，捕獲組分包含鏈霉親和素，其以高親和力附著于生物素，這樣，其捕獲任何生物素附著的分析物分子。備選地，捕獲組分可以為生物素，而鏈霉親和素可附著或連接于分析物分子以使分析物分子能被生物素捕獲。根據(jù)一個實施方式，可以下列方式用捕獲組分對捕獲物的結(jié)合表面進行功能化。首先，制備捕獲物的表面用于捕獲組分的附著，通過對其改性以形成或直接結(jié)合捕獲組分，或可將連接子加至捕獲物的結(jié)合表面以使捕獲組分經(jīng)由連接子附著于捕獲物的結(jié)合表面。在一個實施方式中，捕獲物的結(jié)合表面衍生出一個如上文所述的化學(xué)功能體。其次，可加入捕獲組分，其連接或固定化于所述化學(xué)功能體。示例性靶標(biāo)分析物如本領(lǐng)域人員所清楚的，可使用本發(fā)明的方法和系統(tǒng)檢測(并可選地定量)大量分析物分子和顆粒；基本上，任何能夠(例如，通過包含大量捕獲組分的結(jié)合表面)固定化于捕獲物的分析物分子可以使用本發(fā)明而研究?？砂治鑫锓肿拥奶囟ǖ目梢猿蔀槟繕?biāo)的更特異的靶標(biāo)在下文有提及。下文列出的是示例性非限制性的實例。在一些實施方式中，分析物分子可以為酶。酶的非限制性實例包括，氧化還原酶、轉(zhuǎn)移酶、激酶、水解酶、裂解酶、異構(gòu)酶、連接酶及其類似物。其他酶的實例包括但不限于，聚合酶、組織蛋白酶、鈣蛋白酶、氨基轉(zhuǎn)移酶如AST和ALT、蛋白酶如半胱天冬酶、核苷酸環(huán)化酶、轉(zhuǎn)移酶、脂肪酶、心臟病相關(guān)的酶等。當(dāng)使用本發(fā)明的系統(tǒng)/方法來檢測是否存在病毒或細菌劑時，適當(dāng)?shù)陌袠?biāo)酶包括病毒或細菌的聚合酶和其他這類酶，包括病毒或細菌蛋白酶，或諸如此類。在其他實施方式中，分析物分子可包含酶組分。例如，分析物顆粒可以為具有存在于其細胞外表面的酶或酶組分的細胞。備選地，分析物顆粒為表面不具有酶組分的細胞。這樣的細胞一般是通過下文描述的間接測定法鑒別的。酶組分的非限制性實例為辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶和堿性磷酸酶。在其他實施方式中，分析物分子可以為生物分子。生物分子的非限制性實例包括激素、抗體、細胞因子、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、碳水化合物、脂質(zhì)細胞膜抗原和受體(神經(jīng)、激素、營養(yǎng)、和細胞表面受體)或其配體，或其組合。蛋白質(zhì)的非限制性實例包括肽、多肽、蛋白質(zhì)片段、蛋白質(zhì)復(fù)合物、融合蛋白、重組蛋白、磷酸化蛋白、糖蛋白、脂蛋白或諸如此類。如本領(lǐng)域人員所清楚的，有大量可使用本發(fā)明檢測或評估其連接伴侶的可以的蛋白化分析物分子。除了上文討論的酶之外，合適的蛋白質(zhì)分析物分子包括但不限于，免疫球蛋白、激素、生長因子、細胞因子(其中許多起細胞受體的配體作用)、癌癥標(biāo)記物等。生物分子的非限制性實例包括PSA和TNF- α。在特定實施方式中，分析物分子可以為翻譯后修飾的蛋白質(zhì)(例如，磷酸化、甲基化、糖基化)，且捕獲組分可以為特異于翻譯后修飾的抗體。修飾的蛋白質(zhì)可由包含多種特異抗體的捕獲組分所捕獲，然后，所捕獲的蛋白質(zhì)可進一步連接于包含二級抗體(對翻譯后修飾具有特異性)的結(jié)合配體。備選地，修飾蛋白質(zhì)可由包含特異于翻譯后修飾的抗體的捕 獲組分捕獲，然后，所捕獲的蛋白質(zhì)可進一步連接包含特異于每種修飾蛋白質(zhì)的結(jié)合配體。在另一個實施方式中，分析物分子為核酸。核酸可由互補的核酸片段(例如，寡核苷酸)捕獲，然后可選地由包含不同互補寡核苷酸的結(jié)合配體標(biāo)記。合適的分析物分子和顆粒包括但不限于小分子(包括有機化合物和無機化合物)、環(huán)境污染物(包括農(nóng)藥、殺蟲劑、毒素等)、治療性分子(包括治療和濫用的藥物、抗生素等)、生物分子(包括激素、細胞因子、蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)、碳水化合物、細胞膜抗原和受體(神經(jīng)、激素、營養(yǎng)、和細胞表面受體)或其配體、等)、全細胞(包括原核細胞(如致病細菌)和真核細胞、包括哺乳動物腫瘤細胞)、病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹病毒、腺病毒、慢病毒等)、孢子等
坐寸ο含有或疑似含有分析物分子的流體樣品可來自任何合適的來源。在一些情況下，樣品可以包括液體、流體狀顆粒狀固體、固體顆粒懸液、超臨界流體，和/或氣體。在一些情況下，可以在確定之前將分析物分子從其來源中分離或純化；然而，在特定實施方式中，可直接測試含有分析物分子的未處理的樣品。分析物分子的來源可以為合成物(如產(chǎn)生于實驗室)、環(huán)境(如，空氣、土壤等)、哺乳動物、動物、植物或其的任意組合。在一個特定的實施方式中，分析物分子的來源是人的身體物質(zhì)(例如，血液、血清、血漿、尿液、唾液、組織、器官或諸如此類)。所分析的流體樣品的體積可為廣泛范圍的體積之內(nèi)的任何量，這取決于大量因素，如，使用的/可用的捕獲對象的數(shù)量，使用的/可用的位置數(shù)量，等等。在一些具體的示例性實施方式中，樣品的體積可以為大約O. OIul、大約O. luL、大約luL、大約5uL、大約10uL、大約100uL、大約lmL、大約5mL、大約10mL、或諸如此類。在一些情況下,流體樣品的體積為大約O. OluL-大約IOmL,大約O. OluL-大約ImL,大約O. OluL-大約100uL、或大約0. IuL-大約 IOuL0在一些情況下，流體樣品可在用于測定前進行稀釋。例如，在分析物分子來源為人的體液(如，血液、血清)的實施方式中，可以用適當(dāng)溶劑(如緩沖液，如PBS緩沖液)稀釋流體。在使用前可將流體樣品稀釋大約I倍、大約2倍、大約3倍、大約4倍、大約5倍、大約6倍、大約10倍、或更多。可將樣品加至包含大量捕獲物的溶液，或可將大量捕獲物直接(或以溶液形式)加至樣品。
結(jié)合配體和前體標(biāo)記試劑/標(biāo)記試劑結(jié)合配體可選自任何合適的分子、顆?；蛑T如此類，如下文有更多討論的，其能夠連接于分析物分子和/或連接于另一種結(jié)合配體。特定結(jié)合配體可包含能夠直接(如通過可檢測部分)或間接地幫助檢測的實體。有的組分可有助于間接檢測，例如，通過將前體標(biāo)記試劑分子轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑分子(如在測定中檢測的試劑)。在一些實施方式中，結(jié)合配體可包含酶組分(如，辣根過氧化物酶、半乳糖苷酶、堿性磷酸酶等)。如本文所描述的，第一種類型的結(jié)合配體可連接或不連接與另外的(例如第二種類型的)結(jié)合配體使用。在一些實施方式中，其中至少有一些包含至少一個分析物分子的大量捕獲物可接觸大量結(jié)合配體，這樣使得結(jié)合配體與大量分析物分子中的至少一些進行連接。在其中有統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物連接于單個分析物分子而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物不連接任何分析物分子(例如，其中分析物分子的數(shù)量少于捕獲物總數(shù))的實施方式中，結(jié)合配體可與基本上所有固定化于捕獲物的分析物分子連接。在一些情況下，超過大約80%、超過大約85%、超過大約90%、超過大約95%、超過大約97%、超過大約98%、超過大約99%、或更多的分析 物分子可連接于結(jié)合配體。在其中基本上所有捕獲物都包含至少一個分析物分子的其他實施方式中(如在其中分析物分子的數(shù)量大約等于或大于所提供的捕獲物數(shù)量的實施方式中)，捕獲物可接觸結(jié)合配體這樣使得統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物連接于至少一個結(jié)合配體(或在特定實施方式中，基本上只連接單個結(jié)合配體)而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物不連接任何結(jié)合配體。在一些情況下，捕獲物可接觸結(jié)合配體使得至少一些捕獲物連接于至少一個結(jié)合配體而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物不連接任何結(jié)合配體?？捎煤幸阎獫舛鹊姆治鑫锓肿蛹安煌康慕Y(jié)合配體的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣，使用泊松分析進行篩選測試以確定用于所需要的結(jié)合配體加樣程度(例如，為幫助選擇用于具體情況的適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合配體用量)的合適的結(jié)合配體用量。在特定實施方式中，確定了分析物是否幾乎全部或只是部分地由結(jié)合配體標(biāo)記。如本文他處所述的，使用泊松分布調(diào)整可將所檢測的活性(即，連接于結(jié)合配體的)分析物分子的百分比轉(zhuǎn)換為連接于零個、一個、兩個等的結(jié)合配體的分析物分子百分比。在一些實施方式中，可使用超過一種類型的結(jié)合配體。在一些實施方式中，可提供第一種類型的結(jié)合配體和第二種類型的結(jié)合配體。在一些例子中，提供了至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少八種、至少十種或更多類型的結(jié)合配體。當(dāng)其中一些連接于至少一個分析物分子的大量捕獲物接觸大量類型的結(jié)合配體時，大量固定化的分析物分子中至少有一些可連接于至少一個每種類型的結(jié)合配體。結(jié)合配體可選擇為使得其以多種不同方式相互作用。在第一個實施例中，第一種類型的結(jié)合配體可連接于分析物分子，而第二種類型的結(jié)合配體可連接于第一種類型的結(jié)合配體。在這些實施方式中，第一種類型的結(jié)合配體可包含有助于分析物連接的第一種組分及有助于第二種類型結(jié)合配體連接第一種類型的結(jié)合配體連接的第二種組分。在一個具體的實施方式中，第二種組分為生物素，而第二種類型的結(jié)合配體包含連接生物素的酶或酶組分。作為另一個實例，第一種類型的結(jié)合配體和第二種類型的結(jié)合配體可直接連接于分析物分子。不受理論或任何具體機制的約束，在進行測定時，通過只將確定包含第一種類型和/或第二種類型的結(jié)合配體的位置鑒別為含有分析物分子(如通過直接或間接檢測)，第一種類型和第二種類型的結(jié)合配體的連接都可提供另外的特異性和可靠性。這些測定法可以減少非特異性連接引起的假陽性數(shù)，因為被發(fā)現(xiàn)只具有單一類型的結(jié)合配體(如，只有第一種類型的標(biāo)記試劑或第二種類型的標(biāo)記試劑)的位置不會被認為或計為包含分析物分子的位置。第一種類型的結(jié)合配體可包含第一種類型的酶組分，而第二種類型的結(jié)合配體可包含第二種類型的酶組分，其不同于第一種類型的酶組分。含有分析物分子、第一種類型的結(jié)合配體及第二種類型的結(jié)合配體的捕獲物可接觸第一種類型的前體標(biāo)記試劑(其在接觸第一種類型的酶組分時會轉(zhuǎn)化為第一種類型的標(biāo)記試劑(如,包含第一種可測量特性))和第二種類型的前體標(biāo)記試劑(其在接觸第二種類型的酶組分時會轉(zhuǎn)化為第二種類型的標(biāo)記試劑(如，包含可區(qū)分于第一種可測量特性的第二種可測量特性)。因此，只有確定含有第一種類型的標(biāo)記試劑及第二種類型的標(biāo)記試劑的位置含有分析物分子。作為另一個實例，第一種類型的結(jié)合配體和第二種類型的結(jié)合配體可各自并入一種組分(如，DNA標(biāo)簽)，而第三種類型的結(jié)合配體可包含互補于第一種類型和第二種類型結(jié)合配體的兩種組分(例如，兩種類型的互補DNA標(biāo)簽)，其中第三種類型的結(jié)合配體還包含用于直接或間接檢測的分子或部分(例如，確定一個位置中分析物分子存在或不存在需要反應(yīng)容器中存在第三種類型的結(jié)合配體)。當(dāng)?shù)谝环N類型的結(jié)合配體和第二種類型的結(jié)合配體都基本上緊密地存在于彼此鄰近時(例如，通過連接于一個分析物分子)，可發(fā)生第三種類型結(jié)合配體的連接，這樣使得可以對分析物分子進行檢測。有關(guān)使用超過一種類型的結(jié)合配體降低非特異性連接相 關(guān)的特定負面影響的更多信息描述于Duffy等人提交于2010年3月24日的共有美國專利申請序列號 12/731，135，題名為“Ultra-Sensitive Detection of Molecules using DualDetection Methods”，以及Duffy等人提交于2011年3月I日的國際專利申請?zhí)?未確定)，題名為“Ultra-Sensitive Detection of Molecules using Dual Detection Methods，，(律師案卷號Q0052. 70012W000)，其通過引用并入本文。檢測可檢測和/或定量其中一些包含至少一個分析物分子和/或至少一個結(jié)合配體的大量捕獲物，而所述檢測和/或定量可與所測試的樣品中的分析物分子/顆粒的存在情況及可選地其的量和/或濃度相關(guān)。在一些實施方式中，可通過將大量捕獲物空間劃分入大量位置而檢測和/定量所述大量捕獲物。在一些實施方式中，所述大量位置包含大量反應(yīng)容器(如，在陣列中)。在一些情況下，可構(gòu)造檢測器以檢測大量位置(例如，反應(yīng)容器陣列)之中或附近的捕獲物。在一些實施方式中，捕獲物可產(chǎn)生或被做成產(chǎn)生可檢測信號如熒光發(fā)射，其可幫助檢測捕獲物。在一些情況下，可使用散射技術(shù)檢測捕獲物，如本文所描述的。在一些實施方式中，空間劃分的捕獲物數(shù)量可基本上等同于接觸含有或疑似含有分析物分子的流體樣品的捕獲物數(shù)量。然而，在一些實施方式中，空間劃分入大量位置的捕獲物數(shù)量基本上少于接觸含有或疑似含有分析物分子的流體樣品的捕獲物數(shù)量。在一些情況下，大約1%、大約2%、大約3%、大約5%、大約10%、大約15%、大約20%、大約30%、大約40%、大約50%、大約60%、大約70%、大約80%、或更多的接觸流體樣品的捕獲物都在空間上劃分入了大量位置。在一些例子中，大約1%_大約99%，大約10%-大約90%，大約20%-大約80%，大約30%-大約70%,大約50%-大約90%,大約1%-大約50%,大約5%-大約40%、或大約10%-大約30%或更多的接觸流體樣品的捕獲物都在空間上劃分入了大量位置?？蓪臻g劃分的分析物分子(或結(jié)合配體)進行直接或間接檢測和/或定量。在直接檢測的情況下，分析物分子可包含可直接拾取和/或檢測的分子或部分，例如，熒光實體(如熒光部分、熒光微珠、熒光抗體等)、金屬納米顆?；蚣{米團簇(例如，黃金納米團簇或納米顆粒、銀納米團簇或納米顆粒)，量子點(如CdSe量子點，CdTe量子點等)，以及放射性同位素。在其中測定包含使用一種或多種類型的結(jié)合配體的實施方式中，結(jié)合配體可包含可直接拾取和/或檢測的分子或部分?？稍趯λ鑫恢眠M行拾取時使包含這樣的分析物分子或結(jié)合配體(其包含可直接拾取和/或檢測的部分)的位置發(fā)射信號。在一些實施方式中，可采用非酶的檢測方法。非酶的檢測方法對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知。非限制性實例包括拉曼散射，電磁輻射共振法(例如，回音壁模式)、光譜儀(例如，紅外，原子光譜)、吸收值、壓電傳導(dǎo)(例如，石英晶體微天平(QCM))、圓二色光譜、電鏡(例如，掃描電顯微鏡(SEM), X-射線光電子能譜儀(XPS))、掃描探針顯微術(shù)(例如，原子力顯微鏡(AFM)、掃描隧道顯微鏡(STM))、光散射，表面等離子體共振(SPR)、倏逝波檢測、 光學(xué)干涉測量法和其他方法的基礎(chǔ)上測量的折射率的變化、電子傳導(dǎo)法、如電導(dǎo)和電容；磁性傳導(dǎo)效應(yīng)(例如，磁阻效應(yīng))、量熱法(例如，差示掃描量熱法(DSC))、衍射、核磁共振(NMR)、電子順磁共振(EPR)、質(zhì)譜(例如，基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI))、熒光技術(shù)(如熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)、時間分辨熒光(TRF)、熒光偏振(FP))及發(fā)光氧氣竄(L0CI)。在一些實施方式中，大量分析物分子(或結(jié)合配體)是間接檢測的。間接的手段可包括例如將分析物分子或連接于分析物分子的結(jié)合配體接觸前體標(biāo)記試劑，其中前體標(biāo)記試劑在接觸分析物分子或連接于分析物分子的結(jié)合配體時會轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑。標(biāo)記試劑可包含能夠拾取和/或檢測的分子或部分。然后可通過確定所述位置處/中的標(biāo)記試劑的存在或不存在而確定分析物分子或結(jié)合配體在某個位置處的存在或不存在。例如，分析物分子可包含酶組分，而前體標(biāo)記試劑分子可為顯色、熒光或化學(xué)發(fā)光的酶性前體標(biāo)記劑分子，其在接觸轉(zhuǎn)化劑時會轉(zhuǎn)化為顯色，熒光或化學(xué)發(fā)光的產(chǎn)物(其中每個都是標(biāo)記試劑的一個實例)。在此例子中，前體標(biāo)記試劑可為酶標(biāo)簽，例如，顯色、熒光或化學(xué)發(fā)光的酶性前體標(biāo)記試劑，其在接觸酶組分時轉(zhuǎn)化為可檢測的標(biāo)記試劑。在一些情況下，顯色、熒光或化學(xué)發(fā)光的酶性前體標(biāo)記試劑是以足夠接觸每個位置的量提供的。在一些實施方式中，電化學(xué)發(fā)光前體標(biāo)記試劑會轉(zhuǎn)化為電化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑。在一些情況下，酶組分可包含半乳糖苷酶、辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶。如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員會理解的，可選擇多種適當(dāng)?shù)娘@色、熒光或化學(xué)發(fā)光酶性前體標(biāo)記試劑以使許多不同的酶對其轉(zhuǎn)化。因此，任何已知的能夠在與具體酶反應(yīng)時產(chǎn)生標(biāo)記試劑的顯色、熒光或化學(xué)發(fā)光酶性前體標(biāo)記試劑可潛在地用于本發(fā)明的實施方式作為前體標(biāo)記試劑，其中分析物分子或連接于分析物分子的結(jié)合配體包含酶組分。例如，許多適合酶性前體標(biāo)記試劑分子的用途的顯色、熒光或化學(xué)發(fā)光前體標(biāo)記試劑公開于 The Handbook-A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, TenthEd. , Chapter 10。在另一個實施方式中，分析物分子可以為蛋白質(zhì)，而結(jié)合配體可包含能夠連接于分析物分子以及酶組分的結(jié)合配體。將前體標(biāo)記試劑分子接觸連接于結(jié)合配體的酶組分可將前體標(biāo)記試劑分子轉(zhuǎn)化為可檢測的顯色、熒光或化學(xué)發(fā)光標(biāo)記試劑分子。圖9A和9B中示例顯示了兩個間接檢測分析物分子的非限制性實例。圖9A中，提供了位置150 (此實施例中表示為一個反應(yīng)容器)，其包含捕獲物152 (在此實施方式中由箭頭表示)。分析物分子154通過捕獲組分156固定化于捕獲物152。反應(yīng)容器接觸到前體標(biāo)記試劑158，其在接觸分析物分子154時可轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑分子160，如箭頭159所示。作為另一個實例，圖9B中，提供了位置170 (此實施例中表示為一個反應(yīng)容器)，其包含捕獲物172 (在此實施方式中表示為微珠)。分析物分子174通過捕獲組分176固定化于捕獲物172，結(jié)合配體177連接于分析物分子174。反應(yīng)容器接觸到前體標(biāo)記試劑158，其在接觸結(jié)合配體177時可轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑分子180，如箭頭179所示。在一些實施方式中，可指認大量位置，且/或可基本上同時檢測大量捕獲物和/或目的物類/分子/顆粒。當(dāng)用于此上下文時，“基本上同時”指的是在近似相同的時間指認/檢測目的位置/捕獲物/分子/顆粒，使得至少兩個目的位置/捕獲物/分子/顆粒所指認/檢測的時間段有重疊，而不是順序地指認/檢測。同時的指認/檢測可通過使用多種技術(shù)包括光學(xué)技術(shù)(如CCD檢測器)完成。根據(jù)一些實施方式，對捕獲物/物類/分子/顆粒的空間劃分入大量分離的可解析位置有助于基本上同時進行檢測，通過使得多個位置可基本上同時被指認。例如，對于這樣的實施方式，其中在檢測中單個的物類/分子/顆粒連接于進行空間劃分與其他捕獲物進入了分離、分開的可解析位置的捕獲物，基本上同時指認大量分離、分開的可解析位置允許解析單個捕獲物，由此也允許解析單個的物類/分子/顆粒(如，分析物分子)。例如，在特定實施方式中，大量分子/顆粒中的單個分子/顆粒在大量反應(yīng)容器上有分區(qū)，這樣每個反應(yīng)容器會含有零個或只有一個物類/分子/顆粒。在一些情況下，在檢測中所有物類/分子/顆粒中有至少大約80%、至少大約85%、至少大約90%、至少大約95%、至少大約96%、至少大約97%、至少大約98%、至少大約99%、至少大約99. 5%都在空間上與其他物類/分子/顆粒分離。大量物類/分子/顆粒可在低于大約I秒、低于大約500毫秒、低于大約100毫秒、低于大約50毫秒、低于大約10毫秒、低于大約I毫秒、 低于大約500微秒、低于大約100微秒、低于大約50微秒、低于大約10微秒、低于大約I微秒、低于大約O. 5微秒、低于大約O. I微秒、或低于大約O. 01微秒、低于大約O. 001微秒、或更少的時間段內(nèi)基本上同時檢測。在一些實施方式中，大量物類/分子/顆?？稍诖蠹s100微秒-大約O. 001微秒，大約10微秒-大約O. 01微秒、或更少的時間段內(nèi)基本上同時檢測。在一些實施方式中，一些技術(shù)可用于防止或減少分析物分子從捕獲組分和/或捕獲物上的解離，并/或防止或減少結(jié)合配體從分析物分子和/或另一種結(jié)合配體上的解離。如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的，所選的分析物分子、捕獲組分和/或結(jié)合配體之間的(如抗體抗原之間的)一些可逆親和相互作用受熱動力學(xué)控制。因此，在特定測定的一些時間點處，分析物分子和捕獲組分之間和/或結(jié)合配體，和/或結(jié)合配體和分析物分子和/或另一中結(jié)合配體之間的可以發(fā)生一些解離。這可以導(dǎo)致所檢測到的分析物分子(如免疫復(fù)合物)數(shù)量少于實際存在的。具體的一對組分(如抗體-抗原對)的解離常數(shù)、洗滌和/或液體接觸、接觸和拾取之間的時間和/或其他因素可以影響解離事件改變對分析物分子和/或顆粒的確定的程度。因此，特定技術(shù)可用于減少解離過程的影響。在第一個實施方式中，可在大量(例如通過捕獲組分連接捕獲物和/或連接于至少一個結(jié)合配體的)分析物分子進行空間劃分進入大量這樣的位置之后通過從測定位置(例如，孔)移除液體而減少或消除解離。也就是，可以移除所有或基本上所有在這些位置中/處圍繞或基本包含期內(nèi)的液體。例如，流體可通過空氣和/或真空干燥而移除。液體的移除可減少或消除解離。在對位置進行拾取前可立即將流體加至這些位置，由此使復(fù)合物再水合，這有助于用檢測器進行拾取。在一個具體的實施例中，大量分子物分子(例如通過捕獲物)連接于微珠(在一個實施方式中為捕獲物)。微珠(因此也是分析物分子)可選地連接于至少一個結(jié)合配體和/或接觸某種材料(例如，緩沖液)以保持分析物分子和/結(jié)合配體處于水合狀態(tài)(例如，免疫復(fù)合物可接觸含有特定碳水化合物的緩沖液)。在微珠加入大量的孔(例如，位置)之后，多余溶液(例如，緩沖液)通過空氣和/或真空干燥而移除。在此實施方式中，通過消除微珠和大量溶液的接觸，與不移除流體的類似系統(tǒng)相比，幾乎消除或基本上減少了分析物分子和/或結(jié)合配體的解離。在此情況下，可將包含微珠的孔儲存(例如lmin, 2min, 5min, IOmin, 20min, 30min, I小時、2小時、3小時、4小時、6小時、12小時、或更久)，而沒有或基本上沒有(例如，低于大約20%、低于大約15%、低于大約10%、低于大約5%、低于大約4%、低于大約3%、低于大約2%、低于大約1%、低于大約O. 5%、低于大約O. 3%、低于大約O. 1%、低于大約O. 01%、或更少的)分析物分子(和/或結(jié)合配體)解離。在進行孔拾取前或緊接著孔拾取(例如，大約 I秒、大約5秒、大約10秒、大約30秒、大約I分鐘、大約2分鐘、或大約5分鐘前)時,可向 孔中加入溶液，可選地隨后進行密封(例如，在拾取前)。見例如實施例22。在第二個實施方式中，可通過將分析物分子與捕獲組分交聯(lián)和/或?qū)⒔Y(jié)合配體與分析物分子和/或第二中結(jié)合配體交聯(lián)而減少或消除解離。例如，包含抗原的分析物分子可與包含抗體的結(jié)合配體和/或捕獲組分交聯(lián)。所采用的交聯(lián)方法和技術(shù)對本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知。在一些情況下，分析物分子連接捕獲組分(例如連接捕獲物)和/或結(jié)合配體連接于分析物分子和/或第二種結(jié)合配體之后，復(fù)合物可接觸交聯(lián)劑(如I-乙基-3-[3- 二甲基氨基丙基]碳二亞胺(即，EDC)，戊二醛等)，由此促進所需的交聯(lián)反應(yīng)。交聯(lián)反應(yīng)劑可根據(jù)用于測定的反應(yīng)劑的特性而選擇，可以考慮多種因素包括交聯(lián)反應(yīng)劑的長度和/或選擇交聯(lián)劑時的必需官能團，這些都是本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的?？蛇x地，在拾取之前或在接觸標(biāo)記試劑前體或其他反應(yīng)劑之前可移除多余的交聯(lián)反應(yīng)劑，且/或淬滅未反應(yīng)的交聯(lián)基團。然后可根據(jù)如本文所描述的方法進行測定。見例如實施例23。交聯(lián)反應(yīng)的一個非限制性實例顯示于圖10A。在此圖中，包含捕獲組分504(例如，捕獲抗體)的微珠502連接于分析物分子506。分析物分子506還連接于結(jié)合配體508。復(fù)合物507與交聯(lián)反應(yīng)劑510接觸，并發(fā)生反應(yīng)，如箭頭511所示。第一種交聯(lián)反應(yīng)劑512在分析物分子506和捕獲組分504之間形成的交聯(lián)，而交聯(lián)反應(yīng)劑514在分析物分子506和結(jié)合配體508之間形成交聯(lián)。作為另一個實例，結(jié)合配體可包含能夠在兩個組分(如分析物分子和結(jié)合配體，或捕獲組分和分析物分子，或第一種結(jié)合配體和第二種結(jié)合配體)之間形成交聯(lián)的交聯(lián)組分，如IOB所示。在此圖中，包含捕獲組分524 (例如，捕獲抗體)的微珠522連接于分析物分子526。分析物分子526還連接于包含交聯(lián)組分530的結(jié)合配體528。在接觸外部刺激時(如，UV光、化學(xué)刺激物等)，分析物分子526和結(jié)合配體524之間形成交聯(lián)532，如箭頭531所示。用于此目的的交聯(lián)組分的非限制性實例包括N-琥珀酰亞胺基_6-[4’ -疊氮基-2’ -硝基苯基氨基])己酸鹽(B卩，SANPAH)和琥珀酰亞胺基6- (4，4’ -疊氮戊酰胺)己酸鹽(即，LC-SDA)ο在所述方法中對捕獲物/分析物分子已經(jīng)劃分進入的位置的指認步驟中，可確定多種參數(shù)。在一些實施方式中，確定了包含捕獲物和分析物分子(或結(jié)合配體)的位置數(shù)量。包含捕獲物但不包含分析物分子(或結(jié)合配體)的位置數(shù)量也可確定。在一些情況下，所指認的不含捕獲物的位置數(shù)量也可確定。在其他情況下，還可確定所指認的位置總數(shù)?？稍谌魏谓o定的時間對最終指認的位置的任何亞集或全部進行單次拾取或多次拾取，以幫助進行一項或所有上述的確定。例如，第一個確定可在第一種波長范圍(例如，白光)下完成以確定包含捕獲物的位置數(shù)量，其中位置沒有區(qū)分為其中分析物分子(或結(jié)合配體)是否連接于捕獲物，而第二種對相同位置或?qū)@些位置中一些亞集的確定可在第二種波長范圍(例如，熒光)下完成的，以確定包含連接于分析物分子(或結(jié)合配體)的捕獲物的位置數(shù)量。示例性的檢測方法描述于下文。檢測方法在一些實施方式中，在其中要檢測的物類是在大量位置上分區(qū)的系統(tǒng)/方法中，可使用多種技術(shù)拾取這些位置，包括本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的技術(shù)。
在本發(fā)明一個具體的實施方式中，對這些位置進行光拾取?？赏ㄟ^常規(guī)的光學(xué)系統(tǒng)和光學(xué)檢測系統(tǒng)鑒別出在其光學(xué)特征上顯示出變化的位置。根據(jù)所檢測的種類(例如，標(biāo)記試劑分子、顆粒等等)和操作波長，可采用為具體波長設(shè)計的濾光片用于光拾取這些位置。在其中使用了光拾取的實施方式中，該系統(tǒng)可包含超過一個光源和/或大量濾片以調(diào)整光源的波長和/或強度。例如，在一些情況下，對位置的第一次拾取可使用第一個波長范圍的光(例如，在捕獲物非熒光的情況下為白光，或捕獲物發(fā)熒光的波長范圍)進行，而第二次拾取可使用第二種不同波長范圍進行，這樣使得大量可檢測分子發(fā)熒光。一個示例性的系統(tǒng)配置提供于下文(見圖11)。在一些實施方式中，來自大量位置的光信號由CXD攝像機捕獲。如本領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的，可用于捕獲圖像的攝像機成像類型的其他非限制性實例包括電荷注入檢測器(CID)、互補金屬氧化物半導(dǎo)體(CMOS)設(shè)備、科學(xué)級CMOS (sCMOS)設(shè)備和時間延遲集成(TDI)設(shè)備。攝像機可獲自商業(yè)來源。CID為類似于C⑶的固態(tài)的、二維多像素成像設(shè)備，但差別在于圖像是如何捕獲和讀取的。CID的實例見美國專利號3，521，244和美國專利號4，016，550。CMOS設(shè)備也是二維、固態(tài)成像設(shè)備，但與標(biāo)準(zhǔn)CXD陣列的差異在于電荷是如何收集和讀取的。這些像素在制造CMOS晶體管的半導(dǎo)體技術(shù)平臺中建立，這樣在基本上的讀取電子學(xué)系統(tǒng)的信號上產(chǎn)生顯著的增益，而且使設(shè)備上電子學(xué)系統(tǒng)產(chǎn)生顯著的更正。例如，見美國專利號5，883，830。sCMOS包含CMOS成像技術(shù)，具有特定的形成良好的靈敏度和動態(tài)范圍的技術(shù)改進。TDI設(shè)備采用了 CCD設(shè)備，其允許一列像素轉(zhuǎn)移入鄰近一列并還能繼續(xù)采集光。這種類型的設(shè)備一般以這樣的方式施用，使得這列像素的轉(zhuǎn)移與正在采集的圖像的運動同步，這樣可整合顯著的一段時間的移動圖像，而且不會因為攝像機上圖像的相對移動而模糊化。在一些實施方式中，可使用偶聯(lián)于光電二極管或光電倍增管(PMT)的掃描鏡系統(tǒng)進行成像。在一個實施方式中，大量位置作為光纖束一端的大量反應(yīng)容器直接形成。根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的反應(yīng)容器的陣列可聯(lián)合光學(xué)檢測系統(tǒng)使用，如描述于美國公布號2003/0027126的系統(tǒng)。例如，根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的反應(yīng)容器陣列是在光纖裝置中形成的，后者包含由包層纖維構(gòu)成的光纖束，這樣光不會在不同纖維之間混淆。圖IlA和IlB顯示了根據(jù)一些實施方式的本發(fā)明的系統(tǒng)的非限制性實例。所述系統(tǒng)包括光源452、激發(fā)濾光片454，二色鏡458、發(fā)射濾光片460、物體470及陣列472。從光源452發(fā)出的光453通過激發(fā)濾光片454。光在二色鏡458上反射回來，通過目標(biāo)470，照在陣列472上。在一些情況下,雜散光464可通過雜散光降低功能體468而減少,如虹膜光圈或光圈。發(fā)射自陣列的光471穿過模板470和發(fā)射濾光片460。觀察到的為光462。根據(jù)具體應(yīng)用的需要，該系統(tǒng)可包含其他組分(例如，附加的濾光片、鏡片、放大設(shè)備等)，這些是本領(lǐng)域一般技術(shù)人員所理解的。圖IlA中所示的系統(tǒng)可以另外包含有助于(例如使用白光)確定含有捕獲物的反應(yīng)容器的數(shù)量的組分。備選地，附加的組分可用于確定位置總數(shù)量和/或提供有關(guān)這些(例如，含有或不含捕獲物的)位置的位點的空間信息，這可以幫助收集不同光照(如熒光、白光)下觀察到的對應(yīng)于某個位置的位點的信號(例如，可制造掩罩)。在圖IlA和IlB中，激發(fā)光由光源452發(fā)射出并準(zhǔn)直成為光束453。激發(fā)濾光片454可構(gòu)造為只傳遞激發(fā)突光素的波長帶(如在試鹵靈的情況下為575nm±10nm)。激發(fā)光被二色濾光片458向下反射并通過目鏡470激發(fā)含有樣品的基底472。圖像光通過目鏡470 收集的，準(zhǔn)直為光束471并傳輸穿過二色濾光片458。只有對應(yīng)于熒光波段(如在試鹵靈的情況下為670nm±30nm)的圖像光可以傳輸穿過發(fā)射濾光片460。剩下的準(zhǔn)直光束462只含有發(fā)射的熒光波長，其在隨后通過攝像機系統(tǒng)成像。相同的系統(tǒng)可用于確定含有樣品的位置(反應(yīng)容器)的定位。包含含有捕獲物的反應(yīng)容器的陣列可用“明場”白光照明照亮。所述陣列可通過將一束偽準(zhǔn)直的白光(例如白光LED)以收集目標(biāo)的數(shù)值口徑之外的一定角度(例如，圖IlA的Θ 1可為大約20度、大約25度、大約30度、大約35度、大約40度、或更大)指向陣列表面而照亮。照在陣列472表面的光(例如，光476)被從表面反射(或散射)，準(zhǔn)直為471并通過目鏡(470)收集。然后準(zhǔn)直光束通過攝像機系統(tǒng)成像。相同的系統(tǒng)還可用于確定哪些位置含有捕獲物(例如，微珠)。任何具體的微珠可以連接或不連接于分析物分子和/或結(jié)合配體。所述陣列可(例如使用如圖IlA所示的光源473)用“暗場”白光照明照亮。通過將一束偽準(zhǔn)直的白光(例如白光LED473)以基本在收集目標(biāo)的數(shù)值口徑之外的一定角度(例如，圖IlA的92可為大約65度、大約70度、大約75度、大約80度、大約85度)指向陣列表面而照亮。照在陣列472表面的光(例如，光474)被從表面反射(或散射)，準(zhǔn)直為471并通過目鏡(470)收集。然后準(zhǔn)直光束通過攝像機系統(tǒng)成像。在一些實施方式中，可米用如描述于美國公布號2003/0027126的光學(xué)檢測系統(tǒng)。在一個示例性系統(tǒng)中，通過使用放大變換器改變了從形成于光纖束遠端的反應(yīng)容器陣列返回的光以對光纖近端或遠端的成像尺寸進行調(diào)整。放大的圖像然后由快門輪遮閉并濾過。然后，圖像由電荷耦合設(shè)備(CCD)攝像機捕獲?？商峁┌ú?zhí)行成像處理軟件的計算機以處理來自CXD攝像機的信息，可選地，其還能設(shè)置為控制快門和濾光輪。如美國公布號20030027126中闡明的，光纖束的近端由z平移臺和χ-y微定位器進行接收。例如，圖12顯示了一個系統(tǒng)的原理框圖，其采用了光纖裝置400和光學(xué)檢測系統(tǒng)。光纖裝置400包含光纖束或陣列402，其是由包層光纖構(gòu)成的，這樣光就不會在光纖之間混淆。反應(yīng)容器401的陣列形成/附著于光纖束的遠端412，其近端414可操作地與Z-平移臺416和x-y微定位器418相連。這兩個部件協(xié)同作用為顯微鏡物鏡420對光纖束402的近末端414進行合適的定位。由三個指針立方體滑塊422將物鏡420收集的光傳遞至反射光熒光附件。附件422使得能夠使來自75瓦特的Xe燈424的光導(dǎo)向穿過物鏡420，以耦合進入光纖束402。來自光源424的光通過聚光鏡426聚集，然后通過濾光片和快門輪428過濾和/或遮閉，然后穿過ND濾光片430。從光纖束402的遠端412返回的光穿過附件422至放大轉(zhuǎn)換器432，后者使得能夠調(diào)整光纖的近端或遠端的成像尺寸可以調(diào)整。穿過放大轉(zhuǎn)換器432的光然后通過第二個快門輪434被遮閉和過濾。這些光由電荷耦合設(shè)備(CCD)攝像機436收集。計算機438執(zhí)行成像處理軟件的以處理來自CXD攝像機436的信息，可選地，其還控制系統(tǒng)的其他部件，包括但不限于第一和第二個快門和過濾輪428、434。用于實踐本發(fā)明一些實施方式的反應(yīng)容器陣列可使用多種兼容過程整合或附著于光纖束遠端。在一些情況下，微孔形成于光纖束每個單獨纖維的中心，這些微孔可以密封或不密封。光纖束的每個光纖可傳遞來自形成于光纖遠端中心的單個微孔的光。這個特征使得能夠拾取單個反應(yīng)容器的光學(xué)信號以鑒別各個微孔中的反應(yīng)/內(nèi)容物。因此，通過用 CCD陣列收集光纖束末端的圖像，反應(yīng)容器的光學(xué)信號可單個地進行拾取且/或可基本上同時成像。
定量根據(jù)本發(fā)明的一些實施方式，至少部分地基于對用于捕獲分析物分子(及可選地至少一個結(jié)合配體)的大量捕獲分子中至少一些的檢測和/或定量，這些方法、系統(tǒng)和/或設(shè)備被用于確定流體樣品中分析物分子(或顆粒)的存在和/或濃度的量度。在其中濃度已經(jīng)確定的特定實施方式中，采用了將含有包含至少一個分析物分子(和/或至少一個結(jié)合配體)的捕獲物的位置數(shù)量(或比例/百分比)與流體樣品中分析物分子的量/濃度相聯(lián)系的關(guān)聯(lián)和/或校準(zhǔn)。在一些情況下，流體樣品中分析物分子的濃度可與含有包含至少一個分析物分子(和/或至少一個結(jié)合配體)的捕獲物的位置的數(shù)量/比例成線性比例。在其他情況下，流體樣品中分析物分子濃度的量度可與含有連接于至少一個分析物分子(和/或至少一個結(jié)合配體)的捕獲物的位置的數(shù)量/比例有非線性關(guān)系。在一些實施方式中，流體樣品中分析物分子濃度的量度可至少部分地使用用含有已知濃度的靶標(biāo)分析物分子的樣品得出的校準(zhǔn)曲線而確定。用于確定流體樣品中分析物分子濃度的量度的方法在下文有更多討論。本發(fā)明的特定實施方式的出色之處在于其能夠檢測和/或定量低數(shù)量/濃度的包含至少一個分析物分子(和/或至少一個結(jié)合配體)的捕獲物，很適合于確定對含有很低濃度的分析物分子的流體樣品中分析物分子濃度的量度。在特定實施方式中，可至少部分地通過空間分離單個捕獲物以增進所述能力，包括至少一些捕獲物包含至少一個分析物分子(和/或至少一個結(jié)合配體)，例如通過將大量的這種捕獲物在位置(反應(yīng)容器)的陣列上分區(qū)，并然后檢測其在反應(yīng)容器中的存在情況。在一些實施方式中，可確定包含至少一個分析物分子(和/或至少一個結(jié)合配體)的捕獲物在反應(yīng)容器中的存在情況，而且這些反應(yīng)容器的數(shù)量可以二進制形式計數(shù)。也就是說，在其中位置(例如反應(yīng)容器)被發(fā)現(xiàn)含有至少一個連接于至少一個分析物分子(和/或至少一個結(jié)合配體)的捕獲物的實施方式中，所述位置計為I。而在其中位置(例如反應(yīng)容器)被發(fā)現(xiàn)含有捕獲物的實施方式中，所述位置計為O。例如，如上文所描述的，可通過檢測反應(yīng)容器中可檢測分子或顆粒的存在情況可確定計為“I”的孔表示孔中存在有包含至少一個分析物分子(和/或至少一個結(jié)合配體)的捕獲物。
在這些實施方式中，其中含有或疑似含有的流體樣品接觸大量捕獲物使得存在于樣品中的任何分析物分子固定化于大量捕獲物，使得統(tǒng)計學(xué)顯著比例(例如，如上文所描述)的捕獲物連接于單個分析物分子而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物不連接任何分析物分子(如圖I步驟(B)所示)，對流體樣品中分析物濃度的量度可如下進行。首先，至少一部分捕獲物(其中至少有一些具有固定化的單個分析物分子)在空間上劃分入大量位置(如圖1，步驟(C)所示)。確定含有固定化于捕獲物的分析物分子的位置數(shù)量，可以直接(如通過檢測分析物分子本身，例如見圖1，步驟(D))或間接(例如，通過檢測連接于分析物分子的結(jié)合配體，通過檢測(例如前體標(biāo)記試劑接觸分析物分子轉(zhuǎn)化形成的，見圖4A，等等)標(biāo)記試劑進行。在一些實施方式中，流體樣品中分析物分子濃度的量度至少部分地基于確定含有分析物分子的大量位置(例如，圖I步驟(D)中反應(yīng)容器12)的數(shù)量而確定。在特定的這些實施方式中，流體樣品中分析物分子濃度的量度至少部分地基于將如此測量的參數(shù)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣的比較和/或使用泊松和/或高斯分布分析的預(yù)期含有分析物分子的位置數(shù)量。在一些實施方式中，也可確定包含不連接于分析物分子的捕獲物的位置數(shù)量(如圖I步驟(D)中的反應(yīng)容器13)。在這些情況下，流體樣品中分析物分子濃度的量度可至少部分地基于包含固定化于捕獲物的分析物分子的位置數(shù)量相對包含不連接于分析物分子 的捕獲物的位置數(shù)量的比率而確定。在一些情況下，還可確定不包含捕獲物的位置數(shù)量(例如，圖I步驟(D)中的反應(yīng)容器14)。在這些情況下，流體樣品中分析物分子濃度的量度可至少部分地基于包含固定化于捕獲物的分析物分子的位置數(shù)量相對不包含捕獲物的位置數(shù)量和/或不包含分析物分子的位置數(shù)量的比率而確定，不管這樣的位置是否含有捕獲物(在上述兩種情況下或其他情況下，根據(jù)偏好，這個比率/比例的分母可包括或不包括加上陽性(“開”或“I”)位置的零(“關(guān)”或“O”)位置)。在其他情況下，可確定所指認/分析的位置(如圖1，步驟(D)中的反應(yīng)容器12、13和14)總數(shù)，且流體樣品中分析物分子濃度的量度可基于包含固定化于捕獲物的分析物分子的位置數(shù)量與所指認/分析的位置總數(shù)的比率而確定。應(yīng)當(dāng)理解的是，在一些測定法中，流體樣品中分析物分子濃度的量度可使用超過一種類型的分析(例如，基于包含固定化于捕獲物的分析物分子的位置數(shù)量的第一種分析和基于包含固定化于捕獲組分的分析物分子的位置數(shù)量相對包含捕獲物的位置總數(shù)的比率/比例，等等)進行。在這些實施方式中，第二種分析可用作質(zhì)量控制量度(例如，以確認第一種分析提供了合理的結(jié)果)，且/或這兩次分析結(jié)果可加以平均。在一些實施方式中，確定測流體樣品中分析物分子濃度的量度可使用與上文所描述的類似分析進行，但是是通過確定包含結(jié)合配體的反應(yīng)容器數(shù)量，而不是包含固定化于捕獲物的分析物分子的反應(yīng)容器數(shù)量。如本文所描述的，在一些情況下，大量分析物分子固定化于大量捕獲物后，所述大量捕獲物可接觸至少一種類型的結(jié)合配體以使至少一些固定化的分析物分子連接于至少一個結(jié)合配體(例如見圖2，步驟(B))。這種測定法尤其可用于其中預(yù)期超過一個分析物分子會連接每個捕獲物，但仍需要二進制定量的實施方式中。在一些情況下，結(jié)合配體可提供的濃度可使得至少一些含有至少一個分析物分子的捕獲物不連接任何結(jié)合配體(例如，見圖2，步驟(C))。在這些實施方式中，含有(例如通過分析物分子)連接于結(jié)合配體的捕獲物的位置數(shù)量可在上文描述的分析和方法中取代含有連接于分析物分子的捕獲物的位置數(shù)量。
流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度可使用多種校準(zhǔn)技術(shù)確定，能產(chǎn)生最精確可靠的結(jié)果的具體技術(shù)可取決于相對于接觸樣品的捕獲物的數(shù)量/濃度的樣品中分析物分子的數(shù)量/濃度(或，對于使用結(jié)合配體的實施方式，為相對于在捕獲物捕獲分析物分子之中/之后的彼此接觸的捕獲物的數(shù)量/濃度的結(jié)合配體的數(shù)量/濃度)?？捎糜诰唧w分析物濃度方式的濃度確定方法的非限制性實例包括上述的二進制讀取法，及/或其中采用了對這些位置測量了相對陽性信號強度的方法(“強度讀取法”)。上述方法的任何一項或二者——或備選方法——都可進一步采用將所測量的參數(shù)與校準(zhǔn)曲線進行對比。目前認為最精確的確定方法至少部分地取決于流體樣品中包含的分析物分子濃度。例如，在這樣的實施方式中，其中在測樣品中分析物分子濃度導(dǎo)致捕獲物分區(qū)所在的位置中有統(tǒng)計學(xué)顯著的比例都包含單個分析物分子或結(jié)合配體，而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的位置不包含任何分析物分子或結(jié)合配體(例如，在或接近幾乎沒有位置包含超過一個分析物分子或結(jié)合配體的形式中)，二進制讀取法可尤其有用，而在一些情況下，可聯(lián)合校準(zhǔn)曲線使用。在其他實施方式中，其中更大量的位置包含超過一個分析物分子和/或超過一個結(jié)合配體，至少部分基于強度讀取的確定法可提供對流體樣品中分析物分子濃度的更精確的量度。這樣的確定法也可連接校準(zhǔn)曲線使用?！ぴ谔囟▽嵤┓绞街?，包含至少一個連接于分析物分子和/或結(jié)合配體的捕獲物的位置的比例(如統(tǒng)計學(xué)顯著比例)低于大約50%、低于大約40%、低于大約25%、低于大約10%、低于大約5%、低于大約1%、低于大約O. 5%、或低于大約O. 1%的含有捕獲物的位置總數(shù)。在這些實施方式中，流體樣品中分析物分子濃度的量度可使用二進制讀取法確定。在一些情況下，不含有連接于分析物分子和/或結(jié)合配體的捕獲物的位置百分比占位置總數(shù)的至少大約20%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約75%、至少大約80%、至少大約90%、或至少大約95%、至少大約99%、至少大約99. 5%、至少大約99. 9%、或更多。盡管下文的討論主要聚焦于二進制讀取系統(tǒng)用于超低水平檢測能力的用途(如，基于對“開”和“關(guān)”的位置的計數(shù))，但這決不是限制性的，本發(fā)明的方法和測定還在特定實施方式中不采用二進制定量操作流程(或在采用其之外)而(還)采用基于對強度測量的方法(即，強度讀取法)(例如以擴大動態(tài)范圍)。如所指出的，在一些情況下，檢測系統(tǒng)和定量法可設(shè)置為使得系統(tǒng)可使用二進制讀取確定法和強度讀取確定法之一或全部，取決于測定的形式和/或流體樣品中分析物分子的濃度。例如，所述方法和/或系統(tǒng)可確定來自第一次測量的基礎(chǔ)參數(shù)并根據(jù)第一次確定法的結(jié)果決定使用二進制讀取確定法或強度讀取確定法，如下文更詳細描述的，其在Rissin等人提交于2010年3月24日的共有美國專利申請序列號 12/731, 136 (題名為“Methods and systems for extending dynamic range inassays for the detection of molecules or particles”)以及 Rissin 等人提交于 2011年3月I日的國際專利申請?zhí)?未確定)(題名為“ Methods and systems for extendingdynamic range in assays for the detection of molecules or particles，，,律師案卷號Q0052. 70013W000)中有所描述，其都通過引用并入本文。根據(jù)一個實施方式，本發(fā)明的定量方法可如下進行。將含有或疑似含有目的分析物分子的流體樣品與大量捕獲物及可選地與一種或多種結(jié)合配體接觸，并將捕獲物在位置如反應(yīng)容器/孔(如前所述)的陣列上分區(qū)。在其中需要二進制讀取法以用于確定的一些實施方式中，在將流體樣品與捕獲物接觸的步驟中，選擇流體樣品和含有捕獲物溶液的相對量/濃度(例如，基于已知的或估計的/疑似的樣品分析物分子的近似濃度范圍)以使流體樣品中分析物分子相對溶液中所提供的捕獲物總數(shù)的比率低于大約1:5、低于大約1:10、低于大約1:12、低于大約1:15、低于大約1:20、低于大約1:50、低于大約1:100、或更低。在這些比率下，統(tǒng)計學(xué)上有至少一些捕獲物會預(yù)期與單個分析物分子連接，且剩下的捕獲物中大多數(shù)不連接任何分析物分子。在這些條件下，連接于多個分析物分子的捕獲物數(shù)量低至可以忽略，這樣，可認為確定包含分析物分子的捕獲物包含單個分析物分子。在這些條件下，可通過任何本文描述的檢測方法，使用為進行二進制讀取定量設(shè)置的分析系統(tǒng)以確定包含連接于分析物分子的捕獲物的位置數(shù)量。然后對包含連接于分析物分子的捕獲物的位置數(shù)量進行計數(shù)(例如，圖1，步驟(D))，包含分析物分子的反應(yīng)容器總數(shù)為2 (例如，反應(yīng)容器12)，在一些情況下，計算含有連接于分析物分子的捕獲物的位置總數(shù)的比例(例如，圖I中，包含捕獲物的反應(yīng)容器總數(shù)為3，反應(yīng)容器12和13 ;因此，包含連接于分析物分子的捕獲物的位置總數(shù)的比例為2:3)。使用O (未檢測到分析物分子)或I (檢測到一個分析物分子)響應(yīng)聯(lián)合使用有大量位置的陣列可使得能通過計數(shù)這些位置上分區(qū)的及包含于這些位置之內(nèi)的樣品的體積中包含的實際分子數(shù)而確定樣品中分析物分子的主要濃度。在一些情況下，分析物分子可間接檢測(如通過計數(shù)含有至少一個標(biāo)記試劑分子的位置數(shù)量完成讀 取，其中標(biāo)記試劑由前體標(biāo)記試劑在接觸分析物分子時轉(zhuǎn)化而來)。在大量位置(例如，至少大約10，000位置)幾乎同時拾取時，包含連接捕獲物的分析物分子的位置對所確定的位置(例如，在一些情況下為含有連接或不連接任何分析物分子的捕獲物的位置)總數(shù)的比率可為至少大約1:100、至少大約1:1000、至少大約1:10,000或更少。使用更大量位置的陣列(例如，至少大約10，000、至少大約50，000、至少大約100，000、至少大約500，000等)可在甚至如此低的比率下提供統(tǒng)計學(xué)顯著的信號。在一些測定中，泊松分布調(diào)整可應(yīng)用于二進制讀取法確定的數(shù)量和/或比率以幫助和/或提高確定流體樣品中分析物分子濃度的精確度。例如，在這樣的實施方式中，其中流體樣品中分析物分子相對接觸流體樣品的捕獲物總數(shù)的比率超過大約1:10、超過大約1:5、超過大約1:4、超過大約1:3、或超過大約1:2、或大約1:10-大約1:2，大約1:5-大約1:2，每個捕獲物上固定化的分析物分子數(shù)量可為零或一，而按照上文段落中描述的方式，有更大的比例含有超過一個。在一些這樣的情況下，濃度確定的效果和精確度可在假設(shè)所有陽性位置只含有單個分析物分子(如上文段落中描述的)下使用泊松分布調(diào)整預(yù)測其中每個捕獲物含有0，1，2，3，4，等分析物分子的位置數(shù)量而提高。泊松分布描述了已知事件的平均數(shù)時一定數(shù)量事件發(fā)生的概率。如果預(yù)期的發(fā)生數(shù)為μ，則精確的次發(fā)生概率(Ρμ (ν)) (V為非負整數(shù)，ν=ο，ι，2，...)可由公式5確定JTi(V) =(公式 5)在本發(fā)明的一些實施方式中，μ等于確定含有連接捕獲物的分析物分子的位置數(shù)量相對所檢測的捕獲物總數(shù)(連接或不連接任何分析物分子)的比例，ν為連接特定數(shù)量分析物分子的捕獲物數(shù)量(例如，連接于0、1、2、3等個分析物分子的捕獲物數(shù)量)。通過在測定中拾取位置的陣列來確定μ，可使用泊松分布調(diào)整確定樣品中分析物分子的濃度。例如，在使用二進制測量模式的測定中，連接1、2、3、4等個分析物分子的捕獲物相互不加區(qū)分(例如，V =1、2、3、4相互無區(qū)別)連接且反應(yīng)孔(例如，位置、反應(yīng)容器)簡單地定性為“開”反應(yīng)孔，則v=0的發(fā)生率可在定義上確定為“關(guān)”孔的數(shù)量。(P μ (O))可根據(jù)公式6計算
權(quán)利要求
1.用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法，包括 將大量各自包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物與含有或疑似含有所述至少一種類型的分析物分子或顆粒的溶液相接觸； 將分析物分子或顆粒固定化于所述大量捕獲物，使得至少一些捕獲物與至少一個分析物分子或顆粒連接，而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物不與任何分析物分子或顆粒連接； 將至少一部分經(jīng)過了固定化步驟的捕獲物在空間上劃分入大量分隔的位置； 指認至少一部分的經(jīng)過空間劃分步驟的所述大量位置并確定含有分析物分子或顆粒的所述位置的數(shù)量；以及 至少部分地基于確定含有分析物分子或顆粒的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。
2.用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法，包括 將大量各自包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物與含有或疑似含有所述至少一種類型的分析物分子或顆粒的溶液相接觸，以形成包含至少一個固定化的分析物分子或顆粒的捕獲物； 將接觸步驟中制備的捕獲物與大量結(jié)合配體相混合，使得至少一些捕獲物連接單個結(jié)合配體而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物不與任何結(jié)合配體連接； 將至少一部分經(jīng)過混合步驟的捕獲物在空間上劃分入大量的位置； 指認至少一部分的經(jīng)過空間劃分步驟的所述大量位置并確定含有結(jié)合配體的位置數(shù)量；以及 至少部分地基于確定含有結(jié)合配體的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。
3.權(quán)利要求I或2的方法，其中連接于至少一個分析物分子和/或結(jié)合配體的捕獲物百分比為捕獲物總數(shù)的低于大約50%、低于大約40%、低于大約30%、低于大約20%、低于大約10%、或低于大約5%、或低于大約1%、或低于大約O. 5%、或低于大約O. 1%。
4.權(quán)利要求I或2的方法，其中不連接任何分析物分子和/或結(jié)合配體的捕獲物百分比為捕獲物總數(shù)的至少大約20%、或至少大約40%、或至少大約50%、或至少大約60%、或至少大約70%、或至少大約75%、或至少大約80%、或至少大約90%、或至少大約95%、或至少大約99%、或至少大約99. 5%、或至少大約99. 9%。
5.權(quán)利要求I或2的方法，其中指認步驟中確定了含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面而不包含分析物分子或顆粒或者結(jié)合配體的捕獲物的所述位置數(shù)量。
6.權(quán)利要求5的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于指認步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的并包含分析物分子或顆?；蛘呓Y(jié)合配體的結(jié)合表面的捕獲物的位置數(shù)量相對指認步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物的位置總數(shù)的比率而確定。
7.權(quán)利要求5的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于指認步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的并包含分析物分子或顆?；蛘呓Y(jié)合配體的結(jié)合表面的捕獲物的位置數(shù)量相對指認步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物但不含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的并包含分析物分子或顆?；蚺潴w的結(jié)合表面的任何捕獲物的位置數(shù)量的比率而確定。
8.權(quán)利要求I或2的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于指認步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的并包含分析物分子或顆?；蛘呓Y(jié)合配體的結(jié)合表面的捕獲物的位置數(shù)量相對指認步驟中所指認的確定不含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物的位置總數(shù)的比率而確定。
9.權(quán)利要求I或2的方法，其中包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的大量捕獲物包括大量微珠。
10.權(quán)利要求I或2的方法，其中大量位置包含大量反應(yīng)容器。
11.權(quán)利要求10的方法,其中大量反應(yīng)容器形成于光纖束末端。
12.權(quán)利要求I的方法，其中至少一部分的分析物分子或顆粒連接于至少一個結(jié)合配體。
13.權(quán)利要求I的方法，其中分析物分子或顆粒包含酶組分。
14.權(quán)利要求2或12的方法，其中結(jié)合配體包含酶組分。
15.權(quán)利要求I或2的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度低于大約50X 1(Γ15Μ、或低于大約40Χ 1(Γ15Μ、或低于大約30Χ 1(Γ15Μ、或低于大約20X 1(Γ15Μ、或低于大約10Χ1(Γ15Μ、或低于大約5Χ1(Γ15Μ、或低于大約1Χ1(Γ15Μ。
16.權(quán)利要求I或2的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地通過比較所測量的參數(shù)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣而確定。
17.權(quán)利要求I的方法，其中在固定化步驟中，至少大約10%、或至少大約20%、或至少大約30%、或至少大約40%、或至少大約50%、或至少大約60%、或至少大約70%、或至少大約80%、或至少大約90%、或至少大約95%的分析物分子或顆粒都固定化于包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物。
18.權(quán)利要求2的方法，其中在混合步驟中，至少大約10%、或至少大約20%、或至少大約30%、或至少大約40%、或至少大約50%、或至少大約60%、或至少大約70%、或至少大約80%、或至少大約90%的固定化的分析物分子或顆粒連接于結(jié)合配體。
19.權(quán)利要求I或2的方法，其中在空間劃分步驟中，將至少大約5%、或至少大約10%、或至少大約20%、或至少大約30%、或至少大約40%、或至少大約50%、或至少大約60%、或至少大約70%、或至少大約80%、或至少大約90%的經(jīng)過固定化步驟的捕獲物在空間上劃分入大量位置。
20.權(quán)利要求10的方法，其中在指認步驟中所指認的反應(yīng)容器數(shù)為反應(yīng)容器總數(shù)的至少大約5%、或至少大約10%、或至少大約20%、或至少大約30%、或至少大約40%、或至少大約50%、或至少大約60%、或至少大約70%、或至少大約80%、或至少大約90%。
21.權(quán)利要求I或2的方法，其中通過將大量位置與包含大量捕獲物的溶液接觸，而對包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的部分捕獲物進行空間劃分。
22.權(quán)利要求2或12的方法，其中在空間劃分步驟后，將所述位置接觸前體標(biāo)記試劑。
23.權(quán)利要求22的方法，其中前體標(biāo)記試劑在接觸結(jié)合配體時轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑。
24.權(quán)利要求23的方法，其中含有包含分析物分子或顆粒或者標(biāo)記試劑的捕獲物的位置數(shù)量是通過確定包含標(biāo)記試劑的位置數(shù)量而確定的。
25.權(quán)利要求23的方法,其中標(biāo)記試劑為發(fā)色、突光或化學(xué)發(fā)光試劑。
26.權(quán)利要求I或2的方法，其中分析物分子或顆粒為蛋白質(zhì)。
27.權(quán)利要求I或2的方法，其中分析物分子或顆粒為核酸。
28.權(quán)利要求10的方法，其中大量反應(yīng)容器是在將至少一部分密封部件和至少一部分基底匹配時形成的。
29.權(quán)利要求10的方法，其中大量反應(yīng)容器形成于平面的基底上。
30.權(quán)利要求10的方法，其中大量反應(yīng)容器的平均體積為大約10阿升-大約100皮升。
31.權(quán)利要求10的方法，其中大量反應(yīng)容器的平均體積為大約I飛升-大約I皮升。
32.權(quán)利要求9的方法，其中大量微珠的平均直徑為大約O.I微米-大約100微米。
33.權(quán)利要求9的方法，其中大量微珠的平均直徑為大約I微米-大約10微米。
34.權(quán)利要求I或2的方法，其進一步包括進行至少一次洗滌步驟。
35.權(quán)利要求10的方法，其進一步包括密封所述大量反應(yīng)容器。
36.權(quán)利要求I或2的方法，其中大量位置是通過光學(xué)技術(shù)指認的。
37.權(quán)利要求I或2的方法，其中結(jié)合表面包含大量捕獲組分。
38.權(quán)利要求I的方法，其中在指認步驟中所指認的確定含有分析物分子或顆粒的位置的百分比為所指認位置總數(shù)的低于大約10%、或低于大約5%、或低于大約1%、或低于大約O. 1%。
39.權(quán)利要求2的方法，其中在指認步驟中所指認的確定含有結(jié)合配體的位置的百分比為所指認位置總數(shù)的低于大約10%、或低于大約5%、或低于大約1%、或低于大約O. 1%。
40.用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法，其包括 提供包含大量位置的基底，這些位置中至少一部分含有微珠，其中存在于基底上的微珠總數(shù)中，包含至少一個分析物分子或顆粒的微珠相對不包含分析物分子或顆粒的微珠的比例為大約8:1_大約1:10，000，000 ； 指認至少一部分的大量位置，其中在指認步驟中所述大量位置中至少兩個至少是部分同時指認的； 在各個指認的位置檢測微珠是否存在，如果存在，檢測所述微珠是否包含任何分析物分子或顆粒；以及 至少部分地通過確定所指認的含有包含至少一個分析物分子或顆粒的微珠的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。
41.用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法，其包括 提供包含大量位置的基底，這些位置中至少一部分含有微珠，其中存在于基底上的微珠總數(shù)中，包含至少一個連接于結(jié)合配體的分析物分子或顆粒的微珠相對不包含連接于結(jié)合配體的分析物分子或顆粒的微珠的比例為大約8:1-大約1:10，000，000 ； 指認至少一部分的大量位置，其中在指認步驟中所述大量位置中至少兩個至少是部分同時指認的；在各個指認的位置檢測微珠是否存在，如果存在，檢測所述微珠是否包含任何連接于結(jié)合配體的分析物分子或顆粒；以及 至少部分地通過確定含有包含至少一個連接于結(jié)合配體的分析物分子或顆粒的微珠的位置數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。
42.權(quán)利要求40或41的方法，其中比率為大約2:1_大約1:1，000，000。
43.權(quán)利要求40或41的方法，其中比率為大約1:10-大約1:100,000。
44.權(quán)利要求40或41的方法，其中比率為大約2:1-大約1:10。
45.權(quán)利要求40或41的方法，其中在指認步驟中，確定了所述的含有微珠但不含任何包含分析物分子或顆粒或者結(jié)合配體的微珠的位置數(shù)量。
46.權(quán)利要求40或41的方法，其中在指認步驟中，確定了所述的含有微珠的位置數(shù)量。
47.權(quán)利要求46的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于在指認步驟中所指認的確定含有包含分析物分子或顆?；蛘呓Y(jié)合配體的微珠的位置數(shù)量相對在指認步驟中所指認的確定含有微珠的位置總數(shù)的比率而確定。
48.權(quán)利要求45的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于在指認步驟中所指認的確定含有包含分析物分子或顆?；蛘呓Y(jié)合配體的微珠的位置數(shù)量相對在指認步驟中所指認的確定含有微珠但不含有任何包含分析物分子或顆粒或者結(jié)合配體的微珠的位置總數(shù)的比率而確定。
49.權(quán)利要求40或41的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于在指認步驟中所指認的確定含有包含分析物分子或顆?；蛘呓Y(jié)合配體的微珠的位置數(shù)量相對所指認的位置總數(shù)的比率而確定。
50.權(quán)利要求40或41的方法，其中所述大量位置包含大量反應(yīng)容器。
51.權(quán)利要求50的方法,其中所述大量反應(yīng)容器形成于光纖束末端。
52.權(quán)利要求3或4的方法，其中包含至少一個微珠的位置的百分比為超過大約50%、或超過大約60%、或超過大約70%、或超過大約80%、或超過大約90%、或超過大約95%。
53.權(quán)利要求40或41的方法，其中分析物分子或顆粒為蛋白質(zhì)或核酸。
54.權(quán)利要求40的方法，其中至少一部分的分析物分子或顆粒連接于至少一個結(jié)合配體。
55.權(quán)利要求41或54的方法，其中結(jié)合配體包含酶組分。
56.權(quán)利要求40或41的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度為低于大約50Χ1(Γ15Μ。
57.權(quán)利要求40或41的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地通過比較所測量的參數(shù)與校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣而確定。
58.權(quán)利要求40或41的方法，其中包含至少一個分析物分子的捕獲物各自包含一個、兩個、三個、四個或五個分析物分子。
59.權(quán)利要求41或54的方法，其中在提供步驟后，將位置與前體標(biāo)記試劑接觸。
60.權(quán)利要求59的方法，其中前體結(jié)合配體在接觸結(jié)合配體時轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑。
61.權(quán)利要求60的方法，其中在指認步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面并含有分析物分子或顆?；蛘邩?biāo)記試劑的捕獲物的位置數(shù)量是通過確定所指認的包含標(biāo)記試劑的位置數(shù)量而確定的。
62.權(quán)利要求59的方法,其中標(biāo)記試劑為發(fā)色、突光或化學(xué)發(fā)光試劑。
63.權(quán)利要求50的方法，其中大量反應(yīng)容器是在將至少一部分密封部件和至少一部分第二種基底匹配時形成的。
64.權(quán)利要求50的方法，其中大量反應(yīng)容器的每個的體積為大約10阿升-大約100皮升。
65.權(quán)利要求40或41的方法，其中微珠的平均直徑為大約O.I微米-大約100微米。
66.權(quán)利要求40或41的方法，其中微珠的平均直徑為大約I微米-大約10微米。
67.權(quán)利要求40或41的方法，其進一步包括進行至少一次洗滌步驟。
68.權(quán)利要求40或41的方法，其中大量位置是使用光學(xué)檢測指認的。
69.權(quán)利要求40或41的方法，其中微珠包含大量捕獲組分。
70.權(quán)利要求50的方法，其中所指認的反應(yīng)容器數(shù)量為反應(yīng)容器總數(shù)的至少大約5%、至少大約10%、至少大約20%、至少大約30%、至少大約40%、至少大約50%、至少大約60%、至少大約70%、至少大約80%、或至少大約90%。
71.物品或試劑盒，其包括 大量具有平均直徑為大約O. I微米-大約100微米的微珠；以及包含大量反應(yīng)容器的基底，其中反應(yīng)容器的平均深度為微珠平均直徑的大約1.0倍-大約I. 5倍，而反應(yīng)容器的平均直徑為微珠平均直徑的大約I. O倍-大約I. 9倍。
72.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中大量微珠的平均直徑為大約I微米-大約10微米。
73.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中大量微珠的平均直徑為大約I微米-大約5微米。
74.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中大量反應(yīng)容器形成于光纖束末端。
75.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中物品進一步包含密封部件。
76.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中大量反應(yīng)容器的平均深度為微珠平均直徑的大約I. I-大約I. 3倍。
77.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中大量反應(yīng)容器的平均直徑為微珠平均直徑的大約I. 3-大約I. 8倍。
78.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中大量反應(yīng)容器的平均體積為大約10阿升-大約100皮升。
79.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中大量反應(yīng)容器的平均體積為大約I飛升-大約I皮升。
80.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中大量微珠包含對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面。
81.權(quán)利要求80的物品或試劑盒，其中結(jié)合表面包含大量捕獲組分。
82.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中基底包含大約1，000-大約1，000,000個反應(yīng)容器。
83.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其中基底包含大約10，000-大約100，000個反應(yīng)容器。
84.權(quán)利要求71的物品或試劑盒，其進一步包含大量對照微珠。
85.用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法，包括 將各自包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的大量捕獲分子與含有或疑似含有所述至少一種類型的分析物分子或顆粒的溶液相接觸，其中至少一些捕獲物變成連接于至少一個分析物分子或顆粒上； 將接觸步驟中制備的大量捕獲物與包含酶組分的大量結(jié)合配體相混合，使得統(tǒng)計學(xué)顯著比例的連接于至少一個分析物分子或顆粒的捕獲物連接單個結(jié)合配體； 將至少一部分經(jīng)歷混合步驟的捕獲物在空間上劃分入大量分隔的位置，以及 至少部分地通過指認至少一部分的經(jīng)過空間劃分步驟的大量位置以確定酶組分或涉及酶組分的反應(yīng)產(chǎn)物的存在情況而確定流體樣品中分析物分子或顆粒濃度的量度。
86.權(quán)利要求85的方法，其中分析物分子或顆粒為蛋白質(zhì)。
87.權(quán)利要求85的方法，其中結(jié)合表面包含大量捕獲組分。
88.權(quán)利要求85的方法，其中涉及酶組分的反應(yīng)包括將酶組分與前體標(biāo)記試劑接觸。
89.權(quán)利要求88的方法，其中前體標(biāo)記試劑在接觸酶組分時轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑。
90.權(quán)利要求89的方法,其中前體標(biāo)記試劑為發(fā)色、突光或化學(xué)發(fā)光試劑。
91.權(quán)利要求85的方法，其中酶組分包含辣根過氧化物酶、β-半乳糖苷酶或堿性磷酸酶。
92.權(quán)利要求85的方法，其中大量位置包含大量反應(yīng)容器。
93.權(quán)利要求92的方法,其中大量反應(yīng)容器形成于光纖束末端。
94.權(quán)利要求85的方法，其進一步包括確定在確定步驟中所指認的確定含有酶組分或涉及酶組分的反應(yīng)產(chǎn)物的位置數(shù)量。
95.權(quán)利要求94的方法，其進一步包括確定在確定步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物但確定不含有酶組分或涉及酶組分的反應(yīng)產(chǎn)物的位置數(shù)量。
96.權(quán)利要求94的方法，其進一步包括確定在確定步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物的位置數(shù)量。
97.權(quán)利要求94的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于在確定步驟中所指認的確定含有酶組分或涉及酶組分的反應(yīng)產(chǎn)物的位置數(shù)量。
98.權(quán)利要求96的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于在確定步驟中所指認的確定含有酶組分或涉及酶組分的反應(yīng)產(chǎn)物的位置數(shù)量相對在確定步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物的位置數(shù)量的比率。
99.權(quán)利要求95的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于在確定步驟中所指認的確定含有酶組分或涉及酶組分的反應(yīng)產(chǎn)物的位置數(shù)量相對在確定步驟中所指認的確定含有包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面的捕獲物但確定不含有酶組分或涉及酶組分的反應(yīng)產(chǎn)物的位置數(shù)量的比率。
100.權(quán)利要求94的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地基于在確定步驟中所指認的確定含有酶組分或涉及酶組分的反應(yīng)產(chǎn)物的位置數(shù)量相對所指認的位置總數(shù)的比率。
101.權(quán)利要求85的方法，其中位置是光學(xué)指認的。
102.用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法，包括 將大量分析物分子或顆粒固定化于大量微珠； 將所述大量微珠的至少一部分在空間上劃分入大量分隔的位置； 指認所述大量位置中至少一些并確定含有微珠的位置數(shù)量； 進一步確定含有微珠及分析物分子或顆粒的所述位置數(shù)量；以及至少部分地基于含有微珠及分析物分子和顆粒的位置數(shù)量相對含有微珠的位置數(shù)量的比率而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。
103.用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法，包括 將大量分析物分子或顆粒固定化于大量微珠； 將所述大量微珠的至少一部分在空間上劃分入大量分隔的位置； 指認所述大量位置中至少一些并確定含有微珠的位置數(shù)量； 進一步確定含有微珠及分析物分子或顆粒的所述位置數(shù)量；以及至少部分地基于含有微珠及分析物分子和顆粒的位置數(shù)量相對含有微珠但不含任何分析物分子或顆粒的位置數(shù)量的比率而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。
104.權(quán)利要求102或103的方法，其中所述含有微珠的位置數(shù)量是使用光學(xué)技術(shù)確定的。
105.權(quán)利要求104的方法，其中所述含有微珠的位置數(shù)量是使用白光確定的。
106.權(quán)利要求104的方法，其中所述含有微珠及分析物分子或顆粒的位置數(shù)量是使用熒光確定的。
107.權(quán)利要求104的方法，其中光學(xué)技術(shù)包括使用CXD檢測器。
108.權(quán)利要求104的方法，其中光學(xué)技術(shù)包括使用CID、CMOS、sCMOS、或TDI設(shè)備。
109.權(quán)利要求102或103的方法，其中大量位置包含大量反應(yīng)容器。
110.權(quán)利要求109的方法,其中大量反應(yīng)容器形成于光纖束末端。
111.權(quán)利要求102或103的方法，其中至少一部分的分析物分子或顆粒連接于至少一個結(jié)合配體。
112.權(quán)利要求102或103的方法，其中分析物分子或顆粒包含酶組分。
113.權(quán)利要求112的方法，其中結(jié)合配體包含酶組分。
114.權(quán)利要求102或103的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度低于大約50X 1(Γ15Μ、或低于大約40Χ 1(Γ15Μ、或低于大約30Χ 1(Γ15Μ、或低于大約20X 1(Γ15Μ、或低于大約10Χ1(Γ15Μ、或低于大約I X IO^15M0
115.權(quán)利要求102或103的方法，其中確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地通過比較所測量的參數(shù)和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣而確定。
116.權(quán)利要求102或103的方法，其中在空間劃分步驟中，將至少大約5%、或至少大約10%、或至少大約20%、或至少大約30%、或至少大約40%、或至少大約50%、或至少大約60%、或至少大約70%、或至少大約80%、或至少大約90%的經(jīng)過固定化步驟的捕獲物在空間上劃分入大量位置。
117.權(quán)利要求102或103的方法，其中在指認步驟中所指認的位置數(shù)量為位置總數(shù)的至少大約5%、或至少大約10%、或至少大約20%、或至少大約30%、或至少大約40%、或至少大約50%、或至少大約60%、或至少大約70%、或至少大約80%、或至少大約90%。
118.權(quán)利要求102或103的方法，其中大量微珠各自包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面。
119.權(quán)利要求102或103的方法，其中在空間劃分步驟后，將所述位置與前體標(biāo)記試劑相接觸。
120.權(quán)利要求119的方法，其中前體結(jié)合配體在接觸結(jié)合配體時轉(zhuǎn)化為標(biāo)記試劑。
121.權(quán)利要求120的方法，其中含有包含分析物分子或顆?；蛘邩?biāo)記試劑的捕獲物的位置數(shù)量是通過確定包含標(biāo)記試劑的位置數(shù)量而確定的。
122.權(quán)利要求120的方法,其中標(biāo)記試劑為發(fā)色、突光或化學(xué)發(fā)光試劑。
123.權(quán)利要求102或103的方法，其中分析物分子或顆粒為蛋白質(zhì)。
124.權(quán)利要求102或103的方法，其中分析物分子或顆粒為核酸。
125.權(quán)利要求109的方法，其中大量反應(yīng)容器的平均體積為大約10阿升-大約100皮升。
126.權(quán)利要求109的方法，其中大量反應(yīng)容器的平均體積為大約I飛升-大約I皮升。
127.權(quán)利要求102或103的方法，其中大量微珠的平均直徑為大約O.I微米-大約100微米。
128.權(quán)利要求102或103的方法，其中大量微珠的平均直徑為大約I微米-大約10微米。
129.權(quán)利要求102或103的方法，其進一步包括進行至少一次洗滌步驟。
130.權(quán)利要求109的方法，其進一步包括密封所述大量反應(yīng)容器。
131.用于確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度的方法，包括 提供各自連接于單個分析物分子或顆?；蛘卟贿B接任何分析物分子或顆粒的大量捕獲物； 單個地指認至少一部分的捕獲物并確定連接于分析物分子或顆粒的所述捕獲物數(shù)量；以及 至少部分地基于經(jīng)過指認步驟確定連接于分析物分子或顆粒的捕獲物的數(shù)量而確定流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度。
132.權(quán)利要求131的方法，其中捕獲物各自包括對至少一種類型的分析物分子或顆粒具有親和力的結(jié)合表面，且形成步驟包括將大量捕獲物與含有或疑似含有所述至少一種類型的分析物分子或顆粒的溶液接觸。
133.權(quán)利要求132的方法，其包括將分析物分子或顆粒固定化于大量捕獲物的步驟，以使統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物連接于單個分析物分子或顆粒而統(tǒng)計學(xué)顯著比例的捕獲物不連接任何分析物分子或顆粒。
134.權(quán)利要求133的方法，其包括從剩下的所述捕獲物的部分中單個分離至少一部分的經(jīng)過固定化步驟的捕獲物的步驟。
135.權(quán)利要求134的方法，其中捕獲物包含在至少指認步驟中液滴重懸其中的流體中不相混的液滴或各自包含在所述液滴之內(nèi)。
136.權(quán)利要求131的方法，其中至少一部分的分析物分子或顆粒連接于至少一種結(jié)合配體。
137.權(quán)利要求131的方法，其中分析物分子或顆粒包含酶組分。
138.權(quán)利要求136的方法，其中結(jié)合配體包含酶組分。
139.權(quán)利要求131的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度低于大約50X 1(Γ15Μ、或低于大約40Χ 1(Γ15Μ、或低于大約30Χ 1(Γ15Μ、或低于大約20X 1(Γ15Μ、或低于大約10Χ1(Γ15Μ、或低于大約5Χ1(Γ15Μ、或低于大約1Χ1(Γ15Μ.
140.權(quán)利要求131的方法，其中流體樣品中分析物分子或顆粒的濃度的量度至少部分地通過比較所測量的參數(shù)和校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)樣而確定。
141.權(quán)利要求131的方法，其中所述大量位置是使用光學(xué)技術(shù)指認的。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于檢測在流體樣品中分析物分子或顆粒，以及在一些情況下確定所述流體樣品中分子或顆粒的濃度的量度的系統(tǒng)和方法。本發(fā)明的方法可包括將大量分析物分子或顆粒固定化于大量捕獲物上。將至少一部分的所述大量捕獲物在空間上劃分入大量位置。流體樣品中分析物分子濃度的量度至少部分地基于包含固定化于捕獲物的分析物分子的反應(yīng)容器數(shù)而確定。在一些情況下，所述測定可另外包括包含結(jié)合配體、前體標(biāo)記試劑和/或酶組分的步驟。
文檔編號G01N33/543GK102884431SQ201180019462
公開日2013年1月16日 申請日期2011年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月1日
發(fā)明者D·C·達菲, D·M·里辛, D·R·沃爾特, D·福尼埃, C·坎 申請人:匡特里克斯公司